醋酸激活Methanosaeta thermophila焦磷酸酶:表征的关键酶和乙酰辅酶a合成酶

文摘

嗜热产烷生物的Methanosaeta thermophila使用醋酸作为甲烷生成唯一的衬底。提出醋酸激活反应,需要以乙酸产甲烷途径需要两个ATP的水解,而醋酸激活反应甲烷八叠球菌属sp。只需要一个ATP。因为这些生物的热力学限制维持生活,醋酸激活反应铜山thermophila似乎过于昂贵,因此重新评估。这是公认的醋酸激活酶的发现,一个基因编码一个AMP-forming乙酰辅酶a合成酶高度表达。相应的酶纯化和详细描述。它催化ATP-dependent乙酰辅酶a的形成,AMP和焦磷酸,只有适度抑制。的分解是由可溶性焦磷酸酶。这种酶也被纯化和特征。焦磷酸酶水解的主要部分(毫米)产生的醋酸激活反应。活动不是由核苷酸或抑制。但是,它不能排除其他端依赖酶利用剩余的和导致细胞的能量平衡。

1。介绍

产甲烷古菌生态重要性较高,他们负责关闭全球碳循环和生产的温室气体有限公司₂和甲烷(1- - - - - -3]。他们也是不可或缺的一部分沼气反应堆和促进生产的可燃气体甲烷的来源可再生能源(4,5]。产甲烷古菌使用终端产品的厌氧细菌降解过程像H₂/公司₂和醋酸作为生长的基质。据估计,大约三分之二的地球上产生的甲烷产甲烷古菌来源于乙酸降解[6]。尽管其高丰富只有两个属能够使用醋酸作为甲烷生成的基板上,即甲烷八叠球菌属和Methanosaeta。而甲烷八叠球菌属物种是新陈代谢多才多艺,属的成员Methanosaeta专门在醋酸的利用率。这反映在一个非常高的底物的亲和力。增长,最小的只有7 - 70的浓度μM是必要的(7]。因此,Methanosaeta物种战胜属的成员甲烷八叠球菌属低醋酸环境中经常遇到的自然栖息地。重要的生物技术的栖息地是沼气设施(8- - - - - -12),Methanosaeta物种是特别重要的反应堆性能和稳定性(12,13]。

醋酸acetate-degrading (aceticlastic)甲烷生成,首先必须被激活的ATP。这个反应可以催化了高活动但低亲和力醋酸激酶/ phosphotransacetylase (AK / PTA)系统所使用甲烷八叠球菌属sp。14,15)或低活性,但高亲和性AMP-dependent acetyl-CoA-synthetases (ACS) (16- - - - - -18]。而正义与发展党/ PTA系统生成ADP, P_我醋酸和乙酰辅酶a ATP、检验,(15,19,20.),ACS转换ATP、检验和醋酸乙酰辅酶a, AMP和焦磷酸(PP_我)[16,18]。在aceticlastic产甲烷的第一步,乙酰辅酶a裂解成甲基羰基一半,CO脱氢酶/乙酰辅酶a合成酶的作用。在这个反应过程中,羰基氧化有限公司₂和电子转移到铁氧还蛋白21- - - - - -23]。甲基是捐赠给产甲烷代数余子式tetrahydrosarcinapterin,随后转移到辅酶M (CoM)膜结合Na⁺把甲基转移酶。减少甲烷的甲基辅酶B捐赠者会形成所谓的heterodisulfide (CoM-S-S-CoB)。直到最近我们证明Methanosaeta thermophila(太)使用heterodisulfide作为终端在厌氧呼吸链电子受体减少铁氧还蛋白作为唯一的电子供体(24]。然而,这种生物的方式节约能源还没有完全理解。可以估计,在细胞质膜的离子转移aceticlastic产甲烷过程中可以满足两个ADP分子的磷酸化。然而AMP-dependent乙酰辅酶a合成酶和可溶性焦磷酸酶(PPiase)活动可以展示密切相关铜山concilii(16,18,25]。考虑到非能源耦合焦磷酸水解的,两个ATP等价物醋酸消耗过程中激活反应。根据这个模型,专aceticlastic产烷生物铜山thermophila在甲烷生成不能节约能源。澄清这一矛盾,醋酸激活反应铜山thermophila被重新评估,ACS和PPiase基因表达分析和表征。

