改善Hyperthermophilic的催化活性海床horikoshii脯氨酰氨基酸酶解毒的有机磷神经毒气在广泛的温度

文摘

脯氨酰氨基酸酶水解Xaa-Pro二肽,也可以叫p和P-O债券中发现有机磷(OP)化合物,包括神经毒气沙林和索曼。Ph1prol (PH0974)曾被孤立和特征海床horikoshii并显示在广泛的pH值范围,有较高的催化活性更高的亲和力金属和热稳定性而增加p . furiosus脯氨酰氨基酸酶,Pfprol (PF1343)。获得一个更好的酶OP神经剂去污和调查可能影响蛋白质热稳定性和thermoactivity的结构性因素,随机突变Ph1prol酶被准备。四个Ph1prol突变体(A195T / G306S - Y301C / K342N -, E127G / E252D -,和E36V -Ph1prol)孤立有更高的热稳定性和改善活动在一个广泛的温度对Xaa-Pro二肽和OP神经毒气与野生型相比海床脯氨酰氨基酸酶。

1。介绍

海床horikoshii和海床furiosus都是hyperthermophilic古生菌,生长在98 -100°C下孤立从冲绳海槽深的深海热液喷口东北部太平洋和浅海洋硫质喷气孔火山岛海岸的意大利,分别为(1,2]。海床种虫害是迄今为止最hyperthermophilic古生菌研究的一些部分是由于他们的效用为各种生物技术的应用程序3- - - - - -7]。例如,重组脯氨酰氨基酸酶海床种虫害正在研究的潜在用途bio-decontamination应用程序(8]。

脯氨酰氨基酸酶功能在活的有机体内在糖基水解与脯氨酸二肽,Xaa-Pro和非极性氨基酸的n端(9]。然而,研究表明脯氨酰氨基酸酶可以水解和解毒有机磷(OP)化合物等化学战剂(公告)8]。两个酶的特点已经势场解毒的神经毒气有机磷酸anhydrolase (OPAA)和phosphotriesterase (PTE) [10,11]。最近,OPAA的晶体结构Alteromonassp。JD6.5应变已经得到解决,已经确定为脯氨酰氨基酸酶(12]。虽然OPAA确实有能力降低OP神经毒气,它的活动可以限制暴露于高温和溶剂在使用过程中在现场的情况下(13,14]。

2008年,国防威胁降低局(DTRA)的赞助下国防部承认发展的重要性enzyme-based OP神经剂解毒系统,创建了一个倡议,呼吁新的酶和生物催化剂,稳定在一个广泛的温度和pH值范围,在盐和表面活性剂的存在,不造成环境污染(15]。为了应对需要开发稳定OP神经性毒剂降解酶系统,耐热性的脯氨酰氨基酸酶海床种虫害进行了研究[16- - - - - -18]。

具体地说,海床脯氨酰氨基酸酶从p . furiosus(PF1343或Pfprol)和p . horikoshii(PH1149或Ph值prol PH0974或Ph1prol)结构和酶学特征(16,18,19]。的海床脯氨酰氨基酸酶测定是非常相似的,Pfprol显示88%的氨基酸相似性Ph值prol和55%的相似Ph1prol。尽管他们有很高的相似性,的动力学性质Ph1prol似乎更有利于应用程序的目的的Pfprol和Ph值prol。Ph1prol表明更高的活动在较低的温度和pH值在一个更广泛的范围。它有长期稳定、更高的亲和力为基质,金属催化(要求较低16]。因此,它被认为是有利的Ph1prol诱变研究为了发展更好的OP神经毒气解毒酶,进一步研究影响高温近年的催化因素。为此,一个随机诱变Ph1prol基因文库构建和筛选突变体的生产,增加脯氨酰氨基酸酶活性在30°C与野生型相比Ph1prol。四个Ph1prol突变体被孤立和随后的特点确定其底物催化在广泛的温度和他们的表现对OP神经性毒剂类似物相比Ph1prol和前面的特点Pfprol。

