古细菌磷脂生物合成途径重建gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

生物合成途径的一部分的热点膜脂质,由4古细菌的酶,在细胞重建gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。酶的基因从嗜中温产烷生物克隆,gydF4y2Ba甲烷八叠球菌属acetivoransgydF4y2Ba,每个酶的活动确认使用重组蛋白。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba放射性分析表明,4酶是足以合成一个中间的热点膜脂质生物合成,2,新型双gydF4y2BaOgydF4y2Ba-geranylgeranyl -gydF4y2BasngydF4y2Ba-glycerol-1-phosphate,从前体,可以产生内生的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。引入4基因植入gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba导致archaeal-type脂类的生产。详细的液相色谱/电子喷雾电离质谱分析表明,它们从预期的中间代谢产物,也就是说,2,新型双-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-geranylgeranyl -gydF4y2BasngydF4y2Ba甘油和2,新型双-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-geranylgeranyl -gydF4y2BasngydF4y2Ba-glycerol-1-phosphoglycerol。代谢过程,也就是说,去磷酸化和甘油修改,可能内源性酶催化的gydF4y2Ba大肠杆菌。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

古细菌生物膜脂质非常特定于域的古生菌和结构不同于细菌或真核的脂质(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。虽然,从本质上讲,类似物的glycerolipids从细菌或真核生物,他们有特定的结构特点如下:(1)烃链的热点脂质是multiply-branched类异戊二烯通常来自(所有gydF4y2BaEgydF4y2Ba)geranylgeranyl二磷酸(GGPP),而线性酰基团体一般细菌或真核脂质;(2)类异戊二烯链与甘油的一部分与醚键,而酯债券一般细菌或真核脂质;(3)古细菌脂质来源于的甘油一半gydF4y2BasngydF4y2Ba-glycerol-1-phosphate (G-1-P)的对映体gydF4y2BasngydF4y2Ba细菌或真核glycerolipids -glycerol-3-phosphate,前体;(4)二聚作用的膜脂质之间的碳碳键的形成gydF4y2BaωgydF4y2Ba烃链的终端生成caldarchaeol-type脂质等大环的结构与一般72 -元环,通常是在高温和产甲烷古菌。这些特性影响的性质与脂质膜形成。一般来说,古细菌脂质组成的细胞膜的渗透性低于膜,由细菌或真核脂质(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。此外,古细菌和细菌之间的结构差异/真核脂质被认为能引起他们的黑白之间的分配这些领域没有例外(“脂质鸿沟”)(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。这个假设是基于这个想法,膜组成的古细菌,细菌生物/ eukaryotic-type脂质是不利的,而膜组成的一种类型。虽然这个假设是有吸引力的,据报道到目前为止的证据。获得这一假说的证据,两行可以设计的实验。一个是比较人工膜的物理性质和古细菌和/或细菌/ eukaryotic-type脂质。这种类型的一些研究已经完成(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。岛田和山gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)最近报道,混合脂质体由古细菌和bacterial-type脂质通常是更稳定(防渗)比他们预期的还要快。基于这些结果,他们得出的结论是,生命的共同祖先(和真核生物的起源据说由古生菌和细菌细胞的融合)可能有这样的混合脂质膜,但是他们没有说明脂质发生分裂。,更直接的实验是生成一个有机体,综合这两个热点,因此细菌/ eukaryotic-type膜脂质和混合膜。如果混合膜等属性的生物,因为不利的稳定、渗透率、和流动性,有机体可能降低可行性或变得容易渗透和热冲击等压力。赖昌星等人最近报道的建设这样一个有机体,尽管他们不确定其表型(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。在他们的研究中,磷脂生物合成的基因从一个hyperthermophilic archaeongydF4y2BaArchaeoglobus fulgidusgydF4y2Ba被引入到gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。作者展示了古细菌膜脂质合成前体,即3 -gydF4y2BaOgydF4y2Ba-geranylgeranyl -gydF4y2BasngydF4y2Ba新型-glycerol-1-phosphate (GGGP)和2日—gydF4y2BaOgydF4y2Ba-geranylgeranyl -gydF4y2BasngydF4y2Ba-glycerol-1-phosphate (DGGGP),重组gydF4y2Ba大肠杆菌,gydF4y2Ba基于相应的醇的检测细胞的脂质提取磷酸酶治疗后。然而,它仍不清楚archaeal-type脂质产生的细胞实际上是双层膜的结构组件,因为作者没有显示完整结构的脂质。此外,他们没有描述生产archaeal-type脂质水平,这也是重要的评价对膜的影响gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

