质粒的特性从Hyperacidophile pPO1Picrophilus oshimae

文摘

Picrophilus oshimae和Picrophilus torridus独立生存的、中度嗜热、嗜酸性有机物的血统Euryarchaeota。酸碱最佳的增长0.7甚至能够承受摩尔浓度的硫酸,这些生物代表最极端的上的嗜酸生物。到目前为止,没有什么是知道质粒在这些hyperacidophiles生物学。也没有为这个属的遗传工具。我们动员了7.6 Kbp质粒p . oshimae在大肠杆菌通过引入origin-containing转座子和描述其核苷酸序列的质粒,拷贝数在本地主机,模式的复制和转录开始网站的orf编码。质粒pPO1可能编码一个限制/修改系统除了复制功能。获得的信息从pPO1质粒可能是有用的在发展中这一群极端上的嗜酸生物克隆系统。

1。介绍

Picrophilus torridus和Picrophilus oshimae是最极端的生物对嗜酸性结合高温厌氧生活知道日期。这些物种代表thermoacidophilic古生菌,原来孤立从干硫气在日本北部[1]。一起属热原体属和能源它们形成一组系统不同的独立生存的,中度嗜热、嗜酸性有机体中Euryarchaeota。的两个物种Picrophilus属到目前为止拥有超强的能力增长pH值在0,最佳pH值0.7。同时,p . oshimae细胞内的方法被证明能维持异常低pH值为4.6,相比其他嗜酸性有机物,这个值通常是接近中性(2]。p . torridus和p . oshimae相似的生理属性和形态学难以分辨。另一方面,他们有不同的DNA限制性片段模式,16 s rDNA基因序列和染色体外的元素的存在。质粒8.3 kb和8.8 kb,显示出强大的交叉融合在印迹分析中,已经从样品中分离出后分配到p . oshimae但不是从分配给样品p . torridus(3]。不同的形势Sulfolobales秩序,尤其是在属硫化叶菌,大量的遗传成分的特征(4),所知甚少Thermoplasmatales染色体外的元素。到目前为止,唯一的测序和质粒从这个系统发育特征pTA1隔绝热原体属acidophilum(5]。质粒pPO1的分析p . oshimae应该被证明是有用的在发展中这群有机体的基因工具。

2。材料和方法

2.1。菌株和质粒

p . oshimae是来自DSMZ (DSM 9789)和生长修改布鲁克的介质pH值0.7在55°C,前面描述的3,6]。的大肠杆菌应变JM104 (pir⁺)请提供教授Ruth Schmitz-Streit(德国基尔大学)。pPO1隔绝是指数增长的p . oshimae细胞使用QIAprep Miniprep工具包(试剂盒)和总DNA用于实时聚合酶链反应制备碱裂解法(7]。

2.2。转座子插入和pPO1测序

随机插入一个大肠杆菌复制起源包含转座子在pPO1 EZ-Tn5生成R6Kγori / KAN-2插入设备(生物技术中心)所描述的制造商。大肠杆菌JM104改变了1L换位的反应和镀与卡那霉素(50磅中补充g / mL)。总共有30个质粒从kanamycin-resistant殖民地中恢复过来,并测序一个从地极Tn5转座子。获得的序列组装Staden包软件(http://staden.sourceforge.net/),剩下的空白被引物测序方法行走。完整的质粒序列确定两股平均序列覆盖率为3.4。

2.3。pPO1拷贝数的确定

pPO1决心的拷贝数定量PCR (qPCR)通过分析基因组DNA质粒的比例p . oshimae细胞生长静止期的开始。两个质粒(RT1也和RT2)和一个基因组(16 s rRNA)基因位点为qPCR选择,和确定扩增效率(E)= 1.58 (R²= 0.998),= 1.95 (R²= 0.997)= 1.62 (R²= 0.993)。实时PCR测量进行了一式三份和两个独立的准备的p . oshimaeDNA,允许内部的评估(C_内部)和interassay (C_国际米兰)系数的变异,C_内部和C = 1.32%_国际米兰= 2.02%。这些化验使用SYBR执行绿色(qPCR MasterMix + SYBR绿色我和荧光素,Eurogentec)在一个iCycler (Bio-Rad);表中列出使用的引物1。

