第三主题由乙酰辅酶a合成酶催化的作用

文摘

acyl-adenylate-forming酶总科,由酰基- aryl-CoA合成酶、腺苷酸域nonribosomal肽合成酶的荧光素酶,有三个标志性图案(》)和10个守恒的核心主题(A1-A10),其中一些重叠签名主题。签名的共识序列图案III(核心主题A7)乙酰辅酶a合成酶是Y-X-S / T / A-G-D,不变的第五的位置,高度保守的第一和第四个位置,变量第二和第三的位置。动能酶变异的研究显示,一个在任何位置变更导致强烈的催化速率下降,尽管最有害的影响也观察到当第一个第五的位置发生了变化。结构建模表明,高度保守的酪氨酸在第一位置在活性位点结构中扮演着重要角色与一个高度保守的活性部位Gln,和不变的Asp在第五的位置在ATP绑定中起着至关重要的作用,通过与催化2′,3′-哦组核糖的一部分。这些Asp和ATP是观察之间的相互作用在所有可用结构总科的成员,一致的一个关键的角色在衬底绑定和催化不变的残渣。

1。介绍

EC 6.2.1.1 AMP-forming乙酰辅酶a合成酶(Acs),从乙酸催化乙酰辅酶a的形成,ATP和CoASH(乙酸+ ATP + CoASH乙酰辅酶a +音箱+ PP_我),属于acyl-adenylate-forming酶总科,新被指定的活动(1]随着退火总科的腺苷酸酶反映了三个亚科,酰基和aryl-CoA合成酶、腺苷酸域nonribosomal肽合成酶,和荧光素酶。尽管遥远这个总科的成员催化完全无关的反应和使用不同的基质,它们共享属性的生成一个enzyme-bound acyl-adenylate中间在第一步通过激活与ATP并发焦磷酸盐的释放。

序列比对的这个总科的成员透露的存在三个签名主题所定义的Chang et al。2]:主题我:T(S / G) -年代[G] - [G] - (S / T)T(S / E) -G[S] - [X]P[M] - [K]G(L / F),主题2:Y(L / W / F) -G(S / M / W) - x -T(一)-E,主题三:Y(F / L)R(T / K / X) -T(S / V /) -G- - - - - -D,

(粗体的残留物主要残留在每个位置,和替代残留在括号表示。)

Marahiel et al。3)进一步确定十守恒的核心主题总科,A3, A5,和A7图案重叠或包含主题我,II, III,分别。所有这三个主题位于或接近每一个酶的活性部位。图案I和II已被证明腺苷酸的形成中扮演的角色基于证据从酶改变位置在这些图案(2,4- - - - - -13]。然而,主题三世不那么保守,接受更少的关注。

在这里,我们调查了第三主题在乙酰辅酶a合成酶的作用(Acs)Methanothermobacter thermautotrophicusAcs1 (Acs1_太)。这个重组酶曾经为特征,显示了醋酸的强烈偏好酰基衬底和ATP三磷酸核苷酸(4,14),最典型的Acs的酶。我们的研究结果表明第三主题的一个重要的角色在任何位置的变更导致催化降低流动率。的高度保守的酪氨酸在第一位置可能发挥关键作用在活性位点结构与一个高度保守的活性部位Gln。不变的Asp在第五的位置上扮演关键角色在ATP绑定和催化与2′,3′-哦ATP的核糖基组。残留在Acs的角色是环境中进行进一步的讨论在总科的其他成员的作用。

2。实验程序

2.1。材料

化学物质从VWR科学购买产品,费舍尔科学、或σ的化学物质。DNA寡核苷酸定点诱变是购买的集成技术。ird解码器- 700和- 800标记寡核苷酸的DNA测序买来Li-Cor生物科学或MWG生物技术。

2.2。序列比对

序列比对进行使用Clustal X [15]Gonnet PAM 250权重矩阵和10.0和0.05的缺省参数打开和差距的差距扩展处罚,分别。

2.3。定点诱变

基因编码的定点诱变m . thermautotrophicus使用QuikChange Acs1进行定点诱变工具包(Stratagene)。致突变的引物是大约40个核苷酸,改变网站位于中心。突变经双向使用热Sequenase DNA测序引物循环测序工具包(通用电气医疗集团)核酸设施克莱姆森大学。