在目前的研究中,我们重建古细菌磷脂的生物合成途径的一部分(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),其中包括G-1-P脱氢酶,GGPP合成酶,GGGP合酶,并从嗜中温DGGGP合成酶产甲烷archaeon,gydF4y2Ba甲烷八叠球菌属acetivoransgydF4y2Ba,在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。这些酶可以从内源性合成DGGGP类异戊二烯的前身gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,(所有-gydF4y2BaEgydF4y2Ba)通过二磷酸(FPP) isopentenyl二磷酸(IPP)和二羟丙酮磷酸(DHAP)。此外,酶的嗜温性的预计将有最优活动增长的温度gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,这将导致古细菌的高级生产磷脂前体及其衍生品。我们评估archaeal-type的总量和完整的结构细胞的脂质提取液相色谱/电子喷雾电离质谱法(LC /谱)分析和显示DGGGP被酶内源性代谢gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。材料gydF4y2Ba

LKC-18F预镀、反相薄层色谱板从绘画纸购买,英国。FPP由Drs捐赠。Kyozo Ogura Tanetoshi小山,东北大学。(1 -gydF4y2Ba^14gydF4y2BaC] IPP是从美国购买的放射性标记的化学物质,美国。所有其他化学试剂均为分析纯。gydF4y2Ba

2.2。一般程序gydF4y2Ba

限制性内切酶消解时,转换,和其他标准的分子生物学技术进行了描述Sambrook et al。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.3。的培养gydF4y2Bam . acetivoransgydF4y2Ba

的gydF4y2Bam . acetivoransgydF4y2BaC2A (JCM 12185)应变是由日本提供的微生物(JCM),日本BRC,通过自然物种项目下边了,日本。嗜中温的产甲烷archaeon种植在JCM 385gydF4y2Ba甲烷八叠球菌属acetivoransgydF4y2Ba媒介在37°C和收获在日志的阶段。gydF4y2Ba

2.4。构建质粒含有磷脂生物合成的基因gydF4y2Bam . acetivoransgydF4y2Ba

的基因组gydF4y2Bam . acetivoransgydF4y2Ba从细胞中提取使用DNA提取设备,ISOPLANT II(日本基因)。每一个假想的古细菌磷脂生物合成的基因,也就是说,gydF4y2BaMA3686gydF4y2Ba,gydF4y2BaMA0606gydF4y2Ba,gydF4y2BaMA3969gydF4y2Ba,gydF4y2BaMA0961gydF4y2Ba使用引物见表,放大gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,使用的基因组gydF4y2Bam . acetivoransgydF4y2Ba作为一个模板,并使用KOD DNA聚合酶(Toyobo、日本)。放大DNA片段被限制性内切酶消化,认识到网站的引物,然后插入到pBAD18向量减少相同的限制性内切酶构建的质粒每个古细菌酶的表达,也就是说,pBAD-MA3686, pBAD-MA0606 pBAD-MA3969, pBAD-MA0961。gydF4y2Ba

建设的多个热点基因的表达质粒,在融合的优势PCR克隆工具(豆类、日本)是根据制造商的指示使用。的gydF4y2BaMA0961gydF4y2Ba使用引物见表基因放大gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和pBAD-MA0961作为模板。在融合酶的作用,放大片段插入到质粒pBAD-MA0606,被消化gydF4y2Ba萨尔gydF4y2Ba我,构建质粒pBAD-ALB2。接下来,gydF4y2BaMA3969gydF4y2Ba基因,放大使用引物在表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和pBAD-MA3969作为模板插入到pBAD-ALB2消化gydF4y2Ba萨尔gydF4y2Ba我来构造pBAD-ALB3。质粒被消化gydF4y2Ba萨尔gydF4y2Ba我,gydF4y2BaMA3686gydF4y2Ba使用引物在表基因,放大gydF4y2Ba1gydF4y2Ba插入和pBAD-MA3686作为模板,构造pBAD-ALB4。gydF4y2Ba

2.5。古细菌的重组表达的酶gydF4y2Ba

大肠杆菌gydF4y2Ba全球,改变了每一个质粒含有同源基因热点磷脂生物合成,即pBAD-MA0606, pBAD-MA3969, pBAD-MA0961, pBAD-MA3686,或pBAD-ALB4,种植在37°C和100毫克/ 250毫升LB培养基补充L氨苄青霉素。当光密度在660 nm的文化达到了0.5,然后添加0.02%的L-arabinose归纳。额外的16 h孵化后,细胞收获声波降解法和中断的100毫米3 - 5毫升(gydF4y2BaNgydF4y2Ba吗啉代)propanesulfonic酸(拖把)氢氧化钠缓冲区,pH值7.0。30分钟的匀浆离心机在24000 g恢复浮在表面的粗提取液,用于酶试验。gydF4y2Ba

