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辛西娅·j . Sakofsky劳拉·a . Runck丹尼斯·w·甘, ”<年代pan class="adjust-article-svg-size">硫化叶菌突变体,通过PCR产物生成,而缺乏公认的酶的紫外线Photoproduct修复”,古生菌, 卷。2011年, 文章的ID864015年, 12 页面, 2011年。 https://doi.org/10.1155/2011/864015
硫化叶菌突变体,通过PCR产物生成,而缺乏公认的酶的紫外线Photoproduct修复
辛西娅·j·Sakofsky,<年代up>1 劳拉·a·Runck,<年代up>1 和 丹尼斯·w·甘
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1辛辛那提大学生物学系,614年Rieveschl大厅,克利夫顿法庭,辛辛那提,哦,45221 - 0006,美国
文摘
为了确定的生物相关性两个美国acidocaldarius蛋白质的修复紫外线photoproducts,相应的基因(Saci_1227和Saci_1096)中断,和由此产生的突变体的表型被各种基因化验检查。同源重组的中断使用集成功能但不齐的火葬用的基因,由短序列两端通过PCR。disruptants的表型分析证实,ORF Saci_1227编码DNA光裂合酶的功能在活的有机体内,但是他们不能牵连ORF Saci_1096修复紫外线-或其他外部诱导的DNA损伤,尽管相似基因编码紫外线损伤内切酶。基因破坏的成功战略,利用PCR引物的5′扩展目标盒式集成,建议常规建筑的潜在优势硫化叶菌菌株。
1。介绍
基因库存hyperthermophilic古生菌(HA)表明,这深深分支进化枝原核生物可能采用的不寻常的分子在DNA复制和修复策略。例如,HA DNA酶和酶学性质有一定没有发现嗜中温古生菌和细菌。包括反向DNA促旋酶I型拓扑异构酶,介绍了正超螺旋DNA变成<一个href="#B1">1],family-B DNA聚合酶失速前专门dU残留的模板链(<一个href="#B2">2,<一个href="#B3">3]。相反,HA缺乏某些dna修复蛋白广泛保存于其他生物;他们没有编码同系物的DNA错配修复蛋白傻瓜和MutL [<一个href="#B4">4),他们也缺乏UvrABC同系物,调解核苷酸切除修复(尼珥)在细菌和嗜中温古菌(<一个href="#B5">5]。而哈做编码真核解旋酶同系物和structure-specific核酸酶,完成尼珥在真核生物的过程中,他们没有相应的蛋白质启动尼珥。这一事实没有HA编码同系物的已知NER-specific damage-recognition蛋白质似乎意义重大,因为这些蛋白质是尼珥函数所需的其他生物,和是唯一在真核生物蛋白质特定于尼珥。
然而,实验数据表明,HA可以从DNA切除紫外线photoproducts虽然机制和蛋白质负责尚未确定。生化分析表明时间损失环丁烷嘧啶二聚体基因组DNA的完好无损硫化叶菌solfataricus细胞在生理温度(<一个href="#B6">6,<一个href="#B7">7]。在硫化叶菌acidocaldarius结合化验,紫外线增强重组形成,说明嘧啶二聚体的转换不是recombinogenic本身,为增加注液电池转移的DNA损伤,重组,或两者兼而有之。此外,在生理温度衰减动力学的影响类似于紫外线photoproducts的浓度美国solfataricus(<一个href="#B6">6- - - - - -<一个href="#B8">8]。
此外,两个美国acidocaldarius基因编码的蛋白质预测修复紫外线photoproducts彼此独立的和尼珥。第一种是公认的ORF Saci_1227 DNA光裂合酶编码。的硫化叶菌tokodaii这种蛋白质的同系物photoreactivates DNA在体外(<一个href="#B9">9]。美国acidocaldarius展品高效光致复活作用在活的有机体内(<一个href="#B10">10),但基因产物负责这个实验尚未建立。第二个蛋白质,由Saci_1096编码,属于一个家庭的已知和假定的紫外线损伤内切酶(UVDEs)。这些酶发生在裂殖酵母的最合适粟酒裂殖酵母和抗放射性的细菌耐辐射球菌,在那里他们调解紫外线photoproducts[的另一个切除修复途径<一个href="#B11">11,<一个href="#B12">12]。在这个替代途径,磷酸二酯骨干被切断的5′端紫外线photoproduct,病变是被链置换合成(<一个href="#B11">11]。
当别人建议,hyperthermophilic古生菌,原则上,招募与亲和酶紫外photoproducts作为photoproduct-recognition蛋白质的NER-like修复这些损伤(尽管这不会解决其他形式的DNA损伤)(<一个href="#B6">6]。DNA光裂合酶似乎是一个合乎逻辑的候选人对这个角色,因为它应该绑定到紫外线photoproducts在黑暗中但仍无法在这些条件下修复它们。同时,这些不同的修复系统合作的先例,光裂合酶提高修复紫外线photoproducts尼珥的蛋白质大肠杆菌(<一个href="#B13">13]。