2.4。Acs1不等的生产和净化_太变体

一成不变的Acs1_太及其生产的变体是不等的大肠杆菌罗塞塔蓝色(DE3) (Novagen)如前所述4,14]。细胞窝藏Acs1_太表达式构造在37°C的一个发展_600年~ 0.6,被添加IPTG诱导酶生产最后一个0.5毫米的浓度。细胞生长在环境温度持续一夜之间,然后细胞收获。Acs1_太和变异酶纯化了一个两步过程采用Q-sepharose阴离子交换和苯基琼脂糖疏水作用色谱(如前所述)(4,14]。额外的源问阴离子交换色谱步骤添加如果变异酶前两个步骤后不够纯粹。纯化酶的透析和集中,整除储存在−20°C。蛋白质含量是由布拉德福德法(16]。

2.5。分子质量测定酶变异

变体受到凝胶过滤色谱法确定亚基组成。Superose 12凝胶过滤柱(通用电气医疗集团),与50 mM preequilibrated三羟甲基氨基甲烷(pH值7.5)包含150毫米氯化钾,液与胰凝乳蛋白酶原校准(kDa 25日),卵清蛋白(43 kDa)、白蛋白(67 kDa)醛缩酶(158 kDa),过氧化氢酶(232 kDa),铁蛋白(440 kDa),和蓝色葡聚糖(2000 kDa)。

2.6。酶反应对ACS的活动

酶活性是由hydroxamate试验,监测形成激活酰基乙酰辅酶a产品等组织的ACS反应(17,18]。标准反应包含100毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值7.5)液,600毫米hydroxylamine-HCl (pH值7.0),和2毫米谷胱甘肽(简化型)除了三个基板(醋酸HSCoA、MgATP)在300年μL反应体积。在所有情况下,镁的浓度^{2 +}对ATP是一样的。反应是在Acs1的最佳温度_太65°C (4,14添加两卷),终止的停止解决方案(1 N HCl, 5%三氯乙酸,FeCl 1.25%₃),颜色变化是通过测量吸光度的变化在540海里。

表观动力学参数的确定,一个底物不同,和其他两个基板举行饱和浓度,一般十倍价值。变量底物的浓度范围从0.2 ~ 5 - 10倍价值。明显的动力学参数和/运用非线性回归确定Michaelis-Menten方程符合实验数据。每个动态测定代表三个复制,和标准错误。所有基质酶变异之后Michaelis-Menten动力学。

2.7。抑制化验

抑制野生型Acs1_太通过腺苷酸及其衍生物和核糖使用hydroxamate试验确定。在这些分析中,所有三个基板举行了在饱和水平,和核糖或腺苷是添加到反应混合物最终浓度范围从0到1000 mM或0到100毫米,分别。的值为每个抑制剂是由互惠的速度与抑制剂的浓度。

2.8。建模主题三世Acs1的残留物_太

Acs1的结构_太和变异是模仿美国血清Acs (PDB ID: 2 p2f) (19)和酿酒酵母Acs1结构(PDB ID: 1 ry2) (20.通过DS Modeler (Accelrys)使用默认参数。结构相比美国血清和酿酒酵母Acs的结构,以确保建模不介绍主要的结构性改变。

3所示。结果与讨论

序列比对表明Acs序列相当保护的第三主题,第一,第四,和第五的位置高度或完全守恒的,但第二个和第三个位置显示一个更高层次的变化和整体的共识Y-X-S / T / A-G-D(表1)。Acs的对齐的其他成员adenylate-forming总科证实这些职位(表中高度保守的1)。的酿酒酵母ACS1结构(Acs_Sc;PDB 1 ry2)包含AMP (20.],构象认为催化Acs的第一步反应,乙酸和ATP注定和enzyme-bound乙酰基与相伴释放无机焦磷酸腺苷酸形成。的沙门氏菌血清Acs结构(Acs_Se;PDB 2 p2f) (19)包含醋酸、AMP和辅酶a [8),被认为是第二步的构象的催化反应中,c端域的活性部位附近的重新定位来给环境带来新的残留CoA绑定和乙酰辅酶a产品的形成与释放AMP (8,19,20.]。

