装配之间的复杂的古细菌核糖核酸酶P RPP30和Pop5的蛋白质

文摘

核糖核酸酶P是一个高度保守的核糖核蛋白酶表示理解复杂大分子rna蛋白质相互作用模型。古细菌核糖核酸酶P由一个RNA和蛋白质五(Pop5, RPP30, RPP21、RPP29 RPP38 / L7Ae)。四个蛋白功能双(Pop5-RPP30和RPP21-RPP29)。我们使用核磁共振(NMR)光谱和等温滴定量热法(ITC)描述Pop5之间的交互和RPP30 hyperthermophilic archaeon海床furiosus(空斑形成单位)。NMR骨干共振作业的免费RPP30 (kDa 25日)表明,溶液中的蛋白质结构良好,与二级结构匹配观察晶体结构密切相关。化学位移扰动的除了Pop5 (kDa 14日)披露其绑定RPP30表面。ITC实验证实净1:1化学计量学这紧密的蛋白质相互作用,表现出复杂的等温线,表明高阶绑定。事实上,光散射和尺寸排阻色谱法数据揭示了复杂的存在作为一个78 kDa heterotetramer Pop5和RPP30各两份。这些结果将告知未来努力阐明Pop5-RPP30复杂的功能作用在核糖核酸酶P装配和催化作用。

1。介绍

核糖核酸酶P (P)核糖核酸酶是一种核糖核蛋白(RNP)复杂主要负责裂开5′领袖precursor-tRNA序列(pre-tRNA)分子在生活的所有领域1- - - - - -3]。核糖核酸酶P RNA亚基(RPR)构成了毫克^{2 +}端依赖催化一半和支持pre-tRNA乳沟在体外(4- - - - - -6]。细菌核糖核酸酶P全酶含有一个大弹性分组环和一个保守的蛋白质(蛋白质、核糖核酸酶P RPP)是必不可少的功能在活的有机体内(7]。细菌RPP艾滋病RPR催化增加全酶对底物的亲和力和Mg^{2 +}代数余子式(8- - - - - -11]。Eukaryal和古细菌基因组编码序列同源染色体的细菌RPP12]。相反,eukaryal和古细菌核糖核酸酶P全酶组成多个齿槽(10 5在真核生物和古菌)和一个弹性分组环(12,13]。

已知的热点rpp Pop5 eukaryal蛋白质同源,RPP21, RPP29, RPP30, RPP38 [21- - - - - -23]。重组表达rpp组装的在体外转录同源RPR重组几个古生菌的全酶,包括Methanothermobacter thermoautotrophicus(m)[24,25]海床horikoshii(越南河粉)[23),海床furiosus(空斑形成单位)[26),Methanocaldococcus jannaschii(Mja)[25,27),而产甲烷球菌属maripaludis(22]。调整研究Mja,m,和空斑形成单位核糖核酸酶P表明四齿工作在两个不同的组:Pop5 RPP30和RPP21 RPP29(指定Pop5-RPP30 RPP21-RPP29, resp)。这一发现与rpp酵母2台混合动力分析的结果是一致的与其他古生菌(m(28),越南河粉(29日])和真核生物酿酒酵母(南加州爱迪生公司)][30.),这表明绑定这些对蛋白质之间的相互作用。动力学研究继续提供洞察这些二进制的功能性角色RPP情结;例如,single-turnover实验m核糖核酸酶P显示Pop5-RPP30增加60倍的速度pre-tRNA乳沟RPR和RPP21-RPP29提高底物亲和力的15倍(25]。虽然各种生化研究演示功能的RNA和蛋白质亚基之间的合作的热点核糖核酸酶P [18,22,25- - - - - -27,31日)、高分辨率结构完全理解至关重要的总成全酶和rpp在协助RPR催化的作用。

x射线晶体学、核磁共振光谱(NMR)曾以确定几个古细菌齿槽的结构,包括RPP29m(24),Archaeoglobus fulgidus(32),越南河粉(33),而空斑形成单位(34),Pop5从空斑形成单位(35),越南河粉(36),越南河粉RPP30 [37),RPP21从越南河粉(38),空斑形成单位(39]和RPP38 / L7Ae [40,41]。RPP21-RPP29二进制结构复杂的晶体学得到的越南河粉(36),通过核磁共振空斑形成单位(34),和越南河粉Pop5-RPP30一对通过晶体学(14]。

