瘦猪品种长白猪港粪便产甲烷菌在多样性和密度高于肥胖品种Erhualian猪

文摘

Erhualian粪便产甲烷菌的多样性(肥胖类型)、长白猪(精益类型)猪是用单独的16 s rRNA基因检查库为每个品种。共有763个克隆进行了分析;从Erhualian图书馆381年和382年从长白猪图书馆属于属Methanobrevibacter被确定。其他人则属于属Methanosphaera识别。多样性的两个库显示显著差异()和组成()。只有两个操作分类单元(辣子鸡)被发现在这两个库,而六个辣子鸡、只在Erhualian图书馆发现23个辣子鸡被发现只有在长白猪图书馆。实时PCR显示大量的粪便产甲烷菌在长白猪猪显著高于Erhualian猪()。结果表明,长白猪猪(精益)存在一个更大的多样性和更高的产烷生物的数量mcrA基因复制比Erhualian猪(肥胖)。这些差异可能与肥胖或瘦这两个猪品种。结果为进一步提供新线索调查猪的脂肪存储,甚至人类。

1。介绍

产甲烷古菌广泛存在于胃肠道(GI)的许多脊椎动物和无脊椎动物(包括人类1- - - - - -3]。产甲烷菌可以使用氢和其他产品如甲酸、甲醇,醋酸减少二氧化碳甲烷。甲烷的形成不仅导致全球变暖的温室气体,但也代表了一个动物的能量损失。

猪估计通常失去摄入能量的1.2%是由于甲烷形成(4]。此外,一个无菌小鼠模型所示,产甲烷菌发挥重要作用在能量代谢和脂肪沉积通过re-colonization或co-colonization人类粪便分离Methanobrevibacter smithii和叫多形拟杆菌胃肠道的老鼠(5,6]。进一步的研究在人类身上显示的多样性黑带大师。smithii浓度在精益厌食症患者高于人口(7]。也报告说,肥胖个体的胃肠道微生物群是耗尽黑带大师。smithii(8]。

古生菌在人胃肠道占订单的主要成员Methanobacteriales,这是H₂氧化产甲烷菌。有趣的是,H的数量₂利用产甲烷菌在肥胖个体显著高于在精益或postgastric-bypass个人(9]。这些报告可能显示一些关系成分和丰富的消化道产甲烷的社区,和主人的能量代谢,随后与肥胖或瘦的主机。

猪与人类分享高相似度的解剖学、生理学和新陈代谢的消化系统10]。因此,胃肠道微生物群的构成的肥胖和苗条的猪可能反映了相应的人类表型。Erhualian猪和长白猪品种通常肥胖和苗条(11- - - - - -14分别),因此其能量代谢可能是独特的。Erhualian猪,妹妹一代梅山(都属于太湖猪),是一个地方猪品种主要坐落在太湖之滨的中国,特点是增加脂肪存储,美味的肉质量和高生育率(15]。相比之下,长白猪是一个“外星人”品种,通常用作陛下商业育种的猪肉生产品种的高增长率和瘦肉比例。根据先前的研究上面所描述的那样,两个品种之间的区别可能是部分由不同的肠道微生物群。最近,人们已经发现,肥胖梅山猪显示增加的相对丰度厚壁菌门和较低的数量拟杆菌门(16),与几个来自人类如上所述的报道。尽管肥胖和苗条的猪之间的多样性和丰富的细菌已被证明改变(12,16),没有证据已被证明对于两者之间的肠道产甲烷菌表型的变化。考虑到肠道产甲烷菌的关键作用在微生物发酵,我们假设这两个品种有不同的成分和密度消化道产甲烷菌。

因此,本研究调查了产甲烷菌的系统发育多样性和群落结构Erhualian粪便(肥胖)和长白猪(精益)通过分析16 s rRNA猪从两个克隆基因序列库,每个品种一个。此外,产甲烷菌的密度被实时PCR目标量化mcrA基因。这里显示的结果可以提供新线索对胃肠道的作用的理解和控制微生物群猪的脂肪存储和潜在的人类。

2。材料和方法

2.1。样品来源和处理

所有Erhualian猪和长白猪是江苏省商业农场提出使用相同的饲料和在相同的环境条件下。仔猪断奶出生后45天。粪便样本3乳儿(40 d)小猪,4断奶(50 d)猪、4 (70 d)猪、增长和4母猪Erhualian品种(11至12个月),和4哺乳仔猪,3断奶猪、3生长猪,和4收集长白猪品种的母猪。动物被随机选择从不同的窝。大约10 g每头猪的粪便收集到消毒15毫升离心管和存储−20°C,直到进一步的处理。