2。材料和方法

2.1。细菌菌株,媒体,和材料

的大肠杆菌k - 12导数NK5525 (快速三角帆船::Tn10)是用于构造选择应变JD1 (λDE3)中描述20.为筛选的低温p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶变异。的p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶表达质粒的宠物-Ph1prol以前建造中描述(16]。的大肠杆菌菌株培养在Luria-Bertani(磅)肉汤或M9选择性基本培养基补充0.2%葡萄糖,1毫米MgSO4, VitB 0.05%₁,20μM IPTG, 20μM Leu-Pro。氨苄青霉素(100μg / mL),卡那霉素(50μ氯霉素(34 g / mL)μg / mL),四环素(6μg / mL)在需要时被添加到培养基中。

2.2。建设一个pET-Ph1prol池质粒编码随机突变p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶基因

易错PCR诱变使用Genemorph II随机诱变工具包(Stratagene,加州拉霍亚)被用来放大和插入突变p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶基因(PH0974)。进行PCR扩增30周期:(60秒在95°C, 60秒55°C, 120秒在72°C), 10分钟最终在72°C扩展。反应包含Mutazyme II反应缓冲区,125 ng /μ每个引物的L, 40毫米核苷酸混合,和2.5 U Mutazyme二世的DNA聚合酶。最初的DNA模板数量是250 ng和750 ng为了选择中低型变异率,分别。Genemorph II EZClone (Stratagene,加州拉霍亚)反应是采用突变脯氨酰氨基酸酶基因克隆到表达载体pET-21b。

EZClone反应包括EZClone酶混合,50 ng模板质粒(pET-prol), 500 ng megaprimer(突变脯氨酰氨基酸酶PCR产物)和EZClone解决方案。25日周期的反应是放大:(50秒95°C, 50秒60°C, 14分钟在68°C)。放大产品消化Dpn我2小时37°C到删除模板质粒。XL1-Gold超级主管大肠杆菌细胞转化突变质粒的混合物。

2.3。低温筛查活动增加

宠物,Ph1prol突变质粒p . horikoshii图书馆变成了选择性应变JD1 (λDE3)和镀在M9选择性琼脂板上。殖民地,被孵化3 7 d后20°C被孤立在磅中等盘子然后生长在10毫升磅在37°C用颤抖(200 rpm),直到一个光学密度0.6 - -0.8。IPTG随后添加到细胞培养的最终浓度1毫米。诱导文化发生了动摇37°C 3 h在收获细胞。这些细胞颗粒细胞溶解使用300年μL B-per缓冲区(热科学,罗克福德,生病),以及由此产生的细胞提取物用于酶活性测定在30°C和100°C。热处理可溶性蛋白质样本加热20分钟的80°C。高四突变殖民地表现出至少2-3-fold活动细胞表达野生型相比p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶被选为特征,他们的质粒是孤立的。脯氨酰氨基酸酶基因存在于这些孤立的质粒测序使用T7启动子和T7终结者引物(MWG生物技术,亨茨维尔)。

2.4。大规模的重组表达p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶突变体

的生产p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶变异(A195T / G306S - Y301C / K342N -, E127G / E252D -,和E36V -Ph1prol)进行转换大肠杆菌BL21 (λDE3)细胞与适当的宠物Ph1prol质粒和pRIL向量。1 L文化的转化株种植autoinduction媒体(21在37°C)孵化用颤抖的一夜之间(200 RPM)。