我们的特点空斑形成单位Pop5-RPP30交互利用核磁共振光谱和等温滴定量热法(ITC)。骨干共振作业已经获得214 -残渣空斑形成单位RPP30(图1)在其自由状态。尺寸排阻色谱(SEC)和动态光散射(DLS)数据表明,自由单体的蛋白质,和中学化学变化是一致的与先前观察到的二级结构越南河粉RPP30 [37]。添加Pop5均匀¹³C /¹⁵N-labeled RPP30诱发许多特定场地杂环的NMR谱的变化,导致大多数共振的重要拓展。化学位移扰动揭示Pop5绑定RPP30表面,和补充以前的化学位移扰动映射Pop5 (35]。核磁共振和美国国际贸易委员会的数据表明,这两种蛋白质形成一个紧密的1:1复杂,而证券交易委员会和DLS数据显示空斑形成单位Pop5-RPP30复杂heterotetrameric在一系列的实验条件。我们讨论这些发现可能的功能的影响。

2。结果

2.1。低聚物的状态

尺寸排阻色谱法和动态光散射被用来确定的低聚物的状态Pop5-RPP30复杂(图2)。免费的空斑形成单位RPP30筛选了从凝胶过滤柱的表观分子量24 kDa,匹配它的单体质量(24495 Da)。RPP30混合物的过量的Pop5取得了两座山峰,一个对应于单体的Pop5 (13839 Da)和其他淋洗的表观质量超过异质二聚体。动态光散射测量显示空斑形成单位RPP30和Pop5时每个单分散和单体的唯一解决方案(数据未显示),而1:1 Pop5-RPP30复杂的水力半径~ 3.65 nm,相应的计算heterotetramer [(Pop5-RPP30)₂使用HYDROPRO []18)(图2)。尽管复杂似乎总在pH值6以上,这是单分散的较低的pH值(和在各种实验条件下)。这些发现在赞同heterotetrameric晶体中观察到的状态越南河粉Pop5-RPP30复杂(14]。

2.2。骨干共振自由RPP30的作业

空斑形成单位RPP30样本高度溶于各种缓冲条件55°C,收益率的说法NMR谱的一个结构良好的蛋白(数据的说明3(一个)和3 (b))。然而,光谱质量退化显著较低温度(例如,25°C),或许反映出非特异性聚合(数据未显示)。因为55°C被发现的组装和活动的最佳温度空斑形成单位核糖核酸酶P全酶(26)和高质量的光谱可以在那个温度,获得核磁共振实验都是在55°C。

蛋白质的214年原生残留(图1),193骨干酰胺共振可以分配(图3)。不包括9个脯氨酸残基,这代表了大约94%的可转让的骨干共振。大多数未赋值的残留物是毗邻势函数。残留137 - 142组成的螺旋α6,α6 -α7回路是由势函数在136年和143年。强烈信号观察第一8氨基端残留,表明这些是高度灵活的解决方案。二级结构特征预测分析的支柱化学变化使用塔洛斯+ (19)(图4)。二级结构特征匹配与蒂姆桶折叠晶体结构的观察越南河粉RPP30,符合他们的高度的序列同源性(68%的身份,82%的相似度15])。

2.3。骨干共振与Pop5 RPP30的复杂的作业

免费的蛋白质相比,溶解性的空斑形成单位Pop5-RPP30缓冲条件和复杂的更敏感模式的准备。数据收集在低温下证明了棘手的光谱质量显著下降,而可判断的光谱可以被记录在55°C(图5)。光谱[U -¹⁵N,¹³C] -RPP30在复杂与Pop5 pH值5,55°C仍然分散但高度重叠由于谱线宽度的增加造成heterotetramer旋转相关时间越慢。骨干的RPP30作业跟踪获得的复杂与Pop5 C^α连接在HNCA和HN (CO) CA光谱,利用自由RPP30作业作为起点,与HNCO光谱来解决一些模棱两可。由于谱线宽度的增加和信号重叠的heterotetrameric复杂,只有180名骨干RPP30酰胺共振(~ 88%)可以分配。

2.4。Pop5-Induced化学位移扰动

的未标记的Pop5 RPP30诱导改变许多RPP30酰胺化学变化(图6)。化学位移扰动模式反映了不对称相互作用中的每个RPP30和两份Pop5 heterotetramer(图7)。的晶体结构越南河粉Pop5-RPP30 heterotetrameric复杂(14],RPP30原体不互相接触,但接触Pop5的原体,埋近3800²。Pop5-RPP30接口是由α6,之间的循环β7和α8,以及α8 RPP30,联系螺旋线α1 -α3 Pop5的两个副本。在越南河粉晶体结构,增加联系人之间观察到的非结构化的n端Pop5和螺旋线α4和α5 RPP30(蓝色的图7)。而空斑形成单位核磁共振数据通常是一致的越南河粉晶体结构,它们表明,只出现在第一个界面上面提到的解决方案。