2.2。DNA提取、PCR扩增,克隆图书馆建设

核酸从0.5克粪便中提取,基于bead-beating方法描述Zoetendal et al。17]。提取的DNA纯化PCR清理系统(美国Promega)和存储在−20°C。

引物Met86F和Met1340R放大热点16 s rRNA基因(18]。变性的放大是在94°C 3分钟,然后紧接着40 94°C的周期30年代,58°C 30年代,90年代的72°C,最终在72°C扩展了10分钟。PCR反应混合物(50每个引物的L)由200海里,大约0.35克的模板DNA, 1×Taq反应缓冲区,200每个核苷酸的M, MgCl 2毫米₂和四个单位TaqDNA聚合酶。产品是使用PCR清理净化系统(美国Promega)。

构建16 s rRNA基因克隆库,相同数量的纯化PCR产品来自同一品种的动物(例如、Erhualian长白猪)汇集。汇集的克隆扩增子大肠杆菌全球使用pGEM-T简单向量(美国Promega)和转化株的筛选利用RFLP分析基因克隆16 s rRNA的限制内切酶消化有三世,运算器我和下丘脑-垂体-肾上腺轴的二世,是前面描述的(19]。克隆与相同的RFLP模式被定义为一个phylotype。一个代表从每个RFLP图案克隆测序在两个方向上商业(表达载体,中国)。

2.3。古细菌多样性和系统发育分析的估计

基于了解序列标识标准的98%20.],MOTHUR [21)是用于分配序列的两个库操作分类单元(辣子鸡)。作为MOTHUR套件的程序的一部分,香农多样性指数用于分析和Libshuff分析被用来比较两个库之间的人口结构。每个库的抽样工作了解辣子鸡是评估通过计算覆盖率(根据方程),在那里是辣子鸡的数量由一个克隆和是克隆的数量分析在图书馆(22]。基因库的爆炸计划(23)被用来自动识别最近的有效描述每个产烷生物序列的邻居。最后,neighbor-joining使用系统发育树构建PHYLIP软件(版本3.69)与1000引导重采样24]。

2.4。总粪便产甲烷菌的量化每个品种的实时PCR

粪便产甲烷菌的丰度是决定使用一个应用生物系统公司与实时PCR 7300 ht实时PCR系统(应用生物系统公司、钙、美国)。引物对mcrA基因(25)被用于特定的产甲烷古菌检测。DNA样本提取粪便样本中每个品种(共15 Erhualian猪和长白猪猪14日)如上所述用于实时PCR扩增mcrA基因。纯培养的细胞的DNAMethanobrevibacter smithii由CSIRO畜牧业(澳大利亚布里斯班)也与基因组DNA提取净化设备(美国Promega)。上面的DNA样本的浓度从粪便中提取材料,或从纯培养的细胞,测定在一式三份NanoDrop nd - 1000紫外分光光度计(美国NanoDrop技术)和平均值计算。连续稀释的DNA提取Methanobrevibacter smithii细胞被用来生成一个标准曲线。反应混合物(10L)由5L智商SYBR绿色Supermix(罗氏、巴塞尔、瑞士),0.5每个引物(10 L米),1(100 ng / L的模板DNAμL)。PCR进行初始变性步骤2分钟的94°C,紧随其后的是30 94°C的周期30年代,60°C 15和68°C为1分钟。

总粪便产甲烷菌的丰度差异Erhualian猪和长白猪和一个抽样检测的意义使用统计软件SPSS 16.0以及方法。差异被认为是重要的时候。

2.5。加入核苷酸序列和数字

Phylotypes被使用前缀指定LGM(胃肠道微生物实验室)紧随其后的“嗯”或“拉”来表示两个猪品种,Erhualian长白猪,分别;显示独特的phylotype(例如,从Erhualian猪品种LGM-Er7 phylotype 7)。