2.5。纯化的重组p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶突变体

从四个细胞球Ph1prol变体(A195T / G306S - Y301C / K342N -, E127G / E252D -,和E36V -Ph1prol)在50 mM Tris-HCl停牌,pH值8.0(3毫升每1克三细胞粘贴),1毫米苯甲脒和1毫米德勤。对于每一个变体,稀释细胞浆通过细胞(20000磅/法国的压力²三次)。细胞溶解产物离心机在38720 x g在4°C为30分钟,然后上层清液被加热到80°C的30分钟厌氧蛋白质变性任何不稳定的温度。热处理上层清液在38720 x g离心去除变性蛋白。上层清液取样热处理前后的活动分析。(NH₄)₂所以₄是逐渐添加到上层的最终浓度为1.5 M在装船前5毫升Phenyl-Sepharose疏水作用层析柱(Hi-Trap苯基惠普列,通用电气医疗集团生命科学,皮斯卡塔韦,NJ)。分数包含脯氨酰氨基酸酶突变体是汇集和透析一夜之间成4 L(50毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值8.0在4°C,并进一步纯化5毫升问琼脂糖阴离子交换色谱柱(Hi-Trap Q FF列,通用电气医疗集团生命科学,皮斯卡塔韦,NJ)。缓冲区的纯化步骤都被描述在16]。分数进一步净化步骤都是可视化使用sds - page SDS-polyacrylamide凝胶(12.5%)和酶活性进行测试。分数基于凝胶图像,然后汇集和酶股票被储存在−80°C。的分子量Ph1prol和突变体是大约40.04 kDa。的纯度Ph1prol突变是估计超过95%使用视觉检查SDS-polyacrylamide凝胶和电泳芯片分析。

2.6。脯氨酰氨基酸酶酶活性测定

酶活性测定协议是基于先前所描述的方法(17,20.]。反应混合物(500μL)包含50 mM拖把缓冲区(3 - [N吗啉代]propanesulfonic酸)pH值7.0,200毫米氯化钠,水、甘油(卷/期),100年的5%μg / mL BSA(牛血清白蛋白)蛋白质,0.2毫米CoCl₂和酶。反应混合物加热在100°C 5分钟允许金属和酶进行交互。的反应是由添加底物(Xaa-Pro 4毫米最终浓度),并允许继续10分钟100°C。与500年反应停止μL冰醋酸和500年μL茚三酮试剂(wt.卷)(3%),再次加热10分钟100°C。然后反应是冷却到23°C。脯氨酰氨基酸酶样本化验一式三份和具体活动使用的吸光度值计算在515 nm和4570 M的消光系数¹厘米⁻¹ninhydrin-proline复杂。

分析评估温度剖面图,WT -Ph1prol和四个脯氨酰氨基酸酶突变体化验一式三份的活动4毫米Met-Pro 10°C, 20°C, 35°C, 50°C, 70°C, 100°C。实验进行了一式两份。

2.7。底物特异性和动力学实验

为了研究底物特异性,以下Xaa-Pro二肽被用作基质(4毫米的最终浓度)为WT -酶活性分析Ph1prol和四脯氨酰氨基酸酶突变体:Val-Pro Met-Pro, Phe-Pro, Leu-Pro Ala-Pro, Gly-Pro。脯氨酰氨基酸酶与另外两个基板样本化验,Pro-Ala Val-Leu-Pro,进一步说明脯氨酰氨基酸酶偏好Xaa-Pro二肽(20.]。动力学参数的Ph1prol突变体是通过一系列Leu-Pro在70°C浓度(0.25 -12毫米)。

2.8。热稳定性和贮存期实验

热稳定性实验研究在WT -复制Ph1prol和四个突变体。每个酶稀释浓度为0.04 mg / mL的50 mM拖把,pH值7.0,200毫米氯化钠和孵化厌氧密封小瓶在90°C。一个初始样本被送往代表时间= 0 h,和额外的时间= 24采集标本,48和72 h。样本稀释到0.4μ在50 mM拖把g / mL, pH值7.0,200毫米生理盐水,然后被化验一式三份按照酶活性分析协议中描述的部分2。6。在所有情况下,底物用于Met-Pro活动分析是4毫米。