2。材料和方法

2.1。材料

所有化学药品和试剂购自Sigma-Aldrich(德国慕尼黑)或卡尔罗斯GmbH(德国卡尔斯鲁厄)。限制内切酶、T4 DNA连接酶Taq DNA聚合酶,PCR试剂购自Fermentas(圣Leon-Rot,德国)。Phusion DNA聚合酶购买来自新英格兰生物学实验室(法兰克福,德国)。寡核苷酸合成了欧陆坊(Ebersberg,德国)。

2.2。生物信息学

爆炸分析,相应的工具在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)使用。对于批处理爆炸分析,这些蛋白质一个阈值值< e⁻⁴⁰被称为同源。程序PsiPred (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/CBS)是利用生物信息学分析的领域。

2.3。中存在

总RNA从铜山thermophilaDSM 6194被三试剂萃取分离。250毫升的文化被厌氧生长到后期指数增长阶段中期387年DSMZ介质与50毫米醋酸钠55°C。文化是在厌氧离心管罩和被摇晃quick-chilled冰冷的乙醇浴(−70°C) 5分钟。后来,细胞被离心收获在厌氧条件下(11000×g, 25分钟,4°C)。细胞颗粒在5毫升resuspended三试剂和细胞溶解通过冻融治疗−一夜之间70°C。按照制造商的指示总RNA提取(Ambion,达姆施塔特,德国)。准备接受DNAse我减少DNA污染。清洁和核糖核酸的浓度是通过使用SurePrep RNA清理和浓度工具包(费舍尔科学,Schwerte,德国)。RNA纯度是量化spectrophotometrically通过检查260海里/ 280海里比率以及变性琼脂糖凝胶电泳。

引物设计中存在的使用Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)。基因高度同源的ACS,最少的同源区域被用作模板来保证引物的特异性。基因编码glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAP-DHmthe_0701)和核糖体蛋白S3P (mthe_1722)被选为参考基因。使用的引物序列可以从表1。

PCR反应是根据制造商的指示执行(http://www1.qiagen.com/),平均250 ng的RNA。绿色的QuantiTect SYBR rt - pcr试剂盒(试剂盒、希尔登,德国)和iCycler (Bio-Rad,慕尼黑,德国)用于标签和量化,分别。数据分析,Bio-Rad iCycler软件使用。每个PCR产品给了一个狭窄的峰值在融化曲线分析。相对价值(Δ)最初的目标集中在每个反应是由减法值的参考基因的感兴趣的基因。通过减去Δ值,比较感兴趣的基因之间可以完成。此外,负控制化验包括未孵化的逆转录酶。这些化验只包含DNA的痕迹并不被DNase治疗。的价值观的负面的控制进行了分析和高出至少5个周期的化验逆转录酶治疗。

2.4。克隆到表达载体

基因铜山thermophila从染色体DNA与CTAB提取放大26]。限制酶位点插入PCR;引物序列如下(限制内切酶识别网站是下划线):mthe_0236对于ATGGTAGGTCTCAAATGGCAGATAATATCTATGTGGTCGGG,mthe_0236牧师ATGGTAGGTCTCAGCGCTCTTCTTGAATGCGGACTCGAGC,mthe_1194对于ATGGTAACCTGCATTAGCGCCGCTGAGACTGCAAAGACTGCTG,mthe_1194牧师ATGGTAACCTGCATTATATCAGACTATGAGCGGGATGTTCTCG。克隆的焦磷酸酶基因(mthe_0236),生态31我曾经,AMP-dependent ACS的克隆基因(mthe_1194)Bve即扩增子和结扎切成pASK-IBA3或pASK-IBA5 (IBA GmbH,哥廷根,德国)生产帕斯克-mthe02363和帕斯克-mthe11945,分别。两个向量含有质粒编码核糖体结合位点和Strep-tag II c端(pASK-IBA3)或氨基端(pASK-IBA5)。结构经测序和转化大肠杆菌(27]。

