功能基因组和先进的遗传研究揭示出小说的见解新陈代谢,监管和生物学Haloferax volcanii

文摘

的基因组序列Haloferax volcanii可以和几个比较基因组在网上研究进行,产生了新的见解例如出口成蛋白质,RNA修改,小非编码RNA, ubiquitin-like小古细菌蛋白质修饰符。功能基因组的全面方法建立了从转录组和结果,蛋白质组学和代谢组学研究进行了讨论。值得注意的是,Hfx。volcanii是一起Halobacterium salinarum唯一的原核生物translatome分析已经完成。的结果表明,分数translationally-regulated haloarchaea高达在真核生物的基因。已经建立了一个高效的基因系统,使图书馆的应用以及并行代基因缺失突变体。灵巧的突变产生辅以文化的可能性Hfx。volcanii在微量滴定板,使突变体的表型出现集合。遗传方法目前用于研究不同生物的问题复制转译后的修改和选择的结果进行了讨论。综上所述,功能基因组和遗传工具的财富Hfx。volcanii善意的热点模式物种,这使得近年来代的重要成果,在未来将最有可能产生进一步的突破。

1。介绍

一方面,生物学试图表示在自然界中发现的生物多样性;与其他自然科学如物理,这使得它几乎不可能得到一般规则。另一方面,从研究中获利颇多生物学的所谓“模式物种”,例如,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌,酿酒酵母和粟酒裂殖酵母为真菌,黑腹果蝇发育生物学,越来越多的鼠标高等真核生物。因此,需要有几个模型物种生命的第三域,古生菌,Haloferax volcanii已经讨论了作为一个合适的候选人(1]。有理解生物学的快速进展Hfx。volcanii在过去的五年。因此,近年来,结果将被审查,与关注(1)“功能基因组学”,也就是说,基因组序列的生物信息学分析,转录组,translatomics,蛋白质组学,代谢组学和(2)的遗传系统Hfx。volcanii及其应用在描述各种各样的中央的生物功能。

Hfx。volcanii从死海35年前孤立和命名为本杰明Elazari Volcani [2),谁是第一个来确定死海,尽管它的名字,包含许多微生物(3]。Hfx。volcanii多形性,具有极高的盐公差范围,和能够生长在环境从0.7 M 5 M氯化钠,以最佳浓度大约2.2 (4]。多才多艺的新陈代谢,可以生长在简单合成媒体各种糖类、氨基酸、甘油、丙酮酸、乙酸为唯一碳和能量来源。除了有氧增长外,它还可以使用硝酸厌氧生长,DMSO,或者TMAO作为电子受体。在最优条件下,倍增时间约三个小时(5),甚至更快的增长已经报道(6]。在一定条件下,它是能动的7),它会在几个表面形成生物膜(傅高义Soppa,未发表的数据)。转换系统成立20多年前(8,9],之后添加了许多有用的功能(下面给出最近的例子)。Hfx。volcanii有一个自然的基因转移系统(10,11],可以应用于组合突变,从而加速分子遗传学。基因组已经测序,将下面描述,建立了功能基因组学的方法。Hfx。volcanii已经用于研究许多中央生物过程,包括复制、DNA修复、转录和转录调节、翻译、蛋白出口,转译后的修改蛋白质,蛋白质降解和代谢的各个方面。选定的例子从最近几年将在下面描述。图1概述不同的主题和各自的重要参考。

2。基因组学

一个物种的基因组序列的可用性进行调查是生物信息学分析的先决条件和许多实验方法。一个初始Hfx。volcanii基因组计划开始10多年前,但最终失败了,并进一步项目多年来阻碍。随后,TIGR开始第二个基因组计划和生成的草案在2005年版本的基因组序列。的基因组序列于2010年出版12),但草案版本是可用的Hfx。volcanii社区年前和使蛋白质组学和生物信息学的建立基因组分析,在其他领域(见下文)。的注释Hfx。volcanii基因组参考基因组的利用负担沉重。salinarumR1的注释质量非常高,因为它是基于大量的蛋白质组学实验(13]。因此,小蛋白,实验发现在一项研究中描述的“低分子量蛋白质组”负担沉重。salinarum注释在Hfx。volcanii(14]。此外,一些额外的haloarchaea最近的基因组测序,使比较基因组学的应用能够提高质量的注释。基因组序列和许多附加功能可以找到“古细菌基因组浏览器”和“halolex”网站(http://archaea.ucsc.edu/;http://www.halolex.mpg.de/)[15,16]。