2.4。序列和转录开始网站分析

ORF预测进行EasyGene预测服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/EasyGene/);核苷酸和蛋白质序列和保守域搜索与NCBI数据库使用程序爆炸和CDART,分别。发现重复的串联重复序列仪程序(8]。为了确定转录起始位点的pPO1羊痘疮,RNA ligase-mediated快速放大cDNA结束(RLM-RACE)使用9),使用制造商的协议(首选RLM-RACE设备;Ambion)。两个独立复制的5 ' -RLM-RACE过程进行,包括控制烟草酸性焦磷酸酶没有治疗。获得的互补DNA受到嵌套PCR SuperTaq加上DNA聚合酶(Ambion)用表中列出的引物1;获得纯化PCR产品列(QIAquick PCR净化;使用StrataClone PCR试剂盒)和克隆克隆工具(Stratagene)。总共10殖民地/开放框架进行了分析,和质粒插入测序在两个方向上ABI 3700测序仪(应用生物系统公司)。

3所示。结果与讨论

3.1。在pPO1结构特点和开放阅读框架

完整的质粒测序pPO1p . oshimae导致7646个基点的环状分子(加入基因库JN032732数量)和G + C含量的30.5%。这是G + C含量远远低于价值的基因组的36%p . oshimae(高效液相色谱数据,3])以及p . torridus(基因组测序数据,10])。两个面对面坐落在pPO1基因间区域,IG1 IG2,被发现显著偏离平均G + C含量(图1)。有趣的是,没有Tn5转座子插入被发现在这些地区的30个质粒用于测序。观察到的偏见的一个可能的解释可能是DNA稳定的二级结构的形成,而不是当地的G + C含量,可以防止Tn5换位(11]。基因间区域IG1也发现丰富的重复序列。总共有四个串联重复序列检测,其中两种是局部IG1(表2)。

没有区域显示的核苷酸序列同源性与其他古细菌质粒或的基因组p . torridus。总共6个orf超过100氨基酸可以预测的核苷酸序列。orf 1到4包含域可以被分配到已知齿轮和/或包含了家庭(表4)。ORF 3似乎编码一种蛋白质42.4 kDa的序列特征显示热点Orc1 / cdc 6细胞分裂控制蛋白质和显示高水平的氨基酸序列相似性(38%身份)Orc1 / cdc 6同系物在pTA1找到质粒t . acidophilum(5]。尽管代表蛋白质通常涉及作为质粒的复制因子发起者,没有一个已知的同族体代表蛋白质在pPO1也可以发现。我们不能单链DNA检测中间体在细胞提取的指数增长p . oshimae,由nondenaturing南方杂交和S1 nuclease-based保护试验(12(数据未显示)。因此,最有可能通过θpPO1复制机制,和羊痘疮3可能是复制引发剂。ORF3的定位和基因间区域IG1进一步支持这一预测IG1携带一个古细菌复制来源网站的特点(oriC)。古细菌oriC网站通常at富集,repeat-containing基因间区域和通常位于上游的基因编码Orc1 / cdc 6同系物(13]。相似的整体架构Orc1 / cdc 6子和pTA1 oriC网站可以找到相关的质粒t . acidophilum(5]。很明显,需要进一步的实验来明确确定模式和复制pPO1和pTA1的起源。

此外,pPO1似乎限制/修改系统的编码基因(R / M系统,开放5和2)和重组酶(ORF 4)。值得注意的是,假定的R / M系统的开放有同源染色体只有在细菌血统,最高水平的氨基酸序列的相似性属于高GC的组革兰氏阳性细菌。

3.2。质粒拷贝数的决心

pPO1拷贝数是决定通过测量大量的两个质粒DNA位点相对于基因组DNA位点使用定量实时PCR。获得的结果为这两个质粒基因座是在良好的协议,也就是说,每11.8±3.6副本基因组等效为RT2 RT1也和15.4±2.7副本。这些测量使用的DNA样本来自文化发展到固定相的开始。

3.3。种族转录开始网站的分析

的转录起始位点(TSS)的四个pPO1 orf(表RLM-RACE可以映射的过程3)。没有获得子PCR产品3和4,很可能表明低水平的转录实验增长条件下这些羊痘疮。尽管共线的组织开放1 6和4此外orf 3和2的重叠,没有多顺反子RNA可以检测到5′RLM-RACE。

3.4。pPO1向量发展的潜力

到目前为止没有克隆系统或转换方法是可用的hyperacidophilic生物Picrophilus属。质粒pPO1现在可以作为发展的起点重组克隆载体。从pPO1序列,质粒的大小自动复制所需的地区被包括在穿梭载体的结构大概可以大幅减少,例如,通过删除R / M系统的基因。主机/矢量系统的基因改造Picrophilus菌株将有助于详细研究的基础极端thermoacidophilic适应这些独特的古细菌微生物能够生活在pH值为0。

确认

作者感谢Mechthild Bomeke优秀技术援助。这项工作得到了Bundesministerium皮毛陶冶,大幅减退科学和技术(BMBF)的框架内GenoMik (Genomforschung Mikroorganismen)融资措施。

引用

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