Acs的检验_Se和Acs_Sc活性位点结构地方第三主题,无论酶的构象。腺苷酸附近的定位主题三世残留一部分绑定AMP的配体表明残留在这个主题可能发挥作用在ATP绑定和/或催化。建模的Acs1_太在美国血清和酿酒酵母Acs结构将主题三世残留在类似的位置与基质(图1)。

在Acs1_太第三,主题序列^498年YTAGD^502年。我们单独改变每个主题的位置Acs1三世_太并确定纯化酶的动力学参数变异。的残留高度保守的第一,第四、第五的位置改变了阿拉巴马州或一个保守的氨基酸替换。用力推残留在更多的变量的第二个位置是改变了阿拉巴马州,阿拉巴马州和残留在第三位置改变了刺,这是许多Acs序列中的残留。纯化酶的动力学参数变异测定使用hydroxamate化验和如表所示2。

hydroxamate试验措施激活酰基团体包括acetyl-AMP和乙酰辅酶a的转换的酰基hydroxamate随后铁hydroxamate复杂。威尔逊和奥尔德里奇(21]表明,几个独立的腺苷酸酶属于相同的总科Acs缓慢释放acyl-adenylate中间没有本机受体,这acyl-adenylate可以发布与羟胺反应。孟et al。22]也目睹了这一现象中链酰coa合成酶(mac)支持2-methylbutyrate酰基衬底。在这种情况下,苹果发布了腺苷酸酰基辅酶a受体的不同程度没有当时那么喜欢酰基丙酸基质如使用。然而,没有释放acyl-adenylate观察中间没有辅酶a 2-methylbutryate青睐,这表明acyl-adenylate中间保留如果酰基一部分适合在活性部位更容易释放在缺乏本地受体如果配合不佳。

没有发现与Acs1活动_太与醋酸在缺乏HSCoA,表明acetyl-AMP中间仍然酶绑定,绑定中间没有与羟胺反应。因此,动力学参数表所示2虽然,整个反应吗ATP和醋酸的值可能是相似的,如果只是腺苷酸的第一步反应的测量。

的几个变种被发现是不活跃在一个广泛的为每个基质浓度和酶浓度。酶活性显示相似的行为在离子交换和疏水作用层析步骤在净化过程中,和凝胶过滤色谱法表示的变量是二聚的野生型酶,暗示没有总值结构改变。总的来说,改变任何残留的第三主题似乎对催化有强烈的有害影响,虽然底物亲和力是通常不受损。

3.1。定位的酪氨酸^498年在活性位点结构中起着重要的作用

基于两个Acs结构,高度保守的酪氨酸^498年在第一个位置的第三主题与Gln氢键网络的一部分^417年和通过氢键网络可能导致维护ATP结合位点附近的活性部位架构(数据1(一)和1 (b))。在模型(图1 (c)),有一个额外的阿拉巴马州之间的相互作用^500年和Gln^417年。检查是否酪氨酸的疏水性和笨重的性质^498年或其参与这个氢键网络,在衬底中扮演更重要的角色绑定和催化,这渣是改变了阿拉巴马州和板式换热器。的酪氨酸^498年阿拉巴马州在Acs1变更_太没有显著影响对于任何衬底但降低流动率41-fold(表2)。然而,酪氨酸^498年板式换热器变体是可溶性但不活跃的底物和酶浓度测试。这些结果表明,尽管酪氨酸的大小^498年保持活性部位的架构,羟基是很重要的一部分发挥了至关重要的作用正确定位这个大侧链通过氢键与Gln^417年。酪氨酸的化学救援的尝试^498年阿拉巴马州变体与苯酚未果。