大化学位移扰动可以映射到主要Pop5-RPP30接口,组成α6和α8的空斑形成单位RPP30(图6和7)。酰胺残留Gly180, Lys182、Leu187 Gly188, Ala190经验特别大¹H转变扰动(Δδ¹H > 0.3 ppm;数据6和7);这些大的扰动可以归因于强劲的环电流的影响由于对芳香残留Tyr78和Phe82包装α3 Pop5或位置的变化对芳香残留Trp27和Phe28 RPP30(图8)。残留Arg179、Ser186 Leu187, Ile191每个经历大的扰动¹⁵N化学变化(Δδ¹⁵N > 2.5 ppm)。这些¹⁵N扰动不敏感的芳环电流的影响(42),也可能是由于sidechain取向或局部骨架构象的变化。

除了这个接口,的晶体结构越南河粉复杂的揭示了一个小Pop5-RPP30接口的氨基端部分α7的RPP30联系人α2 Pop5, Pop5联系螺旋线的氨基端残留α4和α5 RPP30 [14]。虽然空斑形成单位RPP30骨干作业不完整的氨基端部分α7,这个地区的残留分配确实显示重要的化学位移扰动,与heterotetrameric模型一致。不像α7,所有nonproline残留的α4和α5分配但没有表现出显著的化学位移扰动。这个观察表明,氨基端地区空斑形成单位Pop5不会让亲密的接触空斑形成单位RPP30,虽然不是heterotetramer模型的支持,是一致的(i)高晶体温度因素Pop5的n端观察到的越南河粉复杂的(14),(2)标记的补充解研究的结果空斑形成单位Pop5绑定到无标号RPP30,这个地区被观察到的主要缺失或存在的非结构化RPP30 [35]。因此,化学位移扰动与形成一致空斑形成单位Pop5-RPP30 heterotetramer,他们提供额外的洞察分子间接触的相对亲密的两组观察结晶学的越南河粉复杂。heterotetrameric复杂的完整性得到水动力(见上图)和热力学数据(见下文)。

2.5。热力学的Pop5-RPP30交互

Pop5-RPP30交互分析的热力学等温滴定量热法(ITC)。前两个滴定表明蛋白质形成一个复杂的高亲和性的整体化学计量学1:1在缺乏其他核糖核酸酶P组件(人物9(一个)和9 (b))。在这些条件下获得的曲线适合到一个站点模型但不揭示热力学签名形成预期的2:2复杂。一组额外的滴定进行更高怀斯曼“c”值(43较小的注射更仔细辨别更复杂的绑定模式的存在。显然这些滴定显示多个绑定模式结合化学计量学的~ 1,符合预期2:2绑定交互。尽管数据可以适合曲线对应于two-site绑定模型,考虑到三个分子间界面观察到复杂(一个Pop5-Pop5接口,和两个Pop5-RPP30接口,数字7 (b)),可能需要一个更复杂的绑定机制来解释热力学数据;探索这种模式的细节超出本研究的范围。滴定表现在低离子强度(10毫米醋酸钠)表现出较弱的绑定(124和3.5 nM)和不利于绑定焓比在高离子强度(140毫米,160毫米,乙酸+盐)。这些观察是一致的一个重要贡献绑定从疏水效应预测从观察到分子间界面的性质14,35]。

3所示。讨论

3.1。化学计量学和折叠的齿槽二元复合物

这些生物物理相互作用的调查空斑形成单位核糖核酸酶P蛋白Pop5 RPP30提供了明确的证据形成的紧张2:2 Pop5-RPP30没有其他复杂的解决方案空斑形成单位核糖核酸酶P组件。核磁共振化学位移扰动映射的绑定接口Pop5 RPP30。与之前报道的化学位移扰动Pop5 [35),这些结果证实晶体的观察越南河粉Pop5-RPP30 [14)一般适用解决方案密切相关空斑形成单位Pop5-RPP30,除了NMR数据不显示证据RPP30之间的相互作用和高度保守的,相对非结构化Pop5 n端。的发现heterotetrameric Pop5-RPP30一对与其他的观察热点RPP一对,RPP21-RPP29,形式只是一个异质二聚体,在晶体和解决方案(34,36]。