2.5。蛋白质生产过剩和净化

生产过剩的蛋白质了大肠杆菌BL21 (DE3)包括质粒pLysS (Novagen /默克,达姆施塔特,德国)。细胞生长在修改最大感应介质(28)为3.2% (w / v)胰蛋白胨,2% (w / v)酵母提取物,和添加M9盐以及0.1毫米CaCl₂1毫米MgSO₄和1μM柠檬酸铵铁(III)。氨苄青霉素(100μ克毫升⁻¹)和氯霉素(25μ克毫升⁻¹)增加质粒维护。文化发展耗氧在37°C OD_600年的0.6;引起的蛋白质生产的anhydrotetracyclin ng(200毫升⁻¹)。细胞被允许生长3 - 4个小时,由离心收获(11000 g×10分钟)和细胞溶解,声波降解法。蛋白纯化Strep-tactin亲和色谱法进行了耗氧根据制造商的指示(IBA GmbH,哥廷根,德国)。纯化蛋白是储存在-70°C。

2.6。蛋白质的可视化

sds - page是根据Laemmli [29日)5% (w / v)聚丙烯酰胺堆积胶和12.5% (w / v)板凝胶。样本稀释样本加载缓冲区(2% (w / v) SDS, 5% (v / v)β巯基乙醇,50% (v / v)甘油,20% (v / v)收集缓冲(0.625 M Tris-HCl pH值6.8),0.001% (w / v)溴酚蓝),煮5分钟在95°C和加载的凝胶。分子质量计算相比,分子质量标准(Fermentas,圣Leon-Rot,德国)。蛋白质是由银染色(可视化30.]。

2.7。凝胶过滤色谱法

凝胶过滤色谱嗨负载16/60 Superdex 75预备年级列(通用电气医疗集团,慕尼黑,德国)。校准是通过使用分子量的工具包,29000 - 700000凝胶过滤色谱法(Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)根据制造商的指示。测定空白卷蓝色葡聚糖受雇。的计算根据

洗脱体积,孔隙体积和列抑扬顿挫。对年代际绘制对数的分子量蛋白质用于校准,以及由此产生的曲线用于分子质量的决心。平均为1.5毫克的可溶性焦磷酸酶加载并运行在40毫米Tris-HCl pH值8,150毫米氯化钠,MnCl 1毫米₂0.5毫升的速度最小⁻¹。

2.8。酶化验

分析混合物Mthe_0236通常含有200μL总量的40毫米Tris-HCl pH值8日MgCl 5毫米₂和1毫米聚丙烯_我。用于测量含锰酶,蛋白质是pre-incubated准备5分钟在室温下在40毫米Tris-HCl pH值8中,MgCl 5毫米₂和1毫米MnCl₂前测量。测量核苷酸抑制的影响,750年μM AMP或5μM ADP是包括在内。测量磷酸盐0和1.5毫米之间的影响,KH₂阿宝₄是补充道。焦磷酸酶的活动决定了不连续化验样本在不同时间点和反应产物的内容正磷酸盐测定(修改后Saheki et al。31日])。值是相对于标准曲线(0 - 2毫米)。并行运行更多的反应,在96 -孔板进行测试。因此,10μL的样品测定混合物停止了2μL 10% (w / v)三氯乙酸。150年μL(钼酸试剂(NH(15毫米₄)₆莫₇O₂₄,70毫米醋酸锌,pH值5.0添加了盐酸)以及50μL 10% (w / v)抗坏血酸与氢氧化钠(pH值5.0)。孵化后15分钟30°C,吸收在850纳米测量与Nanoquant无限M200 (Tecan、Mannedorf、瑞士)。一个单位被定义为μ摩尔页_我水解敏⁻¹。

测量的活动AMP-dependent ACS (Mthe_1194)两种不同的方法被采用。温度稳定,K_米醋酸的价值,抑制PP_我通过辅助酶测定方法根据修改后孟et al。32)(表2)。这种方法生产的AMP Mthe_1194耦合NADH消费,之后在340 nm光度学的。在标准1毫升测定50 mM消息灵通的pH值7.5,5毫米MgCl₂磷酸烯醇丙酮酸,3毫米,1毫米辅酶a, 2.5毫米ATP, 1毫米德勤,醋酸钠20毫米,0.15毫米NADH都包括在内。反应温度设置为55°C。辅助酶在这个温度足够稳定,和大量的辅助酶(5.7 U肌激酶,2.3 U丙酮酸激酶,2.1 U乳酸脱氢酶)没有速度限制。NADH的消光系数是6.22毫米⁻¹厘米⁻¹。一个单位被定义为一个μ摩尔的醋酸消耗每分钟等于2μ摩尔NADH每分钟消耗。

