建立一个Markerless遗传交换系统甲烷八叠球菌属mazei应变Go1构造染色体突变体的小RNA基因

文摘

markerless遗传交换系统被成功建立甲烷八叠球菌属mazei应变Go1使用成基因编码次黄嘌呤phosphoribosyltransferase。首先,染色体的缺失突变体成基因生成嘌呤模拟8-aza-2产生抗性,6-diaminopurine (8-ADP)。当时的等位基因交换向量(pRS345)携带pac直接选择染色体整合为盒式,成基因counterselection被引入这个压力。的突然出现,最终脱颖而出事件的质粒染色体,等位基因交换启用。使用这个系统,我们成功地产生了m . mazei缺失突变体的基因编码的监管非编码RNA sRNA_154年。描述m . mazei 氮限制的条件下证明了微分表达式至少三个细胞质蛋白质和减少增长的强烈主张的sRNA中的重要角色_154年通过转录后的调控监管的固氮作用。

1。介绍

甲烷八叠球菌属mazei应变Go1属于methylotrophic产甲烷古生菌由于甲烷产量的作用,是高生态相关性(1]。它作为一个热点模型为研究氮应激反应,盐适应,甲烷生产不同基质、能量代谢以及分析小分子rna的作用作为监管元素在应激反应2- - - - - -7]。尽管它只生长在严格的厌氧条件下,生物基因容易处理,可以获得单菌落琼脂板上,一般要求基因研究[8,9]。然而,基因操作限制是因为嘌呤霉素是唯一可选的标记为methanoarchaea商用,这使一代的多个突变甚至互补实验。使用甲烷八叠球菌属acetivorans,麦特卡尔夫和同事开发了一个所谓markerless交换方法使用成基因编码次黄嘌呤phosphoribosyltransferase作为counterselectable标记(10]。一个成应变显示阻力对有毒嘌呤模拟8-aza-2 6-diaminopurine (8-ADP)后可用于counterselection集成的nonreplicable包含野生型质粒成基因重组与侧翼地区所需的突变。完整的质粒是集成到网站所需的突变(突然出现)染色体由一个同源重组事件,使应变敏感8-ADP并允许选择嘌呤霉素耐药性。的存在选择切除plasmid-based 8-ADP许可成基因(与向量骨干)由另一个单一的同源重组(弹出)事件。在这一事件中,感兴趣的基因突变可以交换的构造(10]。从理论上讲,等位基因交换发生的几率50%导致所需的突变株。

本研究的目的是建立这种方法m . mazei为了让markerless染色体缺失或小监管RNA基因的点突变。设置系统,成应变以及包含野生型等位基因交换向量成基因counterselection生成。验证方法,我们小非编码RNA sRNA删除_154年。这sRNA已经识别出一个基因组广泛RNA-seq屏幕,显示不同转录依赖氮的可用性(7]。我们建议sRNA_154年在氮调控中起着重要的作用m . mazei可能增加另一个监管的监管机制通过通用转录阻遏NrpR氮(11,12]。sRNA_154年位于基因间区域MM3337 MM3338编码守恒和一个假设的蛋白质,分别为(7,13]。一个潜在NrpRI操作符(GGTA-N6-TACC)启动子区域sRNA已被确认_154年暗示这个小RNA基因直接控制下的全球监管机构NrpRI氮(7]。

2。材料和方法

2.1。细菌菌株和质粒

菌株和质粒用于这项研究表中列出1。质粒DNA转化为大肠杆菌根据井上的方法等。14),进入m . mazei最近使用liposome-mediated转换描述(8,15]。