高质量的基因组序列强调映射结果(早些时候17]。是确定的四个五经由包含Cdc6-associated复制起源(18]。因此,Hfx。volcanii现在被描述为包含一个主要的染色体2.8 Mbp,三个小636 kbp的染色体,438 kbp和85 kbp (pHV 4、3、1)和一个质粒6.4 kbp (pHV2) [12]。基因组的GC含量在65%的高位,但这是类似于其他haloarchaea,除了Haloquadratum walsbyi。GC的巨大差异内容编码地区(65%),与非编码区域(58%),和大量的插入(是)元素haloarchaea导致高GC含量的理论是由进化选择远离偏好的元素。这种差异在GC含量减少的频率的基因组上插入额外的地方haloarchaea和特别重要的是编码区域(12]。这个理论也适用于Hqr。walsbyi一个物种,GC含量很低48%,避免理想的GC使用相反的技术内容是元素插入,也就是说,通过减少GC含量。

主要的染色体有两个起源的复制(18]。因此,Hfx。volcanii添加到越来越多的热点与多个复制起源、特点,首次被发现硫化叶菌solfataricus(19,20.]。Hfx。volcanii被发现高度多倍体,港口大约15基因组拷贝在指数增长和10在固定相(21]。这类似于负担沉重。salinarum有更高的基因组拷贝数。另外,几个额外的Euryarchaeota oligoploid或多倍体物种,尽管所有种类的特征Crenarchaeota已经发现单倍体(22]。自发突变的低利率和不寻常的模式是最有可能的多倍体Hfx。volcanii(23]。

总共的基因组Hfx。volcanii编码4 063个蛋白质编码基因。像所有其他haloarchaea和嗜盐的细菌Hfx Salinibacter红的。volcanii还使用渗透改编的“盐”战略,即细胞质中的盐浓度高达的环境。因此,所有细胞成分在高盐条件下进化适应函数。因此,所有这些嗜盐菌表现出相同的独特的蛋白质组分离从所有其他生物特性。蛋白质丰富的天门冬氨酸和谷氨酸,缬氨酸,苏氨酸,,相比之下,赖氨酸的分数,甲硫氨酸,亮氨酸,异亮氨酸和半胱氨酸下降(24]。此外,嗜盐的蛋白质疏水性(或更高的亲水性)显示低于其他生物体的蛋白质24]。

基因组序列显示Hfx。volcanii特点是ABC转运蛋白家族的扩大而不是其他家庭的转运蛋白。总的来说,69年预测基因簇ABC转运蛋白被发现(12),突显出多才多艺的代谢Hfx。volcanii前面提到的。按照这个多才多艺的新陈代谢,Hfx。volcanii基因组编码大量信号转导的组件,其中包括135单组份体系,即蛋白质包含感官和监管领域(12]。

haloarchaea的另一个特点是广泛使用的双精氨酸易位(乙)通路的蛋白质分泌25]。已经提出,这个功能也是一个适应高盐环境,允许chaperone-assisted折叠的蛋白质在细胞质中分泌。高盐环境可能抑制自发折叠的蛋白质出口通过证交会路径展开形式。程序“TATFIND”引入了全基因组预测蛋白质的推定地通过乙通路(出口26]。最近,它是补充的项目“TatLipo”,因为它是指出,Hfx。volcanii答通路基质和其他haloarchaea包含lipobox,想必共价固定细胞质膜的脂质(27]。比较基因组学揭示,在六种haloarchaea预测答基质中脂蛋白的分数是50%或更高,而这个分数是0%左右在20个额外的古细菌和细菌基因组(27]。

最初在蛋白出口工作Hfx。volcanii导致的变化在细菌蛋白质运输的概念。基于的研究大肠杆菌,它长期以来一直认为乙通路基质是非常罕见的。乙底物被认为是有限的几周质的蛋白质含有菲斯集群,必须由监护人纳入蛋白质在细胞质中。然而,工作在所有已知基因组预测答基质当时透露,一些细菌种类超过90乙通路基质(链霉菌属coelicolor, Mezorhizobium洛蒂Sinorhizobium meliloti),而其他细菌物种显然不使用路径(例如,,伯氏疏螺旋体Ureaplasma体,肺炎链球菌)[26]。

的基因组序列Hfx。volcanii也用于生物信息学预测修改网站的稳定的RNA,导游RNA RNA参与修改和RNA-modifying酶(28,29日]。预测修改的数量是惊人的低,这也解释为一个适应高盐细胞质因为RNA稳定在高盐条件下高。这是假设的修改Hfx。volcanii翻译尤为重要的机制,因此不能通过进化所取代。如果这是真的,h . volcanii将一个模型的最小集基本RNA的修改和可以用来研究其生物功能。

进一步的应用Hfx。volcanii基因组序列的全基因组生物信息学预测是守恒的图案比较基因组学在基因间区域使用。守恒的图案在小非编码基因间区域包括监管rna (srna)和假定监管元素5′和3′-UTRs。实验验证表明,超过一半的预测srna表达在标准条件下,使微分表达式的描述(30.]。