作为最直接的路线澄清这两个生物的角色美国acidocaldarius蛋白质,扰乱了相应的基因和我们感兴趣的突变体的表型特征。几个基因美国solfataricus和相关的硫化叶菌物种已经被插入一个中断功能火葬用的基因之间的部分硫化叶菌染色体(通常是几百个碱基对长)克隆的质粒载体。然后转化为结果的质粒火葬用的收件人,所选择的基因整合到硫化叶菌染色体通过同源重组<一个href="#B14">14- - - - - -<一个href="#B16">16]。尽管我们发现这种方法是有效的基因硫化叶菌acidocaldarius发表的研究表明,复合系统美国acidocaldarius还可以使用更短的DNA序列,即降至30 bp或更少(<一个href="#B17">17- - - - - -<一个href="#B19">19]。这表明需要一个质粒构建可能避免如果PCR引物被用来连接短侧面(即。,目标)序列的选择标记,这种技术已经被广泛用于酿酒酵母(<一个href="#B20">20.]。
在目前的研究中,我们演示了PCR-tailing方法的可行性美国acidocaldarius基因通过扰乱Saci_1227和Saci_1096基因单独用这种方法。我们继续测量突变体的表型特征属性相关修复紫外线photoproducts和其他DNA损伤。结果表明,Saci_1227编码功能的DNA光裂合酶美国acidocaldarius编码的。不管是这种蛋白质还是Saci_1096对于暗修复紫外线photoproducts至关重要。
2。方法和材料
2.1。品种、栽培和遗传操作
的美国acidocaldarius嘧啶营养缺陷型MR31 [<一个href="#B21">21)是生长在xylose-tryptone中补充了20毫克每升尿嘧啶,像前面描述的那样<一个href="#B22">22]。细胞被洗、沉淀保留和改变了电穿孔(<一个href="#B23">23]。线性DNA用于基因打靶pLK3a产生了PCR(见下文)。增加产品的长度(目标序列的反映公司)是经琼脂糖凝胶电泳,并使用离心膜集中器非公司引物被移除。Pyr<年代up>+转化株选择通过电穿孔混合物传播到盘子xylose-tryptone媒介缺乏尿嘧啶。殖民地孵化一周后出现条纹对选择性(uracil-free)介质隔离,和PCR证实了基因型分析(见部分<一个href="#sec3">3)。
恢复本地的功能美国acidocaldarius火葬用的基因在disruptants,自发的<年代vg height="15.6125" id="M1" style="vertical-align:-3.56265pt;width:54.762501px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.762501 15.6125" width="54.762501" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink">
2.2。DNA结构
构建质粒pLK3a,包含了<年代vg height="15.6125" id="M4" style="vertical-align:-3.56265pt;width:54.762501px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.762501 15.6125" width="54.762501" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink">
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构建一个repair-proficient美国acidocaldarius应变的初始disruptants相比,美国acidocaldarius trpC基因(Saci_1427)克隆的MCS pUC19(构造pPCBE12;见表<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/tab1/" target="_blank">1)被插入的中断<年代vg height="15.6125" id="M39" style="vertical-align:-3.56265pt;width:54.762501px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.762501 15.6125" width="54.762501" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink">
2.3。灵敏度分析
测量紫外生存与光致复活作用之后的程序之前的研究(<一个href="#B10">10,<一个href="#B25">25]。生长抑制化学药剂是评估的一系列0.15毫升文化包含连续1:2稀释测试的化合物。每一个文化都接种大约10<年代up>6细胞,增长得分三天后孵化在78°C - 80°C,以确定测试的最低抑制浓度(MIC)化合物。电离辐射是化验如前所述的生存<一个href="#B17">17];具体来说,细胞悬浮在无菌稀释缓冲和暴露于空间统一的通量的伽马射线<年代up>60有限公司源(辛辛那提大学核工程设备)。
2.4。遗传分析
自发的速度火葬用的确定突变如前所述25 - 30独立液体培养和电镀上的每个全部尿嘧啶+媒介上面描述的失落。每一组的平均每个文化的细胞数量的波动测试是由连续稀释和镀3 - 4的文化,和突变谱采样通过选择一个突变体从每个独立的文化和测序火葬用的基因,如前所述<一个href="#B26">26]。减少量化可变性,漏水的移码突变的表型在英国石油公司545 - 551年(<一个href="#B26">26)并不包括在光谱分析。