3.2。用力推^499年和阿拉巴马州^500年不那么保守和扮演小角色吗

第三主题的第二和第三的位置,由刺^499年和阿拉巴马州^500年在Acs1_太守恒的,不如其他职位(表1)。用力推^499年取而代之的是板式换热器在Acs吗_Se,Acs_Sc和许多其他Acs序列,但低浓缩铀是观察到在那个位置在四个五个Acs序列Methanosaeta concilii以及所有四个Acs的序列Methanosaeta thermophila。对丝氨酸和苏氨酸通常在第三位置观察到主题三世,尽管阿拉巴马州出席这个职位8 9总Acs序列m . concilii和m . thermophila。

这些职位是单独改变阿拉巴马州和刺,在Acs1分别_太和纯化变异进行了分析。的基板显示的值只有微小的变化(少于三倍增加或减少)和一成不变的酶。然而,用力推价值降低了83倍^499年阿拉巴马州变体和44-fold阿拉巴马州^500年用力推变体(表2)。总的来说,这些结果显示为这些职位不太重要的角色,这是符合低水平的保护。

3.3。通用电气^501年是高度保守的,可以适当位置不变的Asp吗^502年

通用电气^501年第三第四的位置的主题几乎完全守恒acyl-adenylate-forming酶总科中除了少数成员最远亲Acs。替换这残留的阿拉巴马州导致减少两到三倍值为所有三个基板;然而,减少流动率超过200倍(表2)。严格保护的通用电气和通用电气的降低催化观察^501年阿拉巴马州变异符合这残留扮演角色的正确定位关键的Asp^502年残留在相邻的位置。

3.4。Asp^502年ATP结合通过交互中起关键作用的2′-哦核糖一半

调查的角色不变的Asp残留的主题三世,Asp^502年的Acs1_太改变了阿拉巴马州,更为保守的残留Glu和Asn。虽然酶变异是可溶的,这些改变消除所有检测酶活性,不管使用的酶底物浓度或浓度。事实上,即使是最保守的灭活酶变化表明该Asp活动绝对是至关重要的,可能会因为Asp^502年是完全守恒在所有ACSs整个家族。

抑制化验进行作为一个间接的方法来描述Asp之间的互动^502年和ATP。核糖完全抑制酶活性浓度超过600毫米,和决心是53毫米(图2(一个))。可以达到的最大腺苷浓度抑制化验是100毫米,产生部分失活。然而,推断的数据显示腺苷酸(图的~ 121毫米2 (b))。这一核糖是大约估计的一半为腺苷表明酶和核糖基之间的相互作用中扮演一个重要的角色在ATP绑定。

更精确地确定Asp之间的互动^502年和2′,3′-哦组的核糖糖腺苷抑制2′,3′脱氧腺苷是检查。虽然只有部分抑制观察与化合物,外推的结果明显值356毫米和151毫米2′,3′脱氧腺苷,分别为(数字2 (c)和2 (d))。这些结果表明,互动Asp^502年和腺苷介导的2′-哦组主要通过糖核糖的缺席3′-哦组的影响最小。

的Acs1_太模型(图1 (c))预测之间的氢键Asp^502年和2′,3′-哦组核糖的一部分。然而,这些氢键被淘汰在Asp^502年阿拉巴马州的变体。抑制酶活性的结果和完整的损伤改变在Asp^502年表明,Asp的交互^502年的第三主题2′-哦虽然相互作用中发挥着关键作用实现最优的3′-哦也很重要的活动。

3.5。不变的Asp和核糖基之间的相互作用的ATP酶超家族的其他成员

Acs的活性位点结构_Sc和Acs_Se附近的AMP配体(类似数据吗1(一)和1 (b))。然而,Asp^559年Acs的第三主题_Sc同时与2′,3′-哦组和参数^574年,而Asp^500年Acs的第三主题_Se氢键与2′-哦组和Trp^413年和3′-哦与Gln交互^415年和参数^515年(8,20.]。美国癌症协会_Sc酶的结构,提出了将催化反应的第一步,而Acs_Se结构c端域内转向其他氨基酸残基的活性部位为衬底上下文绑定和催化反应的第二步(8,19,20.]。这些差异是否由于轻微的变化在活性位点结构两个不同的酶或运动的Asp残渣作为酶催化期间从一个形态转化为另两个步骤是未知的,当结构在两种构象也不是用于酶。