这些二元配合物的另一个显著区别是在绑定的影响个人的结构蛋白质。核磁共振的研究空斑形成单位RPP21和RPP29单独作为一个复杂的,显示无序区域出现在这些蛋白质折叠在heterodimerization [34,39]。这些结构性变化,生成蛋白质界面至关重要,尤其在RPP29 52个新(124)骨干酰胺共振,与残留α螺旋线是观察到的¹⁵N-edited RPP21-RPP29复杂的光谱。不像空斑形成单位RPP21 RPP29,的结构空斑形成单位Pop5和RPP30似乎也没有其他的形成。有趣的是,尽管紧接口由结构化的互动合作伙伴的核心空斑形成单位Pop5-RPP30和RPP21-RPP2914,34,36],两个配合物显示一个或多个非结构化的末端,丰富的基本的残留物,这可能在RNA扮演关键角色绑定。

3.2。必要性二进制RPP复合物的形成

多元复合物的组装代表一个细胞组合的挑战。在这方面,一些核糖核酸酶P的预装配组件可能会带来一些优势。首先,用更少的个人rna蛋白质绑定步骤,发展到最后,本地全酶是促进。第二,如果形成形成(如RPP21-RPP29)是生成RNA结合的平台,那么个人的亲和力子单元的RNA可以显著增加采用二进制情结;这种策略可能有助于消除错误折叠rna提供结合位点只有一个蛋白二聚体,或限制个人蛋白质绑定到意想不到的目标。这些想法的最近的研究很好地说明了RPP20-RPP25复杂,与人类rna P和MRP (44,45]。ITC实验表明人类RPP20-RPP25的亲和力的P3螺旋同源MRP RNA增加1000倍,相对于那些观察RPP20或RPP25 [44]。符合这一发现,水晶的结构酿酒酵母Pop6-Pop7二聚体(同源人类RPP20-RPP25)绑定到RNA核糖核酸酶MRP的P3域显示对比了POP6和POP7二进制复杂位置各自RNA结合表面的合作和P3螺旋的特定识别(45]。

3.3。可能的角色Pop5-RPP30 Heterotetramer

虽然很容易欣赏两两齿之间的交互的实用程序,的功能意义空斑形成单位Pop5-RPP30 heterotetramer目前不清楚。在研究这个问题越南河粉核糖核酸酶P, six-residue内部缺失突变体越南河粉Pop5检查以其能力heterotetramers和重建活动14]。删除残留对应Pop5螺旋之间的循环α1,α2,两者之间构成一个接口的Pop5副本越南河粉Pop5-RPP30 heterotetramer晶体结构。虽然这越南河粉与RPP30 Pop5突变体组装成一个异质二聚体,据报道不支持RPR-mediated pre-tRNA劈理(数据没有显示在14])。然而,由于核糖核酸酶的突变可能会影响其他意想不到的方面P装配或功能,很难得出结论是否heterotetrameric Pop5-RPP30形式确实是核糖核酸酶P所需的活动。

如果Pop5-RPP30 heterotetrameric完全组装古细菌核糖核酸酶P对称考虑认为全酶(RNA +蛋白质)也是二聚的。目前,个别子单元的化学计量学和古细菌核糖核酸酶P全酶的分子量决定。没有这些数据,见解可能从先前的发现eukaryal和eubacterial核糖核酸酶P变体。

各种实验观察结果提示对高阶结构在真核酵母核糖核酸酶p . 2台混合动力的研究建立了self-association不同的人类/酵母齿槽,导致预期,这些子单元的多个副本可能出现在各自的家乡全酶(30.,46]。蛋白质定量SYPRO红宝石荧光染色的核糖核酸酶MRP, RNP复杂参与核糖体rna和mRNA加工与核糖核酸酶P[共享多个蛋白亚基47),表明九的多个副本的十个蛋白质亚基与MRP RNA (48]。需要额外的实验证据来证实和扩展这些化学计量的估计。

暗示功能二聚作用也出现在生物化学和生物物理的研究eubacterial核糖核酸酶p小角x射线散射(粉煤灰)的研究显示,虽然枯草芽孢杆菌核糖核酸酶P RNA存在单体溶液中,加入全酶的辅因子导致形成同源蛋白质二聚体(49,50]。齐聚反应状态敏感离子条件下,二聚体和单体青睐在低和高离子强度,分别。此外,在低离子强度,观察全酶二聚物在添加单体的分离pre-tRNA衬底,而单体的混合物和二聚的ES复合物观察添加二聚的衬底。