结合和重组被“标记交换”测量试验(<一个href="#B27">27在相同数量的细胞两个遗传学上截然不同的pyr突变体是uracil-free介质的混合和扩散在盘子里。Pyr的数量<年代up>+殖民地,形成规范化镀可行的细胞的数量,并纠正任何降级观察每个应变分别镀。刺激标记交换(SME)被执行测量紫外线照射和所有后续步骤在昏暗的红光,防止光致复活作用[<一个href="#B25">25]。同样,中小企业的衰退在生理温度测量,辐照细胞悬浮液在70°C在黑暗中各种混合时间长度和电镀,如前所述[<一个href="#B8">8]。
2.5。计算
失落的自发突变,阻力计算使用Ma-Sandri-Sarkar最大似然估计值(MSS-MLE) [<一个href="#B28">28),由FALCOR实现web界面(<一个href="#B29">29日]。输入参数是FOA-resistant菌落计数从每个独立的文化集(r)和平均每个文化的可行的细胞数(N)。变异率之间的差异进行评估统计使用单向方差分析(方差分析)。突变谱的样本来自相应的菌株进行比较统计上显著的差异使用hyper-G Cariello计划等。<一个href="#B30">30.]。
3所示。结果
3.1。基因的破坏
为背景的干扰美国acidocaldarius基因,我们选择火葬用的突变MR31由于一些基因特性:(i)的突变菌株(火葬用的131)删除18 bp火葬用的,因此没有回复,(ii) MR31丝毫没有剩余增长uracil-free媒体补充胰蛋白胨,和(3)压力展览正常OMP脱羧酶水平。最后一个属性与大多数自发形成鲜明对比火葬用的突变美国acidocaldarius,因为他们中的大多数是帧转移和施加极性的影响pyrF表达式[<一个href="#B21">21]。缺乏极性的火葬用的131提供了优势,尿嘧啶可以充分补充营养缺陷型反式只使用一个功能火葬用的基因,从而简化了扰乱单位建设。
总结了示意图,如图<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/fig1/" target="_blank">1(一)质粒pLK3a提供功能,但不同的来源火葬用的基因(<年代vg height="15.6125" id="M41" style="vertical-align:-3.56265pt;width:54.762501px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.762501 15.6125" width="54.762501" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink">
(一)
(b)
这些PCR产品electroporated MR31细胞,细胞被镀在选择性(uracil-free)媒介。Pyr<年代up>+转化株有了隔离在同一介质,和DNA提取纯文化进行了分析通过PCR和测序。结果证实,Saci_1227 Saci_1096位点和扩大转化株的预期数量的替代每个基因的中部地区美国solfataricus火葬用的基因和相关向量序列(图<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/fig1/" target="_blank">1 (b)巷1和2巷5和6)。使用内部引物PCR进一步证实每个吡定<年代up>+转化株完全失去了目标基因的功能副本(图<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/fig1/" target="_blank">1、巷3和4巷7和8)。另外PCR(图中未显示)也发现并列的预期方向和间距<年代vg height="15.6125" id="M44" style="vertical-align:-3.56265pt;width:54.762501px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.762501 15.6125" width="54.762501" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink">
3.2。表型测试
光致复活作用的菌株LR10并行计算与积极控制DG185(野生型)和DG251trpC::<年代vg height="15.6125" id="M45" style="vertical-align:-3.56265pt;width:54.762501px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.762501 15.6125" width="54.762501" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink">
(一)
(b)
Saci_1096中断在紫外线的影响生存也在这些条件下进行测试,但没有任何紫外线后白光照明。紫外线生存无显著变化的干扰中检测出应变LR12尽管广泛的紫外线剂量导致总体存活率约10<年代up>−4在最高剂量(图<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/fig2/" target="_blank">2 (b))。这一结果表明,不得修复photoproducts Saci_1096蛋白质美国acidocaldarius染色体。