2.6。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba测定磷脂生物合成的前体gydF4y2Ba

prenyltransferases包含测定混合物,在200年的最后一卷gydF4y2BaμgydF4y2BaL 0.2 nmol [1 -gydF4y2Ba^14gydF4y2BaC] IPP (2.04 GBq /更易),1 nmol FPP, 2.0gydF4y2BaμgydF4y2Ba摩尔的MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,20gydF4y2BaμgydF4y2Ba摩尔MOPS-NaOH, pH值7.0,合适的粗提取物的量gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba包含pBAD-MA0606、pBAD-MA3969或pBAD-MA0961。gydF4y2BaαgydF4y2Ba甘油磷酸酯(外消旋混合物)只添加到包含MA3969混合物。gydF4y2Ba

G-1-P脱氢酶的测定混合物中,在200年的最后一卷gydF4y2BaμgydF4y2BaL, 0.2 nmol [1 -gydF4y2Ba^14gydF4y2BaC] IPP (2.04 GBq /更易),1 nmol FPP, 2.0gydF4y2BaμgydF4y2Ba摩尔的MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,20gydF4y2BaμgydF4y2Ba摩尔MOPS-NaOH, pH值7.0,合适的粗提取物的量gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba包含pBAD-MA0606、pBAD-MA3969或pBAD-MA3686。如果需要,200 nmolgydF4y2BaαgydF4y2Ba甘油磷酸盐或DHAP添加到混合物中。gydF4y2Ba

在200年的最后一卷gydF4y2BaμgydF4y2BaL, 4古细菌酶的测定混合物同时表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba包含0.2 nmol [1 -gydF4y2Ba^14gydF4y2BaC] IPP (2.04 GBq /更易),1 nmol FPP, 200 nmol DHAP, 2.0gydF4y2BaμgydF4y2Ba摩尔的MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,20gydF4y2BaμgydF4y2Ba摩尔MOPS-NaOH, pH值7.0,一个合适的粗提取液的体积gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba包含pBAD-ALB4。gydF4y2Ba

孵化后30分钟37°C,反应停止了在冰浴冷却。200年gydF4y2BaμgydF4y2BaL(水饱和氯化钠添加到混合物,然后提取600的产品gydF4y2BaμgydF4y2BaL与NaCl-saturated 1-butanol饱和水。他们处理酸性磷酸酶根据藤井裕久等的方法。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),和提取玉米胚芽蛋白酶解物gydF4y2BangydF4y2Ba戊烷和分析反相,薄层色谱法(TLC)使用预镀板LKC-18F发达与丙酮/ HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO (9: 1)。检测到放射性物质的分布使用BAS2000 bioimaging分析仪(日本富士胶片)。真正的样本准备如我们之前的报告所述,使用的酶gydF4y2BaSufolobus acidocaldariusgydF4y2Ba和gydF4y2Ba美国solfataricusgydF4y2Ba(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.7。脂质隔绝gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba窝藏pBAD-ALB4gydF4y2Ba

从2 g湿细胞脂质提取gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba窝藏pBAD-ALB4,培养如上所述,除了感应与执行l-arabinose 18 h。15毫升的细胞溶解1-butanol水/乙醇铵/ 75毫米(4:5:11)。混合物加热到70°C和大力动摇了1分钟。它再次被加热在70°C为20分钟,再次动摇大力1分钟。冷却到室温后,混合物在1000离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。上层清液回收,干下的氮流55°C。干渣,然后用7.2毫升1-butanol /甲醇溶解醋酸缓冲/ 0.5米,pH值4.6 (3:10:5)。脂质混合物中提取了3毫升gydF4y2BangydF4y2Ba戊烷和干下的氮流55°C。干渣再溶解在1毫升的甲醇/丙胺(1:1)。gydF4y2Ba