2.2。增长

m . mazei野生型和突变株生长在基本培养基在氮气气氛下5到50毫升管封闭的增长,是在37°C的环境没有震动(18,19]。8-ADP屏幕,然而,酵母提取物的浓度在基本培养基从2 g / L减少到0.5 g / L。一般来说,媒介与150毫米甲醇或25毫米补充三甲胺(TMA)和40毫米醋酸作为碳源和减少2毫米cystein硫化钠和1毫米。铵氮有限增长,省略了从媒体;气相中的分子氮作为唯一氮源(19]。一般来说,甲烷八叠球菌属与100年文化补充g / mL氨苄青霉素预防细菌污染。对突变体选择、嘌呤霉素(5g / mL)添加到中、在counterselection markerless交换媒介是补充8-ADP (20g / mL)。增长是通过确定监测的光学密度文化介绍过o。d。邓肯在600 nm (_600年)。m . mazei野生型和突变株生长在固体培养基通过仔细传播包含25毫米TMA的底部细胞1.5%琼脂作为碳源和孵化intrachamber孵化器气氛下组成的79.9% N₂,20%的公司₂,0.1%的H₂通过添加5 s .突变体被选中嘌呤霉素或20克/毫升g / mL 8-ADP琼脂(最终浓度)。找出积极的注解突变体,单一的殖民地派生的8-ADP在平行板都是有补充嘌呤霉素和8-ADP,分别为嘌呤霉素敏感性和8-ADP电阻屏幕。

2.3。构建质粒

在这项研究中使用的所有引物补充表1中列出。产生的质粒m . mazei htp零突变构建如下:序列和上游的800个基点成使用染色体基因被放大m . mazeiDNA和底漆集Mm 201 800。/毫米201 800 /牧师和201毫米800。/毫米201 800。分别牧师。PCR产品获得包含额外的合成primer-mediated限制性位点,为800年在上游产品包括Bam你好,5′末端和生态国际扶轮网站800 3′末端和下游的片段生态国际扶轮网站5′末端和Kpn我在3′端网站。两个片段都限制使用Bam你好/生态国际扶轮和生态RI /Kpn我分别和克隆到pBSK +(美国Stratagene,加州拉霍亚)产生质粒pRS283。等位基因交换向量markerless交换被放大的生成成从染色体基因m . mazeiDNA使用毫米hpt的引物和Mm hpt与额外的牧师BamH1和Xho我的网站,分别。PCR片段消化利用Bam你好,Xho我和结扎Bam你好,Xho线性化pBSK +质粒pRS311。为了提供成基因的pRS311古子强,已知的pmcr启动子的产甲烷球菌属voltae(9)是克隆基因的上游。这是通过放大pmcr与引物pmcr BamHI和pmcr XhoI使用pRS207 [8)作为模板。PCR产物克隆成TOPO-TA-cloning向量pDRIVE试剂盒、希尔登,德国)产生质粒pRS269。消化的pRS269Bam嗨导致切除的pmcr启动子克隆到Bam你好,网站直接位于上游的成基因的质粒pRS311,导致pRS320。最后,1.7 kbp生态国际扶轮pRS204包含片段pac磁带组成型启动子的控制下(pmcr)和《终结者》(tmcr)从mcr基因的m . voltae克隆到的独特不我网站pRS320,产生质粒pRS345。这个质粒用于markerless等位基因交流通过克隆所需的突变成其独特美国心理学协会我的网站。构建m . mazeisRNA_154年缺失突变体,大约1000个基点的upstream-flanking地区小RNA放大使用底漆两毫米s154_1和毫米s154_1牧师使用基因组m . mazeiDNA作为模板。PCR产物(937 bp)是消化美国心理学协会我和Xho我(限制网站提供的引物;见强调序列)和结扎了美国心理学协会我/Xho我打开导致质粒pRS606 pMCL210向量。1364 bp PCR引物所产生的产品下游地区的Mm s154_2和Mm s154_2引入一个牧师Xho我和一个Sma我限制网站,分别,随后被克隆到一个Xho我/SmaI-linearized pRS606,融合sRNA_154年从而删除sRNA侧翼地区在一起_154年。质粒是指定pRS631。完全删除构造是切除使用美国心理学协会我和Sma绿豆核酸酶处理,我和结扎成pRS345,线性化美国心理学协会我跟着一个绿豆的质粒pRS632核酸酶治疗。所有构造序列分析验证了。

2.4。PCR分析突变菌株确认

验证sRNA_154年执行删除使用底漆两毫米s154_1和毫米s154_seq牧师~ 250 bp的产物bla基因是使用的引物bla启和bla放大。引物对pac1和pac2被用来生成一个~ 300 bp的产物pac盒式磁带。一般来说,2 ng的染色体DNA作为模板。