K_米值ATP和辅酶a(反应体积3.5毫升)以及底物特异性(反应体积2毫升)使用不连续的分析测定。380年在不同的时间点μL采集标本和页的内容_我显示测量方法修改后旷et al。33]。样品的反应是与380年停止μL柠檬酸12% (w / v)和100年μL钼酸试剂(2.5% (w / v) (NH₄)₆莫₇O₂₄在5 N H₂所以₄),100μL 0.5β巯基乙醇和40μL显影剂的检测试剂添加页_我。溶解的显影剂试剂准备0.25 g Na₂所以₃,14.65 g KHSO₃和0.25 g 1-amino-2-naphthol-4-sulfonic酸100毫升热水。解决方案是冷却和过滤使用前。页的反应混合物_我分析孵化15分钟在580 nm 37°C和吸收测量。量化是使用标准曲线(0 - 0.5毫米PP_我)。一个单位被定义为μ醋酸摩尔每分钟耗尽。

3所示。结果

3.1。比较基因组的Methanosaeta thermophila和甲烷八叠球菌属mazei

最近完成的基因组序列铜山thermophila(23)表示,大多数的核心步骤aceticlastic甲烷生成属相比是相似的甲烷八叠球菌属,但惊人的差异被发现在电子转移反应和节能装置。这些发现使我们比较详细和全面的蛋白质。一批爆炸的所有氨基酸序列分析mazei女士对铜山thermophila反之亦然。总之,大约有900在蛋白质鉴定mazei女士和铜山thermophila(没有显示)。同源染色体之间的酶参与的中央部分aceticlastic甲烷生成和蛋白质参与DNA复制、转录和翻译。考虑到的基因组铜山thermophila1698年编码蛋白质,约800中发现的蛋白质铜山thermophila没有对应的mazei女士。另一方面,mazei女士包含3371个基因表明约2500蛋白质可以生产的mazei女士中没有找到铜山thermophila。

详细检查的基因组铜山thermophila显示呼吸链是比较简单的甲烷八叠球菌属的物种,只由F_420年H₂脱氢酶和heterodisulfide还原酶。没有基因的染色体编码氢化酶(F_420年减少氢化酶(Frh)和F_420年-nonreducing氢化酶(Vho),也不决定自氢化酶)[23)或Rnf复杂(编码一种膜结合酶能够氧化减少铁氧还蛋白)(23]。膜分数的铜山thermophila显示没有表现出任何氢化酶的活动(24]。此外,没有膜结合焦磷酸酶和电子输入模块的F_420年H₂脱氢酶FpoF [34]也不见了。此外,醋酸激酶基因和phosphotransacetylase缺席。在这个有限的设备相比,铜山thermophila拥有四个基因编码乙酰辅酶a合成酶(ACS) (23]。没有找到这四个基因的同源染色体甲烷八叠球菌属物种。没有证据表明膜结合焦磷酸酶,一对水解的焦磷酸离子挤压(35),从而为节约能源做出贡献。相反,一个单一的可溶性II型就会焦磷酸酶(mthe_0236)[23]。

3.2。描述的焦磷酸酶

醋酸的当前假设激活反应Methanosaeta物种,焦磷酸乙酰辅酶a的形成过程中产生的,是由焦磷酸酶水解(25]。然而,从我们所知的这些生物体的能量保护系统很明显,至少部分焦磷酸键的能量是守恒的。因此,可溶性焦磷酸酶铜山thermophila特点是对基因表达和酶活性。

转录水平的基因编码的可溶性II型分析了焦磷酸酶存在实验。记录的数量是3——4倍高于参考基因编码GAP-DH和核糖体蛋白S3P(图S1)。至少从S3P蛋白质的基因编码为高效表达大量核糖体的形成,很明显,可溶性焦磷酸酶信使rna存在于细胞的复制数据铜山thermophila。

此外,可溶性II型焦磷酸酶被发现包含一个CBS域位于附近的n端,监管效果由绑定的配体如AMP和ADP (36- - - - - -38]。因此,焦磷酸酶铜山thermophila可能会抑制在低能量的条件下(低ATP / ADP比率)使细胞利用磷酸基焦磷酸转移的潜力。