核苷酸序列报告摘要已经存入基因库数据库下加入数字。HM573393 HM573406 (Erhualian)和HM573407 HM573449(长白猪)。

3所示。结果

3.1。的密度总mcrA基因复制两品种猪的粪便

定量实时PCR显示的数量mcrA基因复制长白猪猪的粪便(Log10 (mcrA基因复制每克湿重)明显高于Erhualian猪(,)。

3.2。序列分析的两个热点16 s rRNA基因克隆库

共有381个克隆子古16 s rRNA基因扩增子,从粪便样本Erhualian猪在不同的生命阶段,进行了分析。检查这些克隆的序列揭示了八个不同的辣子鸡(表1)。大多数的序列(368/381)最密切相关成员属于属Methanobrevibacter与序列的身份从96.9%到99.9%不等。一百四十一序列(37%)被分配给OTU11(表2)和相关Methanobrevibacter gottschalkii和Methanobrevibacter millerae,而111序列(29%)被分配给OTU13和相关Methanobrevibacter smithii(表2)。克隆LGM-Er7 (OTU2)是远亲Methanobrevibacter millerae有96.9%的身份,但有97.7%的身份无特征Methanobrevibacter克隆的前肠Tammar小袋鼠(26]。LGM-Er8 (OTU3)有关Methanobrevibacter ruminantium身份(97.1%),但有99.8%的身份从coculture克隆与厌氧真菌(Cheng et al .,未发表的数据)。只有克隆LGM-Er4 (OTU1)是远亲Methanosphaera cuniculi(96.3%的身份)。辣子鸡1、2、3、4、5、6独有Erhualian库(表1和2;图1)。

长白猪猪的16 s rRNA基因文库是由共有382个克隆,25个辣子鸡(表组成1)。相关序列(227/382)大多是属于属的成员Methanobrevibacter与序列的身份从93.9%到99.5%不等。八十九序列(23%)被分配给OTU13和相关Methanobrevibacter smithii,而81序列(21%)被分配给OTU20和相关Methanosphaera cuniculi(表1和2)。LGM-La2 (OTU20) LGM-La23 (OTU20)和LGM-La38 (OTU26)显示,97.6%,97.4%,97.4%的身份Methanosphaera cuniculi分别,但更高(99.8%,99.6%,和99.1%)序列的身份从猪的粪便(但一个个克隆27]。虽然LGM-La3 (OTU7)有95.3%的身份Methanobrevibacter millerae它有97%的身份不明的克隆黑白花牛和泽西奶牛在美国28]。LGM-La29 (OTU19)显示,97.1%Methanosphaera stadtmanae和有97.4%的序列从山羊瘤胃(裴未公开的数据)。LGM-La33 (OTU21)是远亲Methanosphaera cuniculi身份为95.5%,但有97.1%的身份从猪的粪便(克隆27]。LGM-La40 96.8%被发现身份有关Methanobrevibacter smithii,但克隆(OTU28) 98.2%的身份从挪威的瘤胃驯鹿(29日]。LGM-La1 (OTU17) LGM-La27 (OTU18) LGM-La35 (OTU23)和LGM-La11 (OTU17)有关Methanobrevibacter smithii和Methanosphaera cuniculi93.8% - -94.9%的身份,但有95.7% - -96.8%的身份从哺乳期克隆奶牛在加拿大30.]。LGM-La21 (OTU15) LGM-La36 (OTU24)和LGM-La37 (OTU25)有关Methanosphaera cuniculi94.2% - -95.5%的身份,但有95.3% - -96.8%的身份从猪的粪便(克隆27]。LGM-La12 (OTU8)和LGM-La14 (OTU10)身份,93.9%和95.1%,分别Methanobrevibacter smithii和Methanosphaera cuniculi,但只有96.0%和96.9%的身份克隆的作物Opisthocomus hoazin从委内瑞拉,folivorous鸟20.]。LGM-La4 (OTU16)和LGM-La22 (OTU16)显示,95.5%和95.7%的身份有关Methanosphaera stadtmanae,但有96.8%和96.9%的身份从济南克隆牲畜(裴et al .,未发表的数据)。LGM-La42 (OTU30)和LGM-La43 (OTU31)是远亲Methanosphaera cuniculi和Methanobrevibacter smithii分别有95.3%的身份,但只有96.3%和96.2%最近邻,克隆的黑白花牛和泽西奶牛28]。重要的是要注意,辣子鸡、除了OTU11 OTU13只有这个库(表中找到1,图1)。

4所示。讨论

坊间证据从数量有限的先前的研究表明,产甲烷菌后肠的单胃的动物可能发挥重要作用在宿主的能量代谢和脂肪沉积所揭示的接种来自人体的产甲烷菌进入无菌小鼠模型(5]。然而,由于其特殊的生长环境和复杂的syntrophic交互与其他肠道细菌,文化相关的方法对产甲烷菌在肠道提供有限的信息。许多研究使用文化无关的方法包括16 s rRNA基因克隆库分析、报告数据产烷生物多样性和丰富在瘤胃19,25,31日,32]。然而,很少的信息可以在产甲烷古菌的多样性和丰富单胃的动物包括人类和猪的肠道。本研究使用Erhualian猪和长白猪作为肥胖和苗条主机表型和代理模型提供了第一个账户比较粪便产烷生物多样性和丰富的宿主物种与肥胖或瘦表型。收集粪便样本从每个品种猪在四个不同的年龄使结果更具有代表性,因为它将覆盖整个成长阶段的每一个品种。