贮存期的实验也在重复执行。每个酶稀释浓度为0.04 mg / mL的50 mM拖把,pH值7.0,200毫米氯化钠和孵化厌氧密封小瓶在70°C。一个初始样本被送往代表时间= 0天,和额外的采集标本时间= 1,7、14、16、21天。样本稀释到0.4μ在50 mM拖把g / mL, pH值7.0,200毫米生理盐水,然后被化验一式三份,以确定具体的活动。

2.9。DSC实验

差示扫描量热法进行使用MicroCal VP-DSC扫描量热计。量热样本包含~ 1毫克/毫升蛋白质在50 mM拖把,200毫米氯化钠,0.2毫米CoCl₂,pH值7.0。蛋白质样本透析前15 h在这种缓冲实验。在装货前样品脱气室细胞。量热实验是由加热样品扫描速率达到100°C /人力资源。

2.10。DFP (diisopropylfluorophosphate)测定

水解的DFP脯氨酰氨基酸酶测定通过监测氟释放与fluoride-specific电极(如前所述22]。化验进行35°C和50°C,连续搅拌2.5毫升的缓冲区(50毫米拖把,200毫米氯化钠,pH值7.0),0.2毫米CoCl₂DFP和3毫米。酶在反应温度和金属被孵化前5分钟开始的反应。的背景DFP水解测定通过运行没有酶的反应出现在35°C和50°C。DFP被减去的背景水解酶水解来确定酶的特定活动。

2.11。p-Nitrophenyl索曼化验(O-Pinacolylp-Nitrophenyl Methylphosphonate活动)

脯氨酰氨基酸酶水解的p-nitrophenyl索曼被积累的监控p-nitrophenolate [10,22]。合成了对硝基苯索曼的在阿伯丁试验场Edgewood化学生物中心,医生,包含四个立体异构体的外消旋混合物。索曼模拟的纯度大于90%基于气相色谱分析12]。两毫升反应化验包含缓冲区(50毫米拖把,200毫米氯化钠,pH值7.0),0.2毫米CoCl₂,0.3毫米p-nitrophenyl索曼。反应在三个不同温度(35°C, 50°C和70°C)。这种酶和金属在指定的反应温度孵化前5分钟开始的反应。产品的吸光度p-nitrophenolate测量在405海里一个5分钟的范围内。的消光系数计算活动p-nitrophenolate 10101⁻¹厘米⁻¹是使用。

3所示。结果与讨论

3.1。p . furiosus和p . horikoshiiProlidase-Specific活动与OP神经毒气:DFP和索曼模拟

先前的研究描述p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶同族体1 (Ph1prol PH0974)表明,它具有较高的催化活性在更广泛的pH值范围内,金属亲和力高,耐热性的比p . furiosus脯氨酰氨基酸酶(Pfprol PF1343)或p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶(Ph值prol PH1149)当化验二肽底物Met-Pro [20.]。基于这些有利的属性Ph1prol当反应其天然底物,Xaa-Pro二肽,有兴趣决定重组的相关活动Ph1prol相比Pfprol和Ph值prol对g字神经性毒剂模拟的DFP索曼模拟,p-nitrophenylsoman。显示在图1,DFP表现出最大的水解Ph1prol。Ph1prol相对活动,高出843%Pfprol高出817%Ph值prol 35°C和高出1870%Pfprol和Ph值prol 50°C(图1)。相比之下,索曼的趋势模拟是非常不同的,如图2。的相关活动Ph1prol仅为70%,63%,和68%的Pfprol活动35°C, 50°C,分别和70°C(图2)。这些结果表明,Ph1prol偏爱DFP,不表现出高与索曼模拟活动。蛋白质结构的差异可能发挥作用在衬底的偏好Pfprol和Ph1prol份额只有55%的氨基酸残基相似(16]。通过改变Ph1prol结构进一步使用一个随机诱变方法,有可能分离Ph1prol变异显示更大的水解DFP和/或改善对索曼模拟活动。

3.2。筛查和隔离的Ph1prol使用脯氨酸突变人口营养缺陷型的菌株JD1 (λDE3)