2.8。LC /谱分析gydF4y2Ba

质进行了《时尚先生》3000离子阱系统(力量Daltonics,美国)。MS-parameters使用如下:鞘气体,NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba30 psi的;干气,NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的7.0升gydF4y2Ba·gydF4y2Ba最小值gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在320°C;扫描范围,50 - 1000gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba;扫描速度,13000gydF4y2Bam / z·gydF4y2Ba证券交易委员会gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba};离子电荷控制目标,50000年或20000年;最大积累时间100毫秒;平均10;平均,2。系统配备一个安捷伦1100系列高效液相色谱系统(美国安捷伦科技)使用紫外检测在210 nm和COSMOSIL填充柱5 cgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba-AR-II(2.0×150毫米,Nacalai,日本)。流动相是由甲醇/ 100毫克gydF4y2Ba·gydF4y2BalgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}醋酸钠(9:1)或甲醇/ 120毫克gydF4y2Ba·gydF4y2BalgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}乙酸钾(9:1)。流量为0.2毫升·分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。gydF4y2Ba

2.9。高碘酸钠治疗gydF4y2Ba

高碘酸钠治疗的新型双-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-geranylgeranyl -gydF4y2BasngydF4y2Ba-glycero-1-phosphoglycerol (DGGGP-Gro)、高效液相色谱的峰分数包含大约nmol DGGGP-Gro和2,混合物的新型双-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-geranylgeranyl -gydF4y2BasngydF4y2Ba甘油(DGGGOH), 1gydF4y2BaμgydF4y2Ba摩尔高碘酸钠加入1毫升1-butanol /水/乙醇铵75毫米(4:5:11)。混合反应在25°C 1 h在黑暗中。通过添加1.5反应停止gydF4y2BaμgydF4y2Ba甘油的摩尔。15分钟后,产品被1毫升的提取gydF4y2BangydF4y2Ba戊烷和N干gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。与100年干渣溶解gydF4y2BaμgydF4y2BaL甲醇/丙胺(1:1)和电喷雾质谱分析了LC /。gydF4y2Ba

3所示。结果与讨论gydF4y2Ba

我们首先寻找和克隆的基因从嗜中温,产甲烷archaeon,gydF4y2Bam . acetivoransgydF4y2Ba最近的同系物编码的酶参与生物合成的热点膜脂质。的同系物G-1-P脱氢酶,它显示了顺序身份G-1-P脱氢酶的59%gydF4y2BaMethanothermobacter thermautotrophicusgydF4y2Ba(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),编码的基因gydF4y2BaMA3686gydF4y2Ba。最接近的同系物GGPP合酶,39%身份的酶gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),编码gydF4y2BaMA0606gydF4y2Ba。GGGP合酶同系物的身份与酶的57%gydF4y2Bam . thermautotrophicusgydF4y2Ba(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)编码gydF4y2BaMA3969gydF4y2Ba。最接近的同系物DGGGP合酶,31%身份的酶gydF4y2Ba美国solfataricusgydF4y2Ba(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),编码gydF4y2BaMA0961gydF4y2Ba。每一个基因,gydF4y2BaMA3686gydF4y2Ba,gydF4y2BaMA0606gydF4y2Ba,gydF4y2BaMA3969gydF4y2Ba,gydF4y2BaMA0961gydF4y2Ba表达的重组gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。的细胞gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba中断和离心机恢复浮在表面的粗提物。然后粗提取液中的酶活性被radio-TLC试验证实。如图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba孵化的粗提物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达gydF4y2BaMA0606gydF4y2BaFPP和(gydF4y2Ba^14gydF4y2BaC] IPP产生放射性标记的疏水性产品,与酸性磷酸酶和治疗的产品产生一种化合物,comigrated与真实的(所有gydF4y2BaEgydF4y2Ba)geranylgeraniol反相薄层色谱板(gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.60)。的粗提物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达gydF4y2BaMA3969gydF4y2Ba和gydF4y2BaαgydF4y2Ba甘油磷酸盐的反应混合物导致运动在TLC放射性标记的位置。新位置(gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.68)comigrated与真实的3 -gydF4y2BaOgydF4y2Ba-geranylgeranyl -gydF4y2BasngydF4y2Ba甘油(GGGOH)。运动没有发生在缺乏gydF4y2BaαgydF4y2Ba甘油磷酸酯(数据没有显示)。当从原油中提取gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达gydF4y2BaMA0961gydF4y2Ba另外混合,新的放射性标记的点(gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba= 0.34和0.12)出现在TLC,伴随着减少放射性的其他位置。现货的gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba0.34与真实DGGGOH comigrated。这些结果表明,gydF4y2BaMA0606gydF4y2Ba,gydF4y2BaMA3969gydF4y2Ba,gydF4y2BaMA0961gydF4y2Ba从他们的同源性编码,如预期,GGPP合成酶,GGGP合酶,分别和DGGGP合成酶。现货的gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba0.12被认为是起源于一个未知的原油中包含修改DGGGP催化的酶提取物。确认G-1-P脱氢酶活性的粗提物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达gydF4y2BaMA3686gydF4y2Ba,提取与原油提取包含孵化gydF4y2Bam . acetivoransgydF4y2BaGGPP合成酶和GGGP合成酶、DHAP FPP,gydF4y2Ba^14gydF4y2BaC] IPP。疏水性产品提取、处理磷酸酶和薄层色谱分析,给出一个主要地方,comigrated GGGOH(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。删除后的粗提物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达gydF4y2BaMA3686gydF4y2Ba从反应混合物,GGGOH现货变得更薄,并与geranylgeraniol comigrated成为了主要的位置。这个结果表明gydF4y2BaMA3686gydF4y2Ba编码G-1-P脱氢酶。相比之下,去除DHAP的混合物并没有改变产品的TLC概要,表明足够多的DHAP存在于反应混合物,含有细胞提取物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。值得注意的是少量的GGGOH似乎即使没有合成gydF4y2Bam . acetivoransgydF4y2BaG-1-P脱氢酶。有可能是酶只有低亲和力gydF4y2BasngydF4y2Ba与G-1-P-specific -glycerol-3-phosphate,据报道热点同系物(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