实时PCR结果表明长白猪猪得多mcrA基因复制比Erhualian猪(),这意味着有更多的产甲烷菌数量窝藏Landarce后肠的猪。此外,长白猪猪表现出更多的产烷生物多样性(比Erhualian猪(表)3)。Libshuff分析还表明,两库之间的群落结构差异显著()。克隆库OTU保险估计在100%和99.2% Erhualian猪和长白猪,分别(表3)。这表明长白猪猪,这是公认的提高瘦肉比例和降低身体脂肪量与Erhualian猪相比,存在更多的结肠产甲烷菌(密度和多样性)。产甲烷菌能产生甲烷等基质的H₂和有限公司₂甲酸,也可以用于丙酸和乙酸的形成。反刍动物,人们普遍建立,甲烷的形成导致的能量损失可用于主机(33,34]。因此,一个高度密集的和多样化的产烷生物社区在粪便样本可能还建议一个能量损失,这可能因此影响能量代谢和身体脂肪的形成。也是可能的,尽管甲烷形成可能代表一小部分能量猪增长,它可能会影响代谢途径网络,从而影响能量代谢。

总共763个克隆研究的两个16 s rRNA基因克隆库,揭示53 phylotypes分配给31个辣子鸡(表1)。辣子鸡11和13是唯一辣子鸡猪品种(表中发现2),占66%和24%的克隆Erhualian猪和长白猪,分别。有趣的是,克隆属于OTU11高出35倍比Landarce Erhualian图书馆图书馆。辣子鸡11和13的总和为70%的辣子鸡Erhualian图书馆,但只有36%的辣子鸡长白猪库(表2)。

辣子鸡两库之间的比较(表2)表明,Methanobrevibacter例如序列(96.6%)占主导地位的粪便Erhualian猪,而长白猪猪的比例是56.5%。此外,Methanosphaera例如序列在长白猪Erhualian占3.4%和43.5%。这与先前的发现是一致的Methanobrevibacter后肠的物种主要产烷生物单胃的动物(27,35- - - - - -42)或绵羊瘤胃的(31日,43- - - - - -45)、牛(45- - - - - -48]以及一些栽培研究[49]。然而,羊和牛瘤胃的,最主要的产甲烷菌属于属Methanobrevibacter和的密度Methanosphaera例如物种比的少得多Methanobrevibacter例如物种(45,46]。在西澳大利亚的绵羊瘤胃,Methanosphaera stadtmanae只有在少数的羊(31日]。在我们之前的研究中,的比例Methanosphaera stadtmanae16 s rRNA序列是非常小的杜洛克猪×长白猪×约克夏猪的粪便(27]。然而,在目前的研究中,长白猪猪10倍Methanosphaera——比Erhualian猪,产甲烷菌Methanosphaera例如物种背后的第二个主要产甲烷菌Methanobrevibacter在猪的粪便品种。

我们的库也包含一些身份不明的euryarchaeotic序列。十四辣子鸡(LGM-La1和11、3、4,22日,12日,14日,21日,27日,33岁,35岁,36岁,37岁,42岁的43和LGM-Er4)最可能代表未知产甲烷物种和品种(表1)。有趣的是,在之前的研究中我们发现数量有关Aciduliprofundum boonei和热原体属acidophilum在场,除了Methanobrevibacter和Methanosphaera人口,杜洛克猪的粪便×长白猪×约克夏猪(27]。产甲烷菌相关Thermoplasmatales进化枝也发现在某些反刍动物(19,32,46,50),而在当前的研究中,大多数序列相关的两个属Methanobrevibacter和Methanosphaera。这表明可能有不同的肠道产甲烷菌的多样性之间的纯粹的品种和混合动力车,和不同品种的杂交可能引入的某些变更产甲烷多样性进入小肠。

5。结论

目前的研究提供了第一个账户中的产甲烷菌的丰度和系统发育多样性Erhualian(肥胖)和长白猪(精益)猪排泄物基于16 s rRNA基因克隆库分析。长白猪猪有产甲烷菌的密度明显高于Erhualian猪()。产甲烷菌的多样性长白猪的猪也显著高于Erhualian动物(),Methanobrevibacter最主要在这两个品种,属Methanosphaera第二个最主要产烷生物在长白猪猪。这些产甲烷菌在猪肠道的功能角色,以及观察产烷生物的多样性和密度的差异是否与猪脂肪和能量代谢有关,需要进一步调查。

确认

这项工作是由中国自然科学基金会(国家自然科学基金委)(30810103909),R & D特殊公益基金在中国农业(200903003),通过欧盟和欧盟第七框架项目“相互作用”(项目号227549)。作者感谢CSIRO畜牧业(澳大利亚)的供应Methanobrevibacter smithii细胞。

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