2.5。RNA和北部污点分析做准备

总RNA分解动作和北部污点分析本质上所述前(7),除了Isol-RNA裂解试剂(5 ' GmbH,汉堡,德国)是用于总RNA制备。

2.6。细胞提取

m . mazei细胞提取准备如前所述[20.]。65年克m . mazei野生型, 成和sRNA_154年原油提取12.5% sds - page分离。

3所示。结果与讨论

如前所述,markerless等位基因的交换最初的开发m . acetivorans是申请m . mazei使用成基因counterselection标记(10),成功地生成一个空的突变基因编码sRNA_154年。

3.1。Settingup Markerless交换系统m . mazei

methanoarchaea成为成员定期对嘌呤模拟8-ADP (2.9×10⁻⁵)[10),可能通过开发自发突变成基因编码一次黄嘌呤phosphoribosyltransferase。然而,我们决定建立一个成突变体通过应用普里切特的markerless交换方法等。(10而不是筛查自然发生的成不足的压力。pKS bluescript导数构造了载有800 bp的5′和3′侧翼的染色体区域m . mazei hpt基因融合在一起,从而创建一个成删除构造(pRS283)。当时的质粒pRS283变成了m . mazei *(8),被称为野生型,和成功整合到染色体通过一个单一的同源重组事件证实了嘌呤霉素耐药性的获得(图S1A)。单一的殖民地被接种到液体培养基中含有20克/毫升8-ADP。细胞携带野生型成基因在染色体8-ADP除非很敏感成由一个弹出式事件了,删除了吗成基因和质粒骨架(图印地)。不幸的是,使用的标准基本培养基m . mazei(18)不能用于这种方法作为8-ADP对细胞生长影响很小(图1(一))。酵母提取物,富含嘌呤和嘧啶,可能会影响吸收8-ADP。媒体的增长显著降低酵母提取物(0.5 g / L)清楚地表明,20g / mL 8-ADP抑制(图1 (b))。正如预期,m . mazei 成增长的8-ADP标准和yeast-reduced介质(数字1(一)和1 (b))。单一的殖民地m . mazei 成突变菌株获得的镀层在固体培养基含有8-ADP,随后进行嘌呤霉素检测的敏感性和同时8-ADP阻力裸奔在各自的盘子。确认删除成殖民地,显示所需的表现型受到印迹分析(数据未显示)。

(一)

(b)

(一)
(b)

图1

m . mazei 成 18 m . mazei _{2 2} m . mazei 一对。 经济增长的分析与野生型8-ADP的存在。两种不同的媒体进行了测试,(a)标准基本培养基()和(b)基本培养基和显著降低酵母提取物(0.5 g / L)。菌株生长在50毫升的各自媒介与150毫米甲醇作为碳源补充N的气氛/公司(80:20)。菌株孵化没有添加剂(打开符号)或20的存在g / mL 8-ADP(封闭的符号)。广场:野生型;三角形:标准差为每个应变表示三个复制。

在第二个步骤中,等位基因的交换向量pR345建于包含bla基因和pac为盒式的选择大肠杆菌和m . mazei分别的成基因counterselectable标记。提供成与强启动子基因,本机启动子与启动子交换pmcr的m . voltae(9]。独特的美国心理学协会我在pRS345网站提供了插入突变构建网站的兴趣。

3.2。代的一个m . mazeisRNA_154年染色体变异

验证系统,我们删除了该基因编码的小RNA_154年转录只在氮限制的条件下,据说在氮应激反应中扮演着中心角色7]。删除构造融合的侧翼地区sRNA生成的_154年在一起是插入美国心理学协会我的向量pRS345等位基因交换。由此产生的质粒(pRS632)变成了m . mazei 成应变之后,选择突然出现/弹出如上所述的事件。成功删除sRNA_154年基因被PCR评估。与引物PCR验证绑定sRNA -和下游_154年执行产生的PCR产物~ 1100 bp的野生型和~ 940个基点m . mazei sRNA_154年。表示发现野生型的PCR产物如预期m . mazei野生型和二倍体菌株质粒pRS632插入到染色体(图中2(一个))。各自的扩增子的sRNA_154年显然是在控制(pRS632),发现在二倍体应变和非常著名的八个潜力m . mazei sRNA_154年突变体分析(图2 (b))。然而,在七个八个假定的sRNA_154年突变体,微量PCR产品对应的产品来源于sRNA_154年野生型也被观察到。这可能是由于这一事实证明了古生菌拥有多个基因组拷贝,最近被Soppa和同事(21]。他们发现,m . acetivorans包含了17份依赖于增长阶段(21]。这多倍体可能会导致不完整的等位基因交换的染色体拷贝剩余的野生型。因为我们只能确认一个突变体八位候选人,看来这个困难时经常出现比预期产生的染色体突变体m . mazei。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图2