调查是否Saci_1096基因产物可能发挥作用在其他修复DNA损伤,我们测量了MIC值应变LR12几种化学物品和化验并行控制压力。化合物选择产生不同的DNA损伤,从分子间interstrand DNA交联氧化或烷基化基地,笨重的芳香加合物。在这种情况下,破坏应变显示敏感的控制压力的所有代理(表进行测试<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/tab2/" target="_blank">2)。在其他的测试中,悬浮液的干扰和控制菌株被暴露于高剂量(150克拉)的伽马辐射。后续电镀产生的平均生存1.7×10<年代up>−5disruptant和9.4×10<年代up>−6控制压力。我们因此无法识别DNA损伤的一种形式,影响了Saci_1096 disruptant超过控制压力。
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| 一个MIC值±标准差(平均<年代vg height="9.6750002" id="M47" style="vertical-align:-2.29482pt" version="1.1" viewbox="0 0 9.6374998 9.6750002" width="9.6374998" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
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3.3。诱变和DNA修复体内的化验
根据这些结果,我们检查了Saci_1227和Saci_1096基因的生物功能的产品可能不会明显改变敏感dna有害。虽然美国acidocaldarius支持定量分析突变、DNA转移和同源重组,这些分析通常涉及到本机<年代vg height="15.6125" id="M48" style="vertical-align:-3.56265pt;width:54.487499px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.487499 15.6125" width="54.487499" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink">
建设菌株CS1 CS3启用Saci_1227的角色和Saci_1096基因产物在自发突变评价使用本机<年代vg height="15.6125" id="M54" style="vertical-align:-3.56265pt;width:54.487499px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.487499 15.6125" width="54.487499" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink">
分析自发突变的分子性质在这些压力,我们品尝了相应的突变谱测序一个随机选择的每个独立的文化变异波动测试。序列变化,在它们发生,似乎所有三个类似的压力(即。野生型,Saci_1227, Saci_1096中断(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/fig3/" target="_blank">3)。比较突变的主要类为代表的三个光谱表明菌株之间的细微差别,然而(表<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/tab3/" target="_blank">3)。例如,CS3光谱样本表现出三分之二−1移码突变的数量和1.5倍碱基对替换野生型和Phr<年代up>−菌株。我们,因此,相比每个disruptant突变谱的野生型光谱,利用蒙特卡罗估计Fisher精确超几何检验的(<一个href="#B30">30.]。对于这些测试,我们评估了标准装箱图的突变<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/fig3/" target="_blank">3;这两个标准生产的最低<年代vg height="11.175" id="M55" style="vertical-align:-0.0pt;width:10.9375px;" version="1.1" viewbox="0 0 10.9375 11.175" width="10.9375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink">
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| 1每个应变的突变确定数量:CS1, 61;CS3, 78;DG185, 107年。 2估计P值超几何测试比较CS1的突变谱和CS3野生型的使用两个标准,也就是说,突变的位置无论类型和类型的突变位置无关。对于前者,每个indel被认为是位于第一个核苷酸的影响。后者使用以下13种突变:八转移(+ /−A、C、G、T),四个碱基对替换(T<年代vg height="7.125" id="M60" style="vertical-align:-0.0pt" version="1.1" viewbox="0 0 19.8125 7.125" width="19.8125" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> |