最近,发现蛋白质Hfx。volcanii是由共价修改附件的“桑普”,小古细菌蛋白质修饰符。桑普ubiquitin-like (Ubl)蛋白质共价连接到其他蛋白质,修改,标志着他们通过蛋白酶体降解[31日]。这个杰出的发现解决了这个难题,古生菌含有蛋白酶体,这是真核蛋白同源,但不是泛素。泛素标记真核蛋白质通过蛋白酶体降解,以及缺乏一个泛素化系统抑制理解古生菌的蛋白质降解的发生。结果表明,桑普可以共价与赖氨酸的ε-氨基通过一个高度保守的双甘氨酸甘氨酸的主题在糖基。“SAMPylated”蛋白质轭合物被免疫沉淀反应孤立,和34个蛋白质,包括代谢酶、压力反应蛋白质和DNA和rna结合蛋白。也透露,桑普可以连接到自己,这意味着poly-SAMPylation发生,类似于polyubiquitination在真核生物(比较部分10结果chaperonins和蛋白质折叠)。

桑普的发现引发了比较基因组研究整个Ubl古生菌的蛋白质家族(32]。这是显示大部分古生菌Ubl蛋白质包含两个主要的组的成员,这个家庭和MoaD家庭。基因背景的分析ubl古细菌基因组的基因导致了预测的主要功能MaoD家人的确是Mo / W代数余子式生物合成,顾名思义。然而,一个重要的发现是,这个家庭成员经常与高度保守的,最有可能的是,基本相关基因编码蛋白质的翻译,尤其是tRNA修改。它提出了Ubl的祖先功能蛋白质在图示修改核苷酸的生物合成,这对翻译的忠诚是非常重要的。根据这一假说,Ubl蛋白质只会获得额外的功能后,例如,墨客,硫胺的生物合成、蛋白质修饰。今天在这个视图中,Ubl蛋白质作为蛋白质质量控制在几个层面上的一般设备,包括平移忠诚和蛋白质降解。

多功能Ubl蛋白质的存在h . volcanii是实验验证33]。失活的基因编码一种蛋白质名为UbaA (Ubl古生菌激活酶,HVO_0558)导致的损失蛋白质SAMPylation SAMP1和SAMP2。它也表明,h . volcanii无法通过DMSO呼吸没有UbaA生长,而突变体不包含DMSO溶液还原酶活动,与野生型相比。建议SAMP1和UbaA参与硫转移到墨客生物合成的中间。三分之一的thiolation UbaA的函数可能,额外的图示。这是建议的热敏性表型ubaA删除突变是由于缺乏tRNA thiolation [33),因为这被发现是真的栖热菌属酸奶(34]。这些优秀的结果很好地验证了基于比较基因组分析预测。

3所示。转录组

所有记录的全基因组平行量化水平今天可以经常执行和已被证明是非常强大的。DNA微阵列技术介绍了超过10年前,最近,下一代测序等替代技术的互补脱氧核糖核酸数据库建立。DNA微阵列的分析Hfx。volcanii转录组是诞生于2003年,几年前的基因组序列。因此,另一种方法使用了典型的基因组序列DNA微阵列技术。基因组文库由质粒基因组片段,平均长度为1.5 kbp建造和改造成一个PCR产品库。这个库是用来生成一个猎枪基因组的DNA微阵列与一个单一的报道(35]。因此,一个特定基因的概率在DNA微阵列是67%。然而,转录组研究的目的是产生一个概述生物通路和调控的过程,因此,没有必要每个基因代表。整个组件的概率没有途径甚至复杂的蛋白质,如ABC转运蛋白,表示非常低。例如,所有的11个基因编码的概率八柠檬酸循环酶DNA微阵列上表示。3000年基因片段测序DNA微阵列组成,和代表的基因组的基因片段被确定。

第一个应用程序是转录组动力学的特征变化的开关casamino酸葡萄糖为唯一碳和能源35]。的预期upregulation葡萄糖降解途径了。许多过程表达下调,包括糖质新生,柠檬酸循环,电子传递,ATP合成、核糖体生物合成和复制。这是符合这一事实Hfx。volcanii“喜欢”casamino酸;增长率、核糖体含量和中央新陈代谢衰减后切换到葡萄糖。转录组研究discovery-driven方法,因此,通常产生意想不到的结果。在这个例子中,意想不到的结果与乙酸代谢有关,methyl-malonyl-CoA新陈代谢,ABC转运蛋白,蛋白质磷酸化(35]。值得注意的是,两类活动coregulated基因只是暂时性的诱导后不久从casamino酸转变为葡萄糖和无法发现了最常用的比较两个稳定状态(35]。大多数编码的蛋白质没有已知函数,表明当前知识分子过渡过程的细节是非常有限的。

DNA微阵列也被用来识别基因诱导期间增长木糖为唯一碳源,从而使木糖降解通路的说明Hfx。volcanii(36]。编码的酶催化反应的酶是生化分析。此外,一些突变体生成证明各自的基因对木糖退化至关重要Hfx。volcanii,不存在冗余路径(36]。

DNA微阵列的另一个应用程序是一个基因编码的识别的tryptophanase近倍增加转录水平的色氨酸,而所有其他基因的转录水平保持不变(37]。的tna子也被证明是诱导后转移到不同的质粒,它目前被相当多的组织条件蛋白质生产或有条件的基因沉默(下面提到的几个例子)。