自Ph1prol显示最有利的属性包括与DFP更高的活动,它被选为进一步使用易错PCR诱变战略,采用突变聚合酶。改变了大肠杆菌JD1 (λDE3)细胞被用来选择Ph1prol变异最小媒体板块,补充了20μM Leu-Pro增长20°C。3 7天可见殖民地都镀上最小和富媒体(磅)。Ph1prol变异筛选使用小规模(10毫升)和IPTG诱导表达文化。四个Ph1prol变异的200多个筛选后被选为测序显示双重更高的活动与Leu-Pro 30°C和活动有所减少在100°C与野生型相比。活动在较低温度的增加30°C和变化在100°C的温度越高表明嗜热蛋白的突变,可以妥协的活动或稳定在较高的温度,而是可以创造更多的灵活性和增加在较低温度下催化。

3.3。测序的Ph1prol突变体

在排序之前,四个Ph1prol突变体被数(10,19岁,35岁,和72年)完全基于他们的顺序被孤立。测序的变异显示每个突变的氨基酸替换的位置(图3)。突变体。10has two mutations: one at position 195 in which there is a change from alanine to threonine (A195T) and the second at amino acid residue 306 in which glycine is changed to serine (G306S). Both of these mutations reside in the C-terminal region ofPh1prol。突变体。19has two mutations: one at position 301 in which there is a change from tyrosine to cysteine (Y301C) and the second at amino acid residue 342 which has a substitution of lysine with an asparagine (K342N). Both of these mutations are in the C-terminal region of the enzyme. Mutant no.35 contains two mutations: one at position 127 in theα螺旋链接器区域中有一个变化从谷氨酸、甘氨酸(E127G)和第二位置252 c端地区的替换为天冬氨酸谷氨酸(E252D)。突变体。72is the only mutation in the N-terminal region at position 36 with a change from glutamate to valine (E36V) inPh1prol。活性位点的突变是远程的口袋里,在图所示3是位于两个3₁₀螺旋(红色螺旋、残留191 - 195和281 - 284年)。因此,突变是不可能直接改变活性部位化学。而E36V等突变,E127G Y301C可能影响脯氨酰氨基酸酶二聚的残留物是位于二聚接口。此外,突变可能影响酶的构象变化以来的一些突变位于循环和链接器区域。构象的变化动态给变异更好的活动在更广泛的温度显示部分3.4。

3.4。诱变的温度曲线的影响p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶变异

野生型的Ph1prol和四个变量在100°C(图最活跃4)。WT -Ph1prol和E36V -Ph1prol有非常高的具体活动(3955 U / mg和4094 U /毫克,resp)。4毫米Met-Pro,两者都是两倍的Pfprol在100°C (2154 U / mg) (21]。A195T / G306S -和E127 G / E252D -Ph1prol略不活跃(2307 U / mg和2831 U /毫克,resp)比WTPh1prol, Y301C / K342N -Ph1prol显示活动的最低水平相比其他突变体1842 U /毫克。活动降低了一半以上在70°C的变体;然而,WT -Ph1prol A195T / G306S -, E36V -Ph1prol都有特定的活动近1000 U /毫克(973 U /毫克,1000 U /毫克,和913 U /毫克,职责),而具体的活动Pf在70°C prol 806 U / mg [21]。在50°C, Y301C / K342N -Ph1prol有较高的特定活动比任何其他变体和野生型(450 U /毫克),大约三倍更活跃Pfprol 50°C (21]。