我们下构造了一个包含4个热点基因的质粒载体,形成人为的操纵子的顺序gydF4y2BaMA0606gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaMA0961gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaMA3969gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaMA3686gydF4y2Ba,重建古细菌磷脂的生物合成途径gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。酶的活动被证实了gydF4y2Ba在体外gydF4y2Baradio-TLC化验。从重组细胞提取gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba4古细菌基因表达显示相关活动的形成从DHAP DGGGP, IPP, FPPgydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba),这表明,酶gydF4y2Bam . acetivoransgydF4y2Ba,G-1-P脱氢酶、GGPP合成酶GGGP合成酶,DGGGP合酶,细胞中表达。此外,放射性较低gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba观察值(~ 0.1)。这个地方可能与一个gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba0.12图中观察到gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba。因为这些地方陪同DGGGP因为反应混合物的形成对这些化验包含细胞提取物gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,他们认为来自未知DGGGP的导数,这可能是通过内源性代谢途径形成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

因此,我们从重组中提取脂质gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞来确认gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba古细菌磷脂的合成前体或其衍生品。电喷雾质谱的结果LC /分析提取的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba包含pBAD-ALB4显示一个相对广泛的LC的高峰gydF4y2Ba_{210年gydF4y2Ba}从列,筛选了~ 22分钟(图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba)。这个峰值没有分析的提取gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba包含父质粒pBAD18。特定的离子峰gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba659.6和835.6是通过分析女士发现峰的正离子模式(图gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba)。这些离子相似但略有不同的峰保留时间,所以小离子不太可能来自大的碎片。较小的离子与gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba659.6与[DGGGOH + Na)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba。如图gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2BaMS / MS分析的离子碎片离子的gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba385.0,这与[GGGOH + Na-2H]gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba。此外,一个更小的碎片离子的gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba354.9,这与[GGGOH + Na-CHgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba检测到。分裂模式支持图的峰值gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba可能包含DGGGOH,合成了外生古细菌酶和内源性磷酸酶的作用gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。另一方面,MS / MS分析较大的离子gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba835.6发现一个碎片离子gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba659.6,这表明父离子包含DGGGOH结构(图gydF4y2Ba3 (e)gydF4y2Ba)。女士/小姐/女士的碎片离子的分析gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba659.6产生碎片离子在图所观察到的类似gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2Ba(数据没有显示)。因此我们推测的离子峰gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba835.6是源自于阳离子bisodium phosphatidylglycerol-type导数的盐DGGGP (DGGGP-Gro)。证实这个想法,洗脱缓冲LC /从一个含有醋酸钠质被改变到一个含有醋酸钾,和相同的脂质提取进行了分析。因此,离子gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba867.5,这与预期相一致的阳离子bis-potassium盐DGGGP-Gro,发现相反(图gydF4y2Ba3 (f)gydF4y2Ba)。此外,女士的分析离子如图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba在负离子模式下,产生了一个离子gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba789.5,这与[DGGGP-Gro]gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3 (g)gydF4y2Ba)。MS / MS分析离子显示一个碎片离子gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba715.5,这是一致的(DGGGP)gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3 (h)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