在一些情况下,DNA微阵列已经被用于比较缺失突变体的转录组和同基因的野生型(38,39](Dambeck Soppa,未发表的数据)。在一些情况下,这使的解开生物蛋白质或小的非编码rna的角色(srna)。例如,在一个突变,DNA微阵列分析发现基因的转录水平的变化参与趋化性或编码组件的鞭毛仪器,和随后的分析群板块验证不同的群速度的突变体与野生型相比(未发表的结果)。

应该注意的是,根据选择的开放平台,很容易添加进一步的调查,这是不可能的几个其他微阵列格式。例如,探针sRNA补充说,现在可以应用于微阵列分析的微分表达式sRNA基因和蛋白质编码的基因Hfx。volcanii同时进行。如上所述,DNA微阵列已经被用于分析角度预测小分子rna表达,因此是否可以被证明是真正的基因(30.]。它也是用来识别srna必然和可能与haloarchaeal copurified Lsm蛋白质。这些结果证明了haloarchaeal Lsm蛋白参与了许多小rna的功能以类似方式的相同器官细菌,Hfq蛋白大肠杆菌(40]。总之,基于随机基因组文库的DNA微阵列已经被证明是一个有价值的工具,用于研究各种生物过程,包括单个基因或微分调节几百个基因。

最近,微阵列平台成立,一个全基因组Nimblegene DNA微阵列(领主Papke,个人通信;robertson.papke@uconn.edu)。这个芯片是目前被社区的两组,例如,要阐明的DNA导入系统的组件Hfx。volcanii。因此,使用DNA微阵列技术是现在传播Hfx。volcanii社区,和重要的发现可以预期在不久的将来使用微阵列平台。

4所示。Translatomics

DNA微阵列不仅用于转录水平的分析,但也可以应用转化的效率特性的所有记录在特定的条件下。translatome分析的实验设计是更复杂的比一个转录组分析,通常包括以下步骤:(1)胞质提取物的制备在温和的条件下,保持记录和翻译核糖体的复合物(多核糖体),(2)免费成绩单,没有翻译的分离细胞破坏的时候使用密度梯度离心法从多核糖体(核糖体分析),(3)RNA的隔离两个分数,(4)比较两个分数的使用DNA微阵列或第二代测序,和(5)的识别记录nonaverage翻译效率。识别的微分平移控制,至少有两个不同的条件进行比较。

与真核生物大约20这些研究已经进行,也就是说,酿酒酵母、拟南芥和人类细胞系。所有这些研究发现转化调控基因,其分数变化从1%到25%,取决于物种和适用条件(41- - - - - -47]。直到现在,没有报告任何translatome分析细菌物种。然而,一项研究进行了两种嗜盐古生菌,Haloferax volcanii和Halobacterium salinarum(48]。translatomes指数增长和固定相的文化比较,显示,10%和20%,分别记录都是在微分增长phase-dependent平移控制。因此,一部分转化调控基因在真核生物haloarchaea高达,和转化的监管似乎进化前真核生物的发展。将会很有趣也解开细菌是否使用平移控制调节基因表达和调控基因的一部分是否同样高。

haloarchaea产生的高分数转化调控基因的研究旨在揭示分子调控机制的细节。据透露,2/3的成绩单Hfx。volcanii群龙无首,Shine-Dalgarno (SD)图案非常稀缺。令人惊讶的是,它发现翻译是由三分之一的“小说”机制的所有记录以5′utr缺乏SD主题(49,50]。

此外,结果表明,5′和3′-UTRs一起是充分的转移转化调控从本地记者记录,记录的方向平移监管是编码在3′utr [51]。目前,分子细节的3′utr对转化效率的影响5′末端的成绩单正在研究。在真核生物中,转录环化被认为是一种普遍现象。它是由一个共同的交互cap-binding翻译起始因子eIF4E和polyA-binding蛋白与起始因子如果[52,53]。然而,在haloarchaea,机制必须是不同的,因为他们有mrna缺乏聚腺苷酸化和所有三个真核蛋白质的缺乏直接同源。