在较低的温度下,35°C, 20°C和10°C, Y301C / K342N -Ph1prol相当大的程度上胜过其他Ph1WT - prol变体Ph1prol WT -Pfprol和R19G / G39E / K71E / S229T -Pfprol(最高的表演Pf在较低温度下prol突变)[21]。在35°C, Y301C / K342N -Ph1prol (298 U / mg)相对活动,121%的WT -Ph1WT - prol, 489%Pfprol, 244%的R19G / G39E / K71E / S229T -Pfprol (246 U /毫克61 U /毫克,和122 U /毫克,职责)。在20°C, Y301C / K342N -Ph1prol (241 U / mg)相对活动184% WT -Ph1prol WT -高出964%Pfprol, 482%高于R19G / G39E / K71E / S229T -Pfprol(具体活动的WT - 131 U /毫克Ph1prol 25 U / mg WT -Pfprol和50 U /毫克R19G / G39E / K71E / S229T -Pfprol) [21]。最大的性能改进Ph1prol突变体被化验时10°C。Y301C / K342N -Ph1prol (109 U / mg)相对活动是166%高于WT -Ph1WT - prol,高出1982%Pfprol, 396%高于R19G / G39E / K71E / S229T -Pfprol(具体活动的WT - 66 U /毫克Ph1prol 5.5 WT - U /毫克Pfprol和27.5 U / mg R19G / G39E / K71E / S229T -Pfprol) [21]。

3.5。诱变的底物特异性和动力学的影响p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶变异

底物特异性的WT -Ph1prol表所示1随着A195T / G306S -的特定活动,Y301C / K342N -, E127G / E252D -, E36V -Ph1prol,报道的比例相对于野生型的活动。WT -Ph1prol最活跃的二肽Val-Pro (4602 U /毫克),而突变体A195T / G306S -, Y301C / K342N -, E127G / E252D -, E36V -Ph1prol低得多的活动为33%,36%,46%,和56%的WTPh1分别prol。A195T / G306S -Ph1prol显示活动与Met-Pro最高143%的野生型(2809 U /毫克),而Y301C / K342N - E127G / E252D -, E36V -Ph1prol首选Ala-Pro与特定活动的183%,324%和556%的WT -Ph1prol (1452 U /毫克)。WT -Ph1prol似乎更喜欢最疏水性氨基酸,而四个变异最高的活动与更少的疏水氨基酸氨基二肽基板的位置。而丙氨酸被认为是疏水性氨基酸,疏水性比缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和甘氨酸是最相似的结构。WT -Ph1prol已经低得多的活动与Gly-Pro Ala-Pro(369比1452 U /毫克)。A195T / G306S -, Y301C / K342N -和E127G / E252D -Ph1prol较少或类似的活动与Gly-Pro相比WT -Ph1prol E36V -时(369 U /毫克)Ph1prol活动高出444%。

具体的活动是一贯低Pro-Ala和Val-Leu-Pro (2 U /毫克,WT -Ph1prol)野生型Ph1prol和四个突变体。由于脯氨酰氨基酸酶酶的性质和其独特的分裂能力之间的债券Xaa-Pro二肽,它预计,这种酶不会显示任何显著的活动与Pro-Xaa二肽和三肽。虽然两个四个变量(突变体A195T / G306S -和E36VPh1prol)显示与Pro-Ala活动增加与野生型相比,必须指出特定的活动与Pro-Ala WT -Ph1prol非常低,仅14 U /毫克。Y301C / K342N -Ph1与Val-Leu-Pro prol 88% WT活动;然而,WT -Ph1prol-specific活动只有2 U /毫克。

的催化活动WT -Ph1prol及其突变体进行了测试在70°C Leu-Pro(表2)。所有Ph1prol突变体有更高比WT -值Ph1prol表明氨基酸突变酶的变化并对结构产生影响,最终与衬底Leu-Pro脯氨酰氨基酸酶的催化活性。虽然值较高,整体酶周转率没有比WT -一些突变体Ph1prol。所有的Ph1prol突变体显示流动率增加,/,Leu-Pro Y301C / K342N -除外Ph1prol。这可能是由于增加的的突变,这几乎是三倍WT -Ph1prol。