虽然没有直接的实验证据的核糖核酸酶P二聚体在活的有机体内,50海里(0.1 M NH的价值₄Cl)二聚作用的报道枯草芽孢杆菌核糖核酸酶P将允许形成二聚体的胞内细菌核糖核酸酶的浓度估计P(多达42海里枯草芽孢杆菌(50)和680海里大肠杆菌(51])。从全酶二聚体中可能的回报,锅和同事认为合作衬底绑定和成熟期间持续的增加多顺反子记录包含多个转运rna(例如,最大的tRNA操纵子枯草芽孢杆菌码21图示)。是否多顺反子基质积聚在稳定状态还不清楚,鉴于各种核酸酶的共同行动(例如,在某些细菌核糖核酸酶E [52,53)简化任务的核糖核酸酶P从多顺反子前体生成单体的中间体。

低聚核糖核酸酶P可能除了持续带来收益。RNA的半衰期一半可能增强在高阶RNP复杂。或者,某些低聚物的状态,即使只由弹性分组环和部分套齿槽,可能代表不活跃的形式,防止非特异性乳沟意想不到的细胞rna或中间体准备组装到全酶。显然是需要进一步的研究来全面理解的功能相关性低聚物的形式的核糖核酸酶P。

4所示。材料和方法

4.1。蛋白质制备

除非另外注明,Pop5 RPP30参考空斑形成单位蛋白质中。未标记的Pop5 (NP_579107)和RPP30 (NP_579643)样本准备如前所述35];Pop5 Cys72Ser变体的用于本研究由于其降低了聚合的倾向。均匀双标记RPP30 ([U -¹³C,¹⁵N] -RPP30)从细胞生长在M9纯化基本培养基补充1% (v / v)鹰基底维生素混合(生活技术,马里兰州)[54),含1 g / L¹⁵N氯化铵作为唯一氮源和3 g / L¹³C葡萄糖为唯一碳源。最后RPP30蛋白质使用包括三个额外的残留物(Gly-Glu-Phe) n端,后保持TEV的蛋白酶裂解(他的)₆麦芽糖结合蛋白标记用于亲和纯化。标签RPP30透析到核磁共振缓冲区(10毫米醋酸钠,pH值5,0.02% (w / v)叠氮化钠)和集中到1毫米。D₂O增加了5% (v / v)。标记蛋白透析在室温下了3天到核磁共振的缓冲,以确保完整的平衡为国贸做准备。

4.2。凝胶过滤

尺寸排阻色谱法进行每个蛋白质单独和RPP30与过多的Pop5混合。蛋白质透析到核磁共振缓冲与500毫米氯化钠和运行在一个Hiload superdex 16/60 - 200凝胶过滤柱(通用电气医疗集团)。

4.3。动态光散射

动态光散射(DLS)被用作初步屏幕识别条件,产生良好的核磁共振光谱。100年DLS被透析准备样品μ每个蛋白质(90 Lμ米)到每个缓冲区(图进行测试2)。化学计量的Pop5然后慢慢用移液器吸取到RPP30导致45μ样本的复杂。0.22每个样本过滤μ过滤器(合演旋转x离心管过滤器,康宁Inc .)与dynapro - 801分子大小和分析仪器(蛋白质的解决方案,Inc .)。每个样本的行为进行的估计水力半径,以及较低的多分散性在半径(polyD / r)。多分散性代表的粒度分布宽度,因此低polyD / r值表示一个均匀的混合物。缓冲条件采样pH值范围从3 - 8的增量0.5;报道的平均值和标准偏差值18测量(图2)。DLS从0到1 M氯化钠盐浓度测量表明,蛋白质250毫米以上聚集的倾向,氯化钠(数据没有显示)。低于250毫米氯化钠,DLS测量范围从50到500的蛋白质浓度μM是符合一个heterotetrameric物种。