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(一)
(b)
(c)
最后一组比较关注重组收益的增加美国acidocaldarius交配时结果的一种或两种亲代菌株辐照前UV-C接合。这个刺激的大小的标记交换(SME)增加剂量的紫外线和其他dna有害和随时间的长度,细胞生理温度举行之前被允许对(<一个href="#B8">8]。中小企业及其衰减从而提供可量化的基因DNA损伤的后果,符合一个中间的DNA修复DNA刺激转让、重组,或两者兼而有之(<一个href="#B8">8]。测试影响感应或衰变破坏所导致的中小企业Saci_1227或Saci_1096,我们选择一双火葬用的突变代表在中断和野生型美国acidocaldarius和使用那些对量化标记交换紫外线照射后(表<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/tab1/" target="_blank">1)。
使用这种方法,我们首先比较中小企业作为紫外剂量的函数的大小在每个disruptant野生型美国acidocaldarius(图<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/fig4/" target="_blank">4)。结果显示没有明显的Saci_1227或Saci_1096基因中断的影响。UV-treated突变体的重组收益普遍高于对照组,但差异小于标准偏差在每个紫外线剂量。同样,中小企业衰变动力学Phr建议仅略慢衰减<年代up>−应变,明显的区别是低于标准偏差在每个时间点(图<一个href="//www.newsama.com/journals/archaea/2011/864015/fig5/" target="_blank">5)。
(一)
(b)
(一)
(b)
4所示。讨论
的orf Saci_1096和Saci_1227代表一个类的基因,为阐明战略重要性DNA修复和相关交易hyperthermophilic古生菌。编码的蛋白质与酶的调节在其他生物DNA修复过程,提高的可能性,他们可能参与DNA修复hyperthermophilic古生菌。大多数这些基因不是必不可少的生存能力在生物模型,和突变体完全缺乏基因特征函数已经被分离出来并提供表型比较相应的突变体在hyperthermophilic古生菌。我们能够扰乱Saci_1227和Saci_1096选择生物合成的基因和评估这些基因产物的功能相关性DNA修复在活的有机体内各种定量分析。结果支持四个结论,下面描述。
4.1。由Saci_1096 UVDE同系物编码不发挥重要作用在黑暗中紫外线损伤的修复美国acidocaldariusDNA
扰乱这种基因并没有改变UV-C辐射对生存能力的定量影响,产量的增加从接合(SME)重组,或增加的损失随着时间的推移,在生理条件下(SME衰变)。的Saci_1096 disruptant也未能表现出明显的向希腊字母伽马辐射敏感性或几个不同能损伤dna的化学物质。缺乏可测量的灵敏度并不是由于保留一个完整的复制的基因,并与相应的结果UVDE突变体的生物模型。具体地说,在这两个裂殖酵母美国非洲酒和抗放射性的细菌耐辐射奇球菌的,扰乱基因同源Saci_1096导致一个明显的减少紫外线生存相对于控制(<一个href="#B11">11,<一个href="#B12">12,<一个href="#B31">31日]。
提出的问题有关的功能Saci_1096也很少发生这样的UVDE同系物(蛋白质的家人PF 03851 (<一个href="#B32a">32古生菌之间的])。除了美国acidocaldarius迄今为止,这是唯一crenarchaeote编码这些蛋白质之一,古PF只出现在03851成员Halococcus marismortui,Haloquadratum walsbyi,产甲烷球菌属maripaludis,一个无教养的喜盐生物,一个无教养的产烷生物(<一个href="#B32a">32])。应该注意的是,我们不能排除这种可能性,Saci_1096功能冗余与另一个DNA修复功能美国acidocaldarius突变体缺乏其他相关修复途径尚未公布。这种冗余没有面具UV-sensitive表型耐辐射奇球菌的或美国非洲酒然而,(<一个href="#B11">11,<一个href="#B12">12,<一个href="#B31">31日]。它还必须认为Saci_1096蛋白在DNA代谢可能有作用,不涉及修复紫外线photoproducts或其他环境因素诱发的DNA损伤,但影响DNA复制的某些方面。我们观察到的证据火葬用的作为一个移码突变谱,热点强烈减毒的Saci_1096 disruptant,创建和过渡的新热点突变。这种效应的机械基础尚不清楚,但是,像其他突变发生在CS3这个网站,而在其他类似网站移码突变火葬用的似乎不受影响。
4.2。Saci_1227编码DNA光裂合酶功能