5。蛋白质组学

草案基因组序列的可用性社区几年前最后的基因组序列公布使建立真正的现代早期蛋白质组学。首先,样品制备方法和二维凝胶电泳进行了优化,使细胞质蛋白质组的可再生的表示Hfx。volcanii(54,55]。随后,改编的Hfx。volcanii分析了不同盐浓度(56]。文化生长在最优氯化钠浓度的2.1米和3.5米的一个增强的浓度,以及稳态细胞质蛋白质组比较二维凝胶电泳。44与微分浓度检测,蛋白质和18这些被肽质量指纹识别。2.1最佳盐浓度的氯化钠,15蛋白质浓度较高或独特的检测,其中五核糖体蛋白质。这是符合早期观察的核糖体内容Hfx。volcanii是敏感的增长率(35),作为描述过大肠杆菌和其他细菌(57]。然而,三种蛋白质Hfx。volcanii差异的次优高盐浓度下3.5 M氯化钠。其中的相同器官大肠杆菌PspA“噬菌体休克蛋白,它是一种细菌转录因子调节在应对各种压力条件(56]。类似的实验也被执行与极端的喜盐生物负担沉重。salinarum生长的最佳浓度为4.3 M氯化钠以及2.6米和5.1米的次优浓度氯化钠(58]。在这种情况下,比较细胞胞质蛋白的最优和高盐条件下导致50蛋白质的识别与微分浓度。微分调节更均匀地分布,30蛋白是调节在最优条件下(最高分数是核糖体蛋白质),而20蛋白质调节在高盐浓度下(未知函数的分数是最高的蛋白质)。因此,适应的机制似乎nonoptimal盐浓度在不同种类的haloarchaea不守恒。

一些蛋白质组研究集中在蛋白质的表征通过蛋白酶体降解。蛋白酶体是由四个堆叠,heptameric环单元,其整体结构是古细菌和真核生物中高度保守的。而heptameric戒指的真核蛋白酶体是由七种不同的子单元,古细菌蛋白酶体的组成是不那么复杂。Hfx。volcanii有一个β亚基形成homoheptameric环和两个α亚基中差异表达的对数生长期和稳定期,因此,它能够形成至少两个不同类型的水解酶(59,60]。阐明生物蛋白酶体的作用,细胞proteasome-specific抑制剂clasto-lactacystin-beta-lactone孵育,和处理和未经处理的文化比较蛋白质组(61年]。蛋白酶体抑制后,斑点的数量显示在二维凝胶相比是更高的控制文化;蛋白酶体功能的抑制,导致增加从627年到1036年,表明水解酶参与降解多种不同的蛋白质在haloarchaea [61年]。大约20个蛋白质测定的身份。其中有五个核糖体蛋白质以及蛋白质代谢酶和细胞分裂,凸显出的一般作用蛋白酶体对蛋白质周转haloarchaea [61年]。在一个额外的方法来识别蛋白酶体基质,proteasome-activating核苷酸酶PanA,展开的蛋白质在蛋白酶的降解,被删除的灭活基因(62年]。的panA突变的倍增时间较长和降低增长收益同基因的野生型相比,强调蛋白质周转的重要性Hfx。volcanii。使用染色比较phosphoproteomes Pro-Q钻石检测了两倍点突变体与野生型相比(64比31点)。使用三种不同的方法,磷蛋白质从细胞质浓缩提取物(IMAC;MOAC;IMAC + MOAC),丰富的蛋白质混合物被肽质量指纹识别后反相高效液相色谱分离。总共625蛋白被发现,其中98是独特的突变。98年mutant-specific蛋白质包含许多不同功能的蛋白质类,例如,代谢酶,cell-cycle-related蛋白质和DNA结合蛋白质。一个明显的区别是多种蛋白质的浓缩磷酸调节子,表明PanA导致细胞压力的损失,按照较低的增长率(62年]。的两个桑普蛋白质的鉴定h . volcanii通过共价附件标记蛋白质通过蛋白酶体降解已经上面描述(“基因组学”部分)。桑普在古细菌基因组基因的广泛分布表明,与桑普结合的蛋白质是一种非常古老和通用机制在古生菌蛋白质通过蛋白酶体降解。因此,蛋白质组学的结合h . volcanii和比较基因组学发现了一本小说,但普遍存在蛋白质周转的分子机制。

另一种方法旨在识别蛋白质的库存Hfx。volcanii细胞质(63年]。除了经典的二维凝胶electrophoresis-based方法,五个额外的方法应用,导致296的总识别蛋白质,代表理论细胞质蛋白质组的32%。236年N-termini蛋白质可以分析和显示,在这些蛋白质的70%,氨基甲硫氨酸被和/或发起者蛋氨酸或倒数第二氨基酸(除蛋氨酸后,n端氨基酸)是在α氨基乙酰化。正如所料,没有N-termini制定,相比之下的N-termini细菌蛋白。总之,分析的Hfx。volcanii细胞质蛋白质组对蛋白质的库存非常丰富,N-termini,转译后的修改,不同监管的蛋白质含量,特别是有关蛋白质营业额产生了惊人的结果。蛋白质组分析Hfx。volcanii还一直局限于细胞质蛋白质组。然而,额外的好处可以通过与蛋白质组研究的结果进行比较负担沉重。salinarum膜蛋白质组特征或低分子量蛋白质组(14,64年,65年]。