3.6。影响热稳定性和贮存期活动的氨基酸替换p . horikoshii脯氨酰氨基酸酶突变体

确定四个氨基酸替换Ph1prol变异对热稳定性有影响,突变体孵化在密封的瓶在90°C,厌氧,72 h。采集标本每24 h与Met-Pro测量催化活性(4毫米)作为底物。在Theriot et al . 2010,表明WT -Pfprol比其更耐热性的突变体和失去了50%的活动与Met-Pro 21小时在90°C (20.]。在90°C 40 h后,WT -Ph1prol失去了50%的活动。突变体Y301C / K342N -Ph1prol E127G / E252D -Ph1prol都证明增加热稳定性在90°C与野生型相比,失去了50%的活动58小时后孵化。突变体A195T / G306S -Ph1prol和E36V -Ph1prol显示50%活动后32和35小时的损失在90°C,分别。两个WT -Ph1prol和四Ph1prol突变体稳定在90°C大大延长时间Pfprol及其突变体(20.]。

贮存期活动监测与采集的样本在21天每7天到14天,然后再在天16和21日而样本孵化厌氧在70°C(图5)。贮存期与WT -实验Pfprol及其突变体报道Theriot et al ., 2010人在48小时内进行在70°C (20.]。与WT -初步适用期实验Ph1prol及其突变体,具体活动与Met-Pro仍非常高48 h后(没有明显的减少在特定活动检测;数据未显示),所以实验直到酶被认为是不再活跃(21天)。最初为WT -特定的活动Ph1prol、A195T / G306S - Y301C / K342N -, E127 G / E252 D -和E36V -Ph1prol 3150 U /毫克,3400 U /毫克,1250 U /毫克,2200 U /毫克,和3600 U /毫克,分别与4毫米Met-Pro衬底。WT -Ph1prol失去了50%白天活动的孵化12 70°C。突变体Y301C / K342N -, E127G / E252D -, E36V -Ph1prol活动剩下的50%天12日13日和14日,分别。A195T / G306S -Ph1prol为50%活动10天后在70°C。在70°C 21天,所有五个脯氨酰氨基酸酶在25%或以下的初始活动。

报道在Theriot et al ., 2010 WT -的具体活动Pfprol及其三个突变体(G39E, R19G / K71E / S229T -,和R19G / G39E / K71E / S229T -Pfprol) 1083 U /毫克,599 U /毫克,722 U /毫克,和4496 U /毫克,分别与4毫米Met-Pro 48 h后的孵化70°C (20.]。相比之下,后7天(168小时)在70°C, WT -Ph1prol、A195T / G306S - Y301C / K342N -, E127G / E252D -, E36V -Ph1prol特定活动的2950 U /毫克,3050 U /毫克,1230 U /毫克,2650 U /毫克,和2400 U /毫克,分别有4毫米Met-Pro。在70°C, 48 h后WT -Pfprol有较高的比活度比的突变体(1083 U /毫克)。7天后在70°C, Y301C / K342N -Ph1prol显示最低的特定活动Ph1脯氨酰氨基酸酶;然而,它仍然有活动WT -的114%Pfprol在48小时20.]。

3.7。DSC结果

野生型的热稳定性Ph1prol变异是由差示扫描量热法(DSC)实验。表3显示了野生型和变异酶的变性温度。的突变,提高催化活性Ph1prol在低温下不影响酶的温度稳定性。

3.8。氨基酸替换对底物特异性的影响与OP神经毒气DFP索曼模拟,p-Nitrophenyl索曼

底物特异性的WT -Ph1prol DFP如图6随着A195T / G306S -的特定活动,Y301C / K342N -, E127G / E252D -, E36V -Ph1prol,报道的比例相对于野生型的活动。WT -Ph1prol是最活跃和DFP 35°C和50°C与特定活动的4 U / mg和10 U /毫克,分别。突变体A195T / G306S Y301C / K342N, E127G / E252D -, E36V -Ph1prol与DFP显著降低活动;即使在50°C活动仅为59%,25%,和55%的WT -Ph1prol活动。然而,应该指出的是,Ph1prol突变体有808%、183%和402% (A195T / G306S Y301C / K342N -, E127G / E252D -,和E36V -Ph1prol、职责)的DFP活动WT相比p . furiosus脯氨酰氨基酸酶也优于最高DFP活动报道R19 / G39E / K71E / S229TPfprol变异,显示有398%高于WT的活动Pfprol [21]。