爆炸分析显示,哥伦比亚广播公司(CBS)域很少发现在焦磷酸酶的产甲烷古菌。他们只能确定可溶性焦磷酸酶的物种Methanosaeta,Methanocaldococcus,Methanotorris。然而,生化数据只存在焦磷酸酶铜山concilii(25]。因此,哥伦比亚广播公司(CBS)的功能域焦磷酸酶的产甲烷古菌尚未被证实。评估的焦磷酸酶的动力学参数铜山thermophila,基因mthe_0236克隆到表达载体和相应的蛋白质过度繁殖大肠杆菌。发现一个乐队在35 kDa SDS凝胶后Strep-tactin亲和纯化(图1)。这是按照预计35 kDa的分子质量。焦磷酸酶的天然构象被凝胶过滤色谱法化验。原生酶的分子质量为71.4±5 kDa。因此,本机为焦磷酸酶。溶性二型焦磷酸酶的晶体结构枯草芽孢杆菌,链球菌gordonii,和变形链球菌透露,这些酶也在为他们的天然构象39,40]。

动力学分析表明,酶的U / mg与mg^{2 +}和你与Mn /毫克^{2 +}随着金属代数余子式(图2)。K_米值为页_我测量与Mn^{2 +}金属离子的催化中心和被发现毫米。正如前面指出的,CBS的存在域对指向可能调节核苷酸的酶活性。然而,我们的实验表明,焦磷酸酶不是抑制磷酸核苷酸或其最终产品:既不增加750μM AMP或5μM ADP也增加到1.5毫米磷酸导致反应速率降低。因此,结果表明,单一CBS域的可溶性焦磷酸酶中找到铜山thermophila没有参与酶活性的调节。相比之下,两个CBS域(称为贝特曼域(38)被发现在细菌的膜结合焦磷酸酶Moorella thermoacetica腺嘌呤核苷酸和抑制的证明(41]。

3.3。ACS的表征

的基因组铜山thermophila包含四个基因编码假定AMP-dependent ACS酶,三是衔接着定位(mthe_1194- - - - - -mthe_1196)。基因编码第四个假定的ACS是位于其他位置为一个单一的基因(mthe_1413)。此外,我们发现了一个基因编码一个假定的ADP-dependent acetyl-CoA-synthetase (mthe_0554)。

解开的ACS酶催化乙酸激活反应在活的有机体内,记录数量的各自的基因研究。中存在的实验表明,mthe_1194基因表达是最丰富的ACS(参见图S1在网上补充材料doi: 10.1155 / 2012/315153)。的转录水平mthe_1194相比高出2.6和2.0折的吗差距基因和基因编码S3P蛋白,分别。相比之下,其他ACS编码基因mthe_1195和mthe_1196显示23倍,37-fold记录相比,浓度降低mthe1194,分别。单基因的表达mthe_1413只是略低于表达吗mthe_1194的信使rna含量,而假定的ADP-dependent acetyl-CoA-synthetase,mthe_0554,是4000倍降低选择增长条件下,我们的化验检测极限附近。

问题出现了ACS编码基因mthe_1194 - 1196被组织在一个操纵子。仔细观察表明,基因是由至少包含潜在的转录起始元素的300个基点(塔塔和BRE盒)。因此,该基因的组织集群进一步分析中存在使用桥接引物对基因间区域从一开始和结束的acs基因。用这项技术,我们可以检测的基因之间的信使rna,覆盖了基因间区域。中存在的结果清楚地表明,基因间区域之间mthe_1195和mthe_1196是转录基因本身一样的程度,表明mthe_1195和mthe_1196(见图S1)转录在一起。基因间区域之间mthe 1194和mthe_1195没有记录可以被检测出来。因此,它是非常可能的mthe_1194代表一个转录单位。

ACS的编码mthe_1194乙酸被发现是最大量表达激活酶,是在大肠杆菌和相应的蛋白质通过Strep-tactin亲和层析纯化。sds - page和银染色显示一个乐队在大约75 kDa,这是按照预测分子质量(图1)。