Saci_1227中断了美国acidocaldarius应变,表现出光致复活作用可以忽略不计,这基因产物第一hyperthermophilic古生菌的DNA修复蛋白被生化、功能,和遗传标准。光裂合酶提供BLASTP得分最高美国acidocaldarius蛋白质和同源蛋白质相关的古生菌,净化美国tokodaii反向cpd光裂合酶已被证实在体外(<一个href="#B9">9]。此外,美国acidocaldarius展品生物光致复活作用[<一个href="#B10">10),需要完整Saci_1227这个反应,如本研究中所示。的美国acidocaldarius光裂合酶光谱(<一个href="#B10">10类似的吸光度光谱美国tokodaii光裂合酶(即。,年代houlders at about 400 and 420 nm, and an abrupt cutoff at 500 nm) [<一个href="#B9">9),甚至有一个相似的光谱栖热菌属酸奶DNA光裂合酶测定在体外(<一个href="#B32b">33]。在美国tokodaii和t .酸奶酶,这些光谱特征与两个绑定黄素:一个促进可逆的单电子转移的热点嘧啶二聚体和其他作为触角的发色团。类似的功能、结构和光谱性质的Saci_1227蛋白质从而表明,它也可能使用第二个黄素作为触角的颜料。
4.3。的美国acidocaldariusDNA光裂合酶不扮演重要角色在黑暗修复紫外线Photoproducts
尽管hyperthermophilic古生菌功能系统的同源重组和translesion DNA合成,预计导致紫外线photoproducts公差,这些生物体的基因库存不显示紫外线photoproducts如何和其他大型,helix-distorting病变可以切除<一个href="#B5">5]。中央不确定性关于切除修复这些古生菌问题的初始识别紫外线photoproducts修复系统。硫化叶菌种虫害编码同系物的几个真核尼珥蛋白质,但没有一个规范damage-recognition从真核生物蛋白质或细菌。此外,美国solfataricus转录并不影响紫外线photoproduct修复的动力学,这意味着RNA聚合酶不作为传感器对这些病变硫化叶菌(<一个href="#B6">6,<一个href="#B7">7]。因此大多数现有的证据表明,黑暗的紫外线损伤的修复硫化叶菌,也许在其他hyperthermophilic古生菌,可能完成的同系物真核尼珥酶,但它是由气缸因素无关的规范化细菌(UvrABC)和真核(Rad4-Rad23-Rad14) damage-recognition蛋白质。
由于DNA光裂合酶结合具体紫外线photoproducts,硫化叶菌原则上,酶可以作为损伤识别蛋白质黑暗UV-induced DNA损伤的修复硫化叶菌;另外,这个属性会导致这些依赖光酶干扰等修复。光裂合酶的细菌和真菌被认为施加或正面或负面影响紫外线photoproducts尼珥,根据情况。大肠杆菌例如光裂合酶,刺激UvrABC系统在体外(<一个href="#B13">13),而酵母光裂合酶强化各种dna有害的致命效果通过抑制尼珥在活的有机体内(<一个href="#B33">34]。
建设Saci_1227 disruptants允许我们测试紫外线的光裂合酶对暗修复photoproducts,不管这种影响是积极的还是消极的。生物反应UV-C,我们观察到相等<年代vg height="16.6" id="M67" style="vertical-align:-3.50804pt;width:33.762501px;" version="1.1" viewbox="0 0 33.762501 16.6" width="33.762501" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink">
4.4。PCR引物可以针对基因中断美国acidocaldarius
各种遗传分析表明同源重组系统美国acidocaldarius可以操作非常短的DNA序列。例如,合成寡核苷酸可以替代染色体突变,包括小删除(<一个href="#B18">18,<一个href="#B23">23)和重组事件容易隔离遗传标记之间相隔只有少数英国石油公司(<一个href="#B17">17,<一个href="#B19">19]。目前的研究表明,短(40到50 bp)侧翼序列,纳入PCR产品作为引物的5′扩展,直接的特定站点集成到一个可选择的基因美国acidocaldarius基因组。这种方法的高通量的基因破坏起到了战略性的作用,系统的遗传分析其他微生物,特别是酿酒酵母(<一个href="#B20">20.,哈,也有类似的潜力。
基因中断的PCR-tailing技术也有一定的缺点,应该承认,包括事实通常使用一个可选的标记基因中断。这是重要的遗传分析硫化叶菌物种,因为几个可选择的标记是目前使用这些古菌。我们能够对中断执行定量基因检测突变体通过恢复本机<年代vg height="15.6125" id="M69" style="vertical-align:-3.56265pt;width:54.487499px;" version="1.1" viewbox="0 0 54.487499 15.6125" width="54.487499" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink">
确认
作者感谢菲尔·克拉克构建质粒pPCBE12, c .提供质粒pMJ03搬运和霍华德波音执行γ辐照。这项工作是支持的批准号MCB0543910从美国国家科学基金会。
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