6。代谢组学

近年来,代谢组学取得了快速的进步和成熟的量化只有很少的代谢物善意平行量化数以百计的代谢物(66年]。由于不同的化学行为不同的代谢产物,代谢组学还要求。目前,只有一个单一的研究Hfx。volcanii涉及一种代谢组学的方法。的基因组Hfx。volcanii港口三个基因簇编码单元三2-oxoacid脱氢酶复合物,但这三种酶的底物和生物作用复合物仍模糊的很长一段时间(67年- - - - - -72年]。为了应用遗传学来解决这个问题,7株构造,包含了三种可能的单基因缺失,三种可能的双重缺失,三重基因删除(73年]。比较野生型和突变体的胞外代谢物透露,异亮氨酸的野生型的复杂的媒体,而突变体缺乏一个2-oxoacid脱氢酶复合物(OADHC-1)无法这样做。后续分析证实OADHC-1确实是必不可少的退化异亮氨酸而不是其它支链氨基酸(73年]。

7所示。基因组遗传学:从一个转换系统的设计和表现型变异集合

Hfx。volcanii和负担沉重。salinarum(当时叫负担沉重。halobium)是第一个,多年来,唯一的热点转换系统是可用的(8,9]。多年来,越来越多的分子遗传学工具被添加,今天,几个质粒兼容,几个报告基因,调控子,建立了先进的克隆策略。是最常用的报告基因bgaH基因Hfx。alicantei编码一个salt-adapted苷(74年),dhfr基因Hfx。volcanii编码二氢叶酸还原酶(75年),和一个耐盐变异体的绿色荧光蛋白(76年]。

的发展迈出的重要一步是一代染色体缺失突变体的方法(77年]。随后,一些营养缺陷型的菌株和质粒携带相应的基因生成,添加额外的选择方案和促进在坐标系缺失突变体的产生78年]。优化的克隆程序已报告(79年- - - - - -81年),其中两个是如此强劲,向量生成的微量滴定板是可能的(79年,81年]。这些方法使一代的突变体库,包含单删除所有基因的突变体Hfx。volcanii技术上可行。这种方法执行了几个模型种类的细菌,它已经被证明是极其强大的基因功能的说明(82年- - - - - -84年]。全基因组突变的方法生产及其与同基因的表型比较野生型只能成功当平行突变体在不同条件下的培养是可行的。为此,两种不同的培养条件Hfx。volcanii在微量滴定板最近被报道。一种方法使用一个自动化系统,从而利用最小的处理努力,但它涉及代时间太长和低增长收益,使量化微妙的突变体和野生型之间的差异具有挑战性的79年]。另一种方法取决于个人成长测量,需要实践的研究,使而是快速增长与不远低于增长率与最优曝气(厄伦美厄烧瓶4]。

如前所述,haloarchaea是第一组的古菌基因技术建立了,他们长时间在分子遗传技术的前沿发展。然而,近年来,我们已经取得了巨大进展与其他模型的各种热点团体,已经回顾了最近的进展85年]。进步的大小可以估计当当前的可能性是比较艺术的状态只有五年前86年,87年]。甚至hyperthermophilc基因转移系统海床furiosus据报道(88年,89年]。因此,几个热点模型物种现在提供了一个广泛的遗传,生物化学、微生物学、细胞生物学和结构生物学工具。而Hfx。volcanii主要在分子遗传学,它有其他方面的劣势;例如,产生不同的蛋白质大肠杆菌展开,后续必须单独优化每个蛋白质重折叠,并不总是成功。最近,第一个真正haloarchaeal表达载体构建的条件生产过剩,使his-tagged融合蛋白很容易被孤立的亲和纯化(90年]。这种方法是保证蛋白质同源生产后将本地折叠,可以申请酶动力学特征以及结晶和结构研究。

8。遗传学:应用Hfx。volcanii作为“自然零变异”

研究生物过程不是在本地主机,但在不同的主机而不是经常被证明是极其强大的(91年- - - - - -93年]。优势包括发现新基因编码特定功能的能力,缓解取代野生型基因的变异版本,和研究基因的确定不仅需要,而且也满足过程进行调查。几个项目使用h . volcanii作为一个不同的主机不描述函数在其基因组编码或发现新的基因。15年前,arcC基因的负担沉重。salinarum表达的是Hfx。volcanii,它验证了编码的一种氨基甲酸酯激酶,的四个蛋白质精氨酸发酵途径之一(94年]。在一个优雅的方法中,二氢叶酸还原酶基因的缺失突变体是用来识别nonorthologous基因的基因组负担沉重。salinarum和Haloarcula marismortui编码酶减少叶酸生物合成的另一个途径。在这项研究之前,这些基因没有已知函数(95年,96年]。最近,一个基因的生物功能注释fabG1,这是六个之一fabG假字的Haloarcula hispanica,是澄清97年]。结果表明,fabG1编码polyhydroxyalkanoate——(PHA)特定乙酰乙酰基辅酶a还原酶。不同的表达fabG1,但不是其他的五个fabG假字,一起phaECeoncoding PHA合成酶的基因,重建的PHA合成途径h . hispanica在Hfx。volcanii。