酶的测量显示,Mthe_1194是耐热酶保留85%的原始活动以来孵化后30分钟(图55°C3)。的最佳生长温度铜山thermophila是55°C,因此被选为所有酶标准温度测量。在一个耦合的分析AMP的形成通过辅助NADH氧化的酶(见部分2)最大活动21.7 U /毫克是测量K_米值在0.4毫米醋酸。另一种分析利用焦磷酸盐的检测导致最大活动28 U /毫克。这个测试也用于确定K_米ATP和推广价值,被发现是20μM和14.5μM,分别。区分ACS Mthe_1194是否只在醋酸的激活参与能量代谢和脂肪酸的新陈代谢,底物谱进行了测试。像预期的那样从一种酶参与能量代谢,酶醋酸专门转换到相应的硫代酸酯。与丙酸反应也观察到但具体活动相比只有1%醋酸的反应性。丁酸盐不作为ACS的衬底。观察到AMP, ADP、ATP或P_我没有抑制Mthe_1194。相比之下,最终产品页_我导致酶活性的抑制作用。焦磷酸的0.25毫米导致反应速率的降低50%。

醋酸活化反应的一个核心问题铜山thermophila是能量释放ATP水解的AMP和焦磷酸(2)就足以驱动激活反应还是有必要另外水解两种无机磷酸盐的焦磷酸(3)[42]:

因此,形成乙酰辅酶a的活化能Mthe_1194决心。为此,20到92°C之间的反应速率测定和具体活动策划的自然对数与绝对温度的倒数值。活化能的计算是使用(4)和30焦每摩尔。 在哪里通用气体常数和吗斜率(R= 8.314 J摩尔⁻¹K⁻¹,米=−3535 5 K⁻¹)。

4所示。讨论

产甲烷古菌执行aceticlastic甲烷生成正生活在热力学极限这个反应的自由能变化只是−36焦每摩尔。醋酸酯分解的第一步是激活。提出,这一步在两个不同属能够生长在醋酸,甲烷八叠球菌属和Methanosaeta。为甲烷八叠球菌属sp。,好了,醋酸酯激酶/ phosphotransacetylase系统用于激活(43,44]。细菌的来源和收购甲烷八叠球菌属sp.通过横向基因转移(45]。乙酸在这个通路被激活与伴随的乙酰磷酸水解磷酸ADP和ATP。在随后的步骤中,乙酰磷酸转化为乙酰辅酶a没有进一步的ATP。总的来说,一个ATP等效水解。为Methanosaetasp。然而,醋酸激活反应更模糊。的基因序列铜山concilii和铜山thermophila表明,乙酸激酶/ phosphotransacetylase酶系统在这些生物(缺席23,46]。此外,这些酶活性不能发现在细胞中提取的铜山concilii(17]。相反,它提出了一个AMP-dependent乙酰辅酶a合成酶催化这个反应(18]。Jetten等人净化这些酶之一铜山concilii(18)乙酸转化乙酰辅酶a,从而水解ATP AMP和PP_我。与可溶性焦磷酸酶的活性由同一组(纯化25这种模式的激活需要两个ATP水解的等价物。然而,厌氧呼吸链Methanosaeta sp。据说无力支持两个以上的ATP的生成醋酸分子从一个分子(24]。因此,它是相当有趣的这些生物如何生成代谢能量的增长。为了克服这一矛盾,我们评估醋酸激活反应铜山thermophila。

基因组的铜山thermophila五个不同的假定的ACS酶编码4被注解为AMP-dependent ADP-dependent和一个。到目前为止ADP-dependent acetyl-CoA-synthetases从未被证明有效的方向乙酰辅酶a的形成在活的有机体内。然而,这种可能性被认为是由于其充满活力的细胞。然而,存在实验清楚地表明,各自的基因不表达了在指数增长阶段。因此,由于醋酸激酶/ phosphotransacetylase系统缺失,醋酸激活铜山thermophila可能是催化AMP-dependent ACS。它可以显示四种基因编码AMP-dependent ACS之一,mthe_1194,是最丰富的表达。因此,相应的蛋白质过度繁殖和特征。参与能量代谢被事实验证醋酸是迄今为止最好的底物,也可以表明ACS的酶Methanothermobacter thermoautotrophicus(47]。还K_米醋酸ATP值很低,这意味着激活通过Mthe_1194低能条件下甚至是可能的。抑制由放大器已被证明,但没有出现在这种情况下(18,48]。而页_我其他反应产物,也已被证明能够抑制ACS酶(18,48)可以降低反应速率50%浓度的0.25毫米。因此,积累过量乙酰辅酶a的ATP消费是避免在细胞质中铜山thermophila。