结构决定了酶生成adenylate-forming酶总科,包括短、中、和长链酰coa合成酶,aryl-CoA的合成酶CBL benzoyl-CoA连接酶,几个nrp腺苷酸域,和荧光素酶。这些结构显示,域之间的交替第一和第二步骤的反应总科中是普遍的1]。检查结合配体的结构表明,在每种情况下的不变的Asp主题III / A7与一个或两个羟基的核糖ATP的一部分6- - - - - -8,10,19,20.,23- - - - - -29日]。

三个总科的其他成员在adenylate-forming和thioester-forming构象结构。在4-chlorobenzoate:辅酶a连接酶(CBL), Asp^385年氢键只有2′-哦,而3′-哦与参数^400年adenylate-forming构象,而在thioester-forming构象,Asp^385年维护其氢键2′-哦,现在也与3′-哦组参数^400年(6,7]。在DltA D-alanine: D-alanyl载体蛋白连接酶,Asp^383年,与羟基构象。2′-哦也与酪氨酸^394年adenylate-forming构象,3′-哦也与参数^396年在thioester-forming构象25,27]。最近,结构为人类碳链酰coa合成酶ACSM2A已报告在两种构象(28]。Asp^446年与2′-哦和3′-哦adenylate-forming和thioester-forming这种酶的构象。因此,不同的ATP酶和核糖基交互方式不同。在某些情况下,交互领域交替后略有变化。然而,在所有情况下,主题三世的不变的Asp与至少2′-哦,认为这是最重要的交互。

3.6。不变的Asp的作用酶超家族的其他成员

这个不变的Asp的角色一直在研究生化只有少数总科的成员。在3-chlorobenzoate-CoA连接酶、变更的Asp Val基本上消除所有催化活性(30.]。Gocht和Marahiel31日)报道,短杆菌肽合成酶1、更换的Asp残渣Asn或Ser活动减少了22%和88%,分别。Pavela-Vrancic et al。32)观察到与这个相同的ATP酶,置换反应2′-dATP导致活动减少20%和活动减少74%当ATP换成3′-dATP。这些结果表明,对于短杆菌肽合成酶1,至于Acs,之间的交互不变的Asp和ATP的核糖基的羟基是很重要的,与交互2′-哦扮演最重要的角色。

在CBL,不变的Asp^385年第三主题氢键的2′-哦。蚀变残留的Ala整个催化率大大降低,主要是由于第一步的反应速率降低,并导致增加值对ATP和4-chlorobenzoate [7]。在D-alanyl载体蛋白连接酶,不变的Asp氢键与2′,3′-哦组核糖的一半(27]。改变这些残渣Asn减少了腺苷酸的催化反应速率只双重的,但增加了75倍值ATP,作者得出结论,这Asp ATP的过程中起着重要作用紧密绑定和腺苷酸的中间25]。

4所示。结论

从这个调查结果表明,主题III / A7签名主题在Acs扮演着一个重要的角色在两个活性部位架构和ATP绑定和催化作用。

尽管所有位置的主题似乎发挥重要作用在催化,酪氨酸在第一位置是Acs中高度保守的序列有助于保持活跃的网站架构与其他活性位点残基通过氢键网络,特别是节省Gln第二主题/ A5 (Gln^417年的Acs1_太)。Asp在最后的位置发挥了至关重要的作用活性部位通过氢键网络结构和ATP结合和催化的关键与羟基的交互核糖一半。这个Asp是不变的整个总科,符合一个关键的角色在ATP adenylate-forming的绑定和催化第一步反应的所有成员。

作者的贡献

c。I。- - - - - -年代mith and J. L. Thurman Jr. contributed equally to this work.

确认

对这个项目是由国家卫生研究院提供的金融支持(奖GM69374-01A1),南卡罗来纳实验台(项目sc - 1700198),和克莱姆森大学。本文没有技术的贡献。6040年克莱姆森大学的实验台。

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