此外,我们LC峰图中恢复过来gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba,它可能包含DGGGP-Gro,治疗高碘酸钠的磷脂确认极性头的结构组织。LC /治疗脂质谱分析包含给予积极乙酸钠离子的洗脱缓冲的gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba803.5(图gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba),它没有在未经处理的样品的分析(图gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba)。这种离子的出现似乎伴随的离子的衰落gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba835.5。的gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba803.5通信与DGGGP改性的阳离子bisodium盐glycoaldehyde(2,新型双-gydF4y2BaOgydF4y2Ba-geranylgeranyl -gydF4y2BasngydF4y2Ba-glycero-1-phosphoglycoaldehyde)预期的产品高碘酸钠治疗DGGGP-Gro(图gydF4y2Ba4 (c)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

这些结果表明,DGGGP应该前体的合成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞通过4外生古细菌酶的作用,已经被内源性代谢gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba酶产生DGGGP-Gro。目前尚不清楚~ 0.1的放射性薄层色谱斑点,观察到的数字gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba来自DGGGP-Gro。可能的archaeal-type磷脂膜在充当一个组成部分gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。修改与甘油磷脂是平常的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba产生phosphatidylglycerol膜磷脂的主要成分(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。然而,最常见的细菌中磷脂是磷脂酰乙醇胺。这些磷脂的生物合成磷脂酸cytidylation的开始,而收益率CDP-diacylglycerol [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。gydF4y2BasngydF4y2Ba-Glycerol-3-phosphate或L-serine是磷脂酰-然后转移到形式gydF4y2BasngydF4y2Ba分别-glycero-3-phosphate或phosphatidyl-L-serine。前中间收益率phosphatidylglycerol脱磷酸化,脱羧后者的收益率磷脂酰乙醇胺。如果DGGGP-Gro收益的形成通过这个途径,cytidyltransferase,gydF4y2BasngydF4y2Ba-glycerol-3-phosphate转移酶,磷酸酶gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba必须接受archaeal-type磷脂作为衬底。然而,CTP的反应混合物gydF4y2Ba在体外gydF4y2Baradio-TLC化验没有加剧现货的gydF4y2BaRgydF4y2Ba_fgydF4y2Ba~ 0.1(数据未显示)。相比之下,这一事实DGGGP修改与乙醇胺(或丝氨酸)没有发现电喷雾质谱在LC /分析表明L-serine转移酶不接受archaeal-type衬底。事实上,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba磷脂酰丝氨酸合酶,它属于一种酶总科不同,其中包括古磷脂酰丝氨酸合成酶,据说不接受CDP-activated DGGGOH [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。如果cytidylation-dependent通路不工作,这似乎更有可能的是,内部membrane-periplasmic phosphoglyceroltransferase系统[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)可以转让gydF4y2BasngydF4y2Ba1-phosphoglycerol组6 - (glycerophospho) d葡萄糖基的osmoregulated周质的葡聚糖膜派生的寡糖,或lipid-linked前兆,DGGGOH收益率DGGGP-Gro直接。gydF4y2Ba

应该指出的是,增长的速度gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba窝藏pBAD-ALB4几乎是相同的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba窝藏pBAD18(数据没有显示)。这一事实表明,生产archaeal-type glycerolipids,这不同于内生细菌的碳氢化合物的手性结构和甘油的一部分,并不强烈影响的可行性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。archaeal-type脂质提取的总金额gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞,估计通过比较LC峰的面积gydF4y2Ba_{210年gydF4y2Ba}与已知的大量GGPP,只是~ 60gydF4y2BaμgydF4y2Ba湿细胞的g / g。此外,archaeal-type脂质中发现这项工作,也就是说,DGGGP-Gro DGGGOH,仍保留在他们的烃链双键,很少发现成熟古细菌的脂质。因此,它似乎为时过早断定共存的热点和细菌脂质不是不利的生物。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项工作是支持的科研补助金旭硝子基金会(h . h)从下边了,日本(h . Hemmi 23108531号)。作者感谢Susumu川博士,名古屋大学,因为他的培养提供帮助gydF4y2Bam . acetivoransgydF4y2Ba。他们感谢Shigeyuki北村先生,名古屋大学,他的帮助与LC /谱分析。gydF4y2Ba

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