Hfx。volcanii是广泛使用的三种气体泡基因簇的负担沉重。salinarum和Haloferax mediterranei,导致20多个出版物。例如,气体囊泡形成的最小数量的基因决定,和小结构蛋白的作用GvpC澄清。此外,监管的角色GvpD和GvpE特征,阐明其交互的要求,和GvpE和TATA框结合蛋白质之间的相互作用在活的有机体内进行了研究。此外,调节气体泡合成研究(例如,98年- - - - - -102年),和引用)。

一个不同的角度不同的蛋白质的生产Hfx。volcanii是代谢工程,最终的目标是使用生物技术应用的物种。第一个例子是丙酮酸脱羧酶的生产发酵单胞菌属mobilis在Hfx。volcanii生物乙醇生产的,假定的未来目标103年]。最近回顾总结了当前和潜在的未来的嗜盐微生物的生物技术应用(104年]。

9。遗传学:质粒库的应用

10的转换效率高⁶每毫克转化株的DNA使图书馆的应用。一个例子是质粒含有活性启动子的选择在活的有机体内从一个随机的10多个库⁶克隆(105年]。14个职位报告基因的上游是随机的,用于选择和记者酶活性。因此,这代表了新创建设积极启动子元素从一个随机的序列。此外,较低的质粒,中间,生成和启动子强度高,后来被用来调节基因的表达到所需的级别。

第二个例子是硝酸盐respiration-deficient突变体的互补Hfx。volcanii与野生型基因的基因组文库。使用这种方法,11个基因的基本基因组区域为硝酸呼吸可以识别,包括ABC转运蛋白的基因,对葡萄糖酶降解,2-oxoacid脱氢酶复杂,转录监管机构,和蛋白质与未知函数(70年,71年(万纳Soppa,未发表的数据)。

正如上面已经提到的,质粒库也被应用于确定复制的起源Hfx。volcanii(18),用Hfx。volcanii为了揭开降低叶酸的合成负担沉重。salinarum(95年]。所有四个研究例证遗传策略最初开发的缓解大肠杆菌可以适应Hfx。volcanii,所以整个基因技术可以应用的力量。

10。变异的遗传学:应用程序描述重要的生物过程

所谓Pop-In-Pop-Out建设的方法Hfx。volcanii突变体是诞生于2003年,2004年,增加了进一步的菌株和质粒(77年,78年]。方法迅速传播到世界各地,直到2008年,20多个突变体的生成已经发表的各种团体(概述在表2的106年])。从那时起,易于施工导致许多突变体的生成,以及目前必须超过100数量。作为社区的工具获得突变基因的概述和抑制由不同组多个代相同的突变,突变数据库目前在建(Friedhelm菲佛、个人通信)。它将访问社区通过Hfx。volcanii网站(http://www.haloferax.org/)。突变体是用于研究各种生物功能和途径,和几个例子将讨论不久,从DNA生物化学转译后的流程。

在复制的遗传方法研究中,各种突变体的构建,重点是基因编码的蛋白质与复制叉(旅游107年]。另一个目标是理解不同的DNA修复途径Hfx。volcanii和解开它们的相对重要性在各种条件下(108年- - - - - -111年]。一个意想不到的结果是,同源重组,这被认为是主要的修复在原核生物的双链断裂机制,由Mre11-Rad50在压抑h . volcanii。假设,在多倍体物种可能产生多个不同染色体的双链断裂,修复通过同源重组可能导致不利的奇怪的DNA分子细胞。因此,它是预测,同源重组作为双链断裂修复也可能意味着压抑其他多倍体原核生物。值得注意的是,建立了遗传分析的量化,允许使用不同的修复途径h . volcanii体内。

在生物信息学的方法,提出了RNA的修改,这些修改的酶催化形成一直预测(28]。从这个概述开始,大约有30个突变体的基因的结构推定地参与RNA代谢是尝试79年,112年]。十个突变体不能生成,基因可能是至关重要的。然而,20多个突变体被成功构建和验证了预测RNA酶功能生物化学(79年,112年]。

小非编码调控rna (srna)已发现在所有三个领域的生活。RNomics,生物信息学预测耦合实验验证和高通量测序已导致超过200 srna的识别Hfx。volcanii([30.,39,113年),未发表的结果)。大约30 sRNA基因的缺失突变体构造,目前,表现型sRNA解开生物功能的应用Hfx。volcanii(4(未发表的数据)。删除突变的基因编码唯一Lsm蛋白质Hfx。volcanii有严重的生长缺陷和多向性的表现型,表明Lsm蛋白质的功能所必需的许多srna [40]。

Chaperonins无处不在的蛋白质折叠机是由两个戒指和“双圈”结构(比较部分“基因组学”蛋白降解)。Hfx。volcanii有三个组II基因chaperonins,有意思的是澄清是否都是必不可少的,类似于8 II chaperonins真核组。突变分析表明这三个单突变体可以生成,因此,分别三个蛋白质是可有可无的114年]。然而,只有三种可能的双突变体的两个可以建造,同时删除所有三个基因是不可能的。这些结果清楚地表明,存在至少一个chaperonins是绝对必要的。chaperonin基因被用来例证条件基本基因沉默Hfx。volcanii。一个色氨酸诱导启动子使基因沉默和使用条件对色氨酸去除蛋白质消耗37]。