图7揭示了一个不同的趋势,在WT -突变Ph1prol索曼模拟特定的活动增加,p-nitrophenyl索曼。WT -Ph1prol显示最高的活动与索曼模拟在70°C,具有特定的活动0.56 U /毫克。突变A195T / G306S -Ph1WT - prol有着相似的特定活动Ph1prol孵化时35°C, 50°C, 70°C。突变体Y301C / K342N -, E127G / E252D -, E36V -Ph1prol显示活动增加与索曼模拟WT -Ph1prol在每个试验温度。最重要的具体的活动与索曼模拟被认为与Y301C / K342N - E127G / E252D -, E36V -Ph1prol在70°C,它关联到125%,比WT -增加186%和157%Ph1prol。此外,的活动Ph1prol突变体对p -nitrophenyl索曼(0.7,1.0,和0.9 U / mg Y301C / K342N - E127G / E252D -,和E36V -Ph1prol、职责)比较积极地改善索曼模拟活动的报道p . furiosus脯氨酰氨基酸酶突变体(0.86,1.02,和1.7 U / mgfor G39E, R19G / K71E / S229T -,和R19G / G39E / K71E / S229T -Pfprol,职责)。20.]。当看着WT -的底物特异性Ph1prol变异与脯氨酸二肽,它注意到,有一个将优先从更多的疏水疏水氨基酸的突变体。这也是与OP神经毒气,哪里有转变的底物特异性DFP索曼模拟。WT -Ph1prol喜欢DFP索曼模拟作为衬底,而Ph1prol变异显示减少活动与DFP索曼模拟活动增加。

4所示。结论

当前biodecontamination配方退化OP合并神经毒气Alteromonas脯氨酰氨基酸酶(OPAA)和PTE有限制在现场使用时12]。长期稳定的酶是不可以实现的混合配方,包括其他溶剂和变性的解决方案,以及需要添加多余的金属达到最大活动带来了进一步的并发症enzyme-based解毒系统。一个高度活跃的酶,这种酶是长期稳定的,需要很少的金属将最适合这个应用程序。野生型和突变体脯氨酰氨基酸酶的特点p . horikoshii显示有前途的酶学性质,使他们潜在的候选人为未来优化研究OP神经性毒剂降解。相比Pfprol,Ph1prol和四Ph1prol突变体显示更高的活动,提高底物的亲和力,和显著降低金属催化的要求。的两个变体,Y301C / K342N E127G / E252D -Ph1prol只要耐热性的近3倍Pfprol和时间的两倍Ph1prol。A195T / G306S -Ph1prol拥有808%的DFP活动与野生型相比p . furiosus脯氨酰氨基酸酶和优于任何改善p . furiosus脯氨酰氨基酸酶突变体(21]。此外,Y301C / K342N - E127G / E252D -, E36V -Ph1prol所有改善活动p -相对于WT - nitrophenyl索曼Ph1表现最好的prol也比较有利p . furiosus脯氨酰氨基酸酶突变体(20.]。的Ph1prol变异有可能显著改进当前biodecontamination策略。增加热稳定性和锅生活和活动对OP神经性毒剂模拟值得进一步研究这些脯氨酰氨基酸酶的大规模生产和净化。

确认

作者要感谢雪莉Tove博士对她有用的评论在纸上和承认Nathaniel Hentz博士和杰西卡·韦弗NCSU为培训和教育中心(BTEC)贡献他们的时间和知识脯氨酰氨基酸酶的纯化和表征。他们要感谢詹姆斯·卡尼和帕特里夏·巴克利博士进行了DSC实验。支持本研究提供的陆军研究办公室(合同编号。44258 lssr)。

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