的近亲属铜山concilii包含五个基因编码假定的AMP-dependent ACS酶(46]。ACS的铜山concilii以前从细胞中提取纯化和特征,显示出类似的酶性质的ACS特征研究[18]。然而,根据最近的基因组测序,现在还不确定这五个ACS同功酶的纯化铜山concilii,或者五个高度同源酶的混合物(身份≥58%)。

的发现页_我生成醋酸在激活反应导致PP的问题如果在水解释放的能量_我是消散热量或如果它是(至少部分)用于节能。如上所示,的基因组铜山thermophila只包含一个焦磷酸酶基因编码一种可溶性二焦磷酸酶(Mthe_0236)。我们不等的过度繁殖的酶大肠杆菌和生化特征表明,酶确实具有可溶性II型焦磷酸酶的特点。

凝胶过滤层析的结果表明,焦磷酸酶铜山thermophila为活跃。相比之下,焦磷酸酶纯化铜山concilii被发现的heterotetramer凝胶过滤色谱法和sds - page分析(25]。然而,只有一个基因编码一种可溶性II型焦磷酸酶的基因组铜山concilii(46),作为一个转录单位,而不是一个操纵子的一部分的结构。人们很容易推测铜山concilii转译后修饰发生和生产两种形式的蛋白质或较小的蛋白质的蛋白水解乳沟退化的第一阶段在一个正常的人事变动的过程。本机构象与三、四单元被发现的II型可溶性焦磷酸酶Methanocaldococcus jannaschii(49]。相比之下,可溶性II型焦磷酸酶纯化从细菌是由单个子单元和形式为(39,40]。因此,焦磷酸酶铜山thermophila类似于细菌酶亚基组成。

焦磷酸在酶反应形成各种代谢途径(如DNA、RNA和蛋白质生物合成),随后应该是由焦磷酸酶水解总反应平衡转向产品的形成。然而,这种观点可能过于严格,因为大量的代谢能量散失和释放热量。相反,它是有可能的,一些能源的页_我酐键可能是守恒的。例如,通过耦合PP的水解_我的磷酸化细胞化合物从而形成能源丰富的生物合成的中间体。这样的酶已经被发现在许多生物体,如PP_我端依赖磷酸果糖激酶的sulphur-reducing archaeonThermoproteus tenax(50)、细菌等甲基球菌属capsulatus(51),Methylomicrobium alcaliphilum(52),包柔氏螺旋体burgdorferi(53),和原生动物痢疾阿米巴(54]。另一个显著的例子是丙酮酸磷酸dikinase,催化丙酮酸之间的可逆反应,三磷酸腺苷和磷酸烯醇丙酮酸磷酸,AMP和焦磷酸。在别人已经发现的t . tenax(55),拟杆菌共生(56),而小双孢菌属rosea(57]。基因编码页_我端依赖激酶尚未基因组的注释铜山thermophila。然而,从基因推导的氨基酸序列mthe_1637显示较低但显著的同源性(2×e的创造价值⁻⁴⁰)丙酮酸磷酸dikinaset . tenax。

这个问题是否页_我完全由焦磷酸酶水解在吗铜山thermophila还是能源丰富的分子的一部分用于磷酸化反应还不清楚,在未来将会检查。然而,焦磷酸酶的动力学参数铜山thermophila是有趣的。K_米页的值_我上述pyrophosphate-scavenging酶一般介于0.2和0.015毫米,因此以下K_米这里描述的焦磷酸酶的0.3毫米。这意味着这些部分可以利用焦磷酸盐的释放过程中aceticlastic甲烷生成,从而导致高集团的代传递潜在的中间体,随后为节约能源做出贡献。

总之,它可以表明,乙酸激活反应铜山thermophila需要两个ATP等价物/醋酸分子。这不能排除PP的一部分_我生成的在这个过程中可能会用一个未知的酶磷酸基转移到一个中间代谢物。进一步调查的节能机制Methanosaetasp.需要了解这些生物体的热力学限制生活可以茁壮成长。

确认

作者感谢伊丽莎白·施瓦布技术援助和保罗Schweiger的批判阅读手稿。这项工作是支持的德意志Forschungsgemeinschaft (DE488/10-1)。

补充材料

引用

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