已经上面所描述的那样,缺失突变体也被用于描述通过蛋白酶体降解的蛋白质。此外,各种突变体被用来通过证交会分析蛋白分泌途径,出口蛋白质的一种展现形式,和乙途径出口本地折叠蛋白质(例如,27,115年- - - - - -119年])。

基因的方法也被用于研究蛋白质转译后的可逆的乙酰化作用。试图生成单引号和双突变体基因的蛋白质乙酰基转移酶和去乙酰酶抑制剂透露,两种蛋白去乙酰酶抑制剂是至关重要的。此外,single-deletion三乙酰基转移酶基因的突变可以建造,但只有两三个可能的双突变体。综上所述,结果显示,可逆的蛋白质乙酰化作用是至关重要的Hfx。volcanii(120年]。

广泛的遗传和生化分析的结合使蛋白质糖基化途径的解开([121年- - - - - -126年)和引用)。除了代突变体来验证酶活性基因定点突变版本被用于互补,使残留的识别重要的催化作用。最后但并非最不重要,这个项目现在进入合成生物学领域通过添加来自其他haloarchaeal物种的基因,转化的目的Hfx。volcanii成一个“醇工程研讨会”。

11。前景

近年来快速发展转变Hfx。volcanii成真正的热点模型物种,基因组和功能基因组测序,先进的遗传,生物化学,微生物,细胞生物学方法。值得注意的,Hfx。volcanii和负担沉重。salinarum是唯一的原核生物translatome分析已经完成,显示平移监管haloarchaea在真核生物一样重要。几个染色体和多倍体的存在主要的染色体Hfx。volcanii一个有吸引力的模型在研究并行的发展经由和多倍体的进化优势。此外,开创性的结果发现一种新的机制来翻译起始和桑普的小说家族蛋白质,马克古细菌蛋白质降解,将产生进一步的研究领域将产生结果的古生菌,甚至对所有原核生物。

发展在不久的将来应该包括更多的“蛋白质组学”中心的建立出口的表征蛋白质,低分子量蛋白质或蛋白质与特定的转译后的修改。此外,结合不同的功能基因组与生物信息学方法和建模仍然失踪h . volcanii、技术已被证明是非常强大的h . salinarum(比较相关出版物的Nitin Baliga Dieter Oesterhelt,例如,(127年,128年])。

此外,应发展方法研究蛋白质-蛋白质之间的关系,例如,几个Gfp变异,可用于研究蛋白质相互作用在活的有机体内使用烦恼,引入“haloarchaeal 2台混合动力系统”或更有效的生成标记蛋白复合物的亲和力隔离。只有少数haloarchaeal蛋白质的结构解决了直到现在,尽管事实上它已经预言,各种haloarchaeal蛋白质结晶条件应该比nonhaloarchaeal蛋白质的结晶更相似。它一直辩称,由于细胞质适应高盐浓度haloarchaeal蛋白的理化特性比蛋白质更相似的低盐生物。高度发达的遗传系统和表达向量,Hfx。volcanii似乎适合相应的生产过剩的蛋白质和其他嗜盐菌的不同的生产过剩的蛋白质的结晶和结构的决心。

虽然遗传系统h . volcanii是高度发达的,系统有效的转座子突变是失踪。早期尝试构建转座子haloarchaea没有导致期望的结果(129年];因此,在活的有机体内转座子突变可能难以实现haloarchaea细胞质盐浓度愈高。然而,在体外转座子突变的基因组文库随后转变似乎是可行的,已成功建立了基因更“复杂”的物种,如链霉菌属(91年]。同样,似乎没有技术障碍反对使用库与基因组基因片段远低于平均尺寸在可选择的向量进行全基因组随机插入突变。

正如上面列出的,高通量基因和表型出现方法已经开发出来,需要和一个社区的努力Hfx。volcanii的第一热点收集所有基因的缺失突变体可以实现。最后但并非最不重要的,作为一个喜盐生物溶解在低盐条件下,Hfx。volcanii是生物安全的物种可能很一般用于教学目的在学校和公共科学意识。

确认

作者衷心感谢所有成员的他的团队,多年来,与努力工作实现了所有的结果导致他集团在本文引用的出版物(以及更多),和他一直重视不仅科学,而且人类品质的成员组。作者还要感谢的同事和朋友Haloferax volcanii年,社区,在某些情况下,几十年来,他们共享。在他看来,这是一个非常特殊的社区特点是愉快的同事,未发表的观点和自由讨论的结果,和未发表的材料的自由交流。可能这样保持。他由于两个评论家有价值的评论。他还感谢德国研究委员会(DFG)资助的h . volcanii过去和目前的项目。

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古生菌

功能基因组和先进的遗传研究揭示出小说的见解新陈代谢,调节和生物学Haloferax volcanii

文摘