4.4。准备Pop5-RPP30复杂

核磁共振的标记样本与无标号Pop5 RPP30复杂由透析每个蛋白质单独成一个缓冲区包含10毫米醋酸钠(pH值5)0.02% (w / v)的叠氮化钠。575年和1575年RPP30和Pop5集中μM,分别。克分子数相等的数量的每个蛋白质混合慢慢利用光谱/ CE透析管运动100000 MWCO(光谱实验室、公司)。最终的解决方案产生了一个Pop5-RPP30复杂的浓度达到425μ在缓冲区包含10毫米醋酸钠(pH值4),0.02% (w / v)的叠氮化钠。在核磁共振实验中,D₂O增加了5% (v / v)。免费的U - (¹³C,¹⁵N] -RPP30(0.5毫米)准备在同一个缓冲区直接比较RPP30核磁共振光谱、自由和必然Pop5。

4.5。核磁共振光谱学

三重共振TROSY [55)光谱(HNCO HNCA、HNCACB CBCA (CO) NH) (56)被记录在U - (¹³C,¹⁵在pH值5 N] -RPP30骨干共振作业。三重共振光谱没有TROSY效果(HNCO HNCA,环(CO) CA, CBCA (CO) NH) (56)被记录在U - (¹³C,¹⁵N] -RPP30在复杂与无标号Pop5 pH值4骨干作业的复杂。所有在55°C NMR实验进行力量drx - 600光谱仪配备了低温冷却三重共振单轴梯度调查。数据处理NMRPipe [57使用NMRViewJ[]和分析58]。自由RPP30骨干作业是通过手动检查数据,概率交互网络的协助下的证据(松树)算法(59]。Pop5-induced化学位移扰动对RPP30量化使用酰胺的化学位移不同¹H和¹⁵N的共振频率为(20.]。免费分配和Pop5-bound RPP30存入BioMagResBank (BMRB:http://www.bmrb.wisc.edu/分别加入)与数字17189年和17190年。

等温滴定量热法,(ITC)
蛋白质浓度测定吸光度在20毫米280海里磷酸钠(pH值6.5),6米guanidium盐酸使用摩尔消光系数预测的氨基酸序列(60]:RPP30ε_280年= 28590,Pop5ε_280年= 19750。

第一组滴定Pop5(87.2执行μ滴定到RPP30 (9.89 M)μM和4.95μ米)(图9(一个)和9 (b)、职责)。滴定都表现在55°C MicroCal VP-ITC微热量计,第一次注射是5μL和所有后续注射10μL与240秒注射;第一个5μ从分析L注入被丢弃。热稀释估计的平均过去3到5 nonreacting注射Pop5过剩的注入饱和RPP30。滴定是在没有(图进行9(一个))和130毫米氯化钾(图的存在9 (b))。数据是适合一个站点模型与原点软件v . 7 (MicroCal, Inc .)获得绑定化学计量学n,缔合常数焓ΔH,绑定。尽管这些数据显示净1:1化学计量学,他们不能区分1:1的异质二聚体2:2 heterotetramer的化学计量学。

揭示形成heterotetrameric的热力学特征复杂,第二组进行滴定,旨在改变怀斯曼“c”值(43]。当Pop5 (148μ滴定到RPP30 (14.8 M)μ米)在缺乏盐(图9 (c)),第一次注射4μ7.5 L和所有后续注射μ注射L, 400年代之间。150毫米的滴定氯化钠(图9 (d)2.5)第一次注射μL和所有后续注射5μL与350年代之间的注射。注射成交量减少为了增加观察多个结合位点的可能性。数据被起源适合two-site模型软件v . 7 (MicroCal, Inc .)。

4.6。同源性建模

的同源性模型空斑形成单位Rpp30被线程获得其氨基酸序列的坐标越南河粉RPP30 (PDB项2 czv链b) (14)使用瑞士模式(61年]。一个模型的空斑形成单位heterotetramer被调整的坐标组装空斑形成单位Pop5 [35)与相应的坐标越南河粉Pop5在同一坐标设置(2 czv链c, d)。叠加和表面进行了计算与Pymol (http://www.pymol.org/)。

确认

作者感谢培养和格帕兰实验室成员的热烈的讨论和技术援助;m·亚当斯(雅典乔治亚大学),j·威廉姆森(斯克里普斯研究所的拉霍亚,CA),和d·沃(贝塞斯达国家癌症研究所)价值的试剂;俄勒冈州立大学和俄亥俄州立大学()校园化学仪器中心员工关于核磁共振仪器的帮助。这项工作是由NIH的GM067807诉格帕兰和m·p·福斯特和资助MCB 0843543从NSF诉格帕兰;b·l·克罗和r·c·威尔逊被NIH Chemistry-Biology接口支持部分培训格兰特(T32 GM008512);r·c·威尔逊收到了来自美国心脏协会的额外支持博士前的奖学金。

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