sRNA_154年 m . mazei m . mazei sRNA_154年, 成, _{154年 154年} m . mazei _154年 sRNA_154年 sRNA_154年 m . mazei bla pac m . mazei 成 154年 的验证通过PCR菌株。(一)质粒的卡通pRS623融入染色体。引物的PCR验证通过箭头所示(大小不符合实际比例)。(b)野生型和突变株和一个二倍体应变pRS632整合到染色体被测试为存在sRNA PCR分析基因和sRNA删除构造。Fermentas巷M, 100个基点标志;巷1:野生型;巷2:pRS623携带sRNA删除;巷3:二倍体应变;道4:不同候选菌株,而只有克隆在巷11显示了独特的基因型,并进一步分析了PCR分析。(c)分析了野生型和突变株的存在pRS632骨干通过PCR引物的放大部分和基因,分别。巷,100个基点标记(Fermentas);巷1:WT;巷2:;巷3:二倍体应变;巷4:。巷5:pRS632;巷6:水控制。

突变巷11(图中所示2 (b))显示sRNA_154年质粒去除PCR产物进一步检查。利用染色体DNA PCR分析m . mazei野生型,成突变,二倍体应变,sRNA_154年以及pRS632积极控制的存在得到了明确的论证bla和pac基因只在二倍体菌株和质粒控制,而为sRNA_154年,两个基因没有检测到。作为第二线的证据表明,北部污点分析总RNA源自于野生型,成和sRNA_154年菌株生长在氮限制的条件下,用放射性标记的寡核苷酸探针对sRNA_154年。与前面的数据一致,污点分析清楚地表明,sRNA北部_154年大小130核苷酸(nct)存在于野生型成菌株在氮限制的条件下,但没有检测到sRNA_154年删除应变,进一步证实成功markerless等位基因交换(图3)。通过生成这个ΔhptΔsRNA_154年突变体,称为sRNA_154年应变,有效地建立了markerless交换系统m . mazei。

图3

m . mazei sRNA_154年 m . mazei sRNA_154年, 成, ³² _154年 北部的污点分析压力。总RNA从各自的净化压力(和野生型氮限制条件下生长。10g的RNA分离变性6% PA凝胶,随后分析了北方使用一个污点sRNAP-ATP-labelled寡核苷酸同源。对于每一个样本,丰富的5 s rRNA决心排除RNA含量的变化。

3.3。描述的 sRNA_154年突变株

分析的功能角色sRNA_154年在氮代谢,我们的特点m . mazei sRNA_154年突变体生长条件下的氮限制,sRNA也是强烈的表达。分析了降低增长增长m . mazei sRNA_154年的增长率h = 0.02⁻¹相比h = 0.03⁻¹获得了野生型(图4(一))。尽管如此,sRNA_154年没有达到最终的细胞密度与野生型相同。负面影响固氮的缺席成基因分析增长行为被排除在外的父母的压力(m . mazei 成)(图4(一))。正如所料,没有这三个的不同生长表型m . mazei观察菌株在这个条件下sRNA氮充足_154年不是转录(图4 (b))。

(一)

(b)

(一)
(b)

图4

sRNA_154年 m . mazei ₄ ⁺ _{2 2} m . mazei 一对; m . mazei sRNA_154年。 经济增长的分析在氮限制的条件下与野生型(a)和下氮充足:(b)菌株生长在50毫升液体基本培养基补充与150毫米甲醇作为碳源氮限制的条件下与10毫米NH (a)和作为氮源(b)的气氛下N/公司(80:20)。打开圆:野生型;封闭广场:封闭的三角形:标准差为每个应变表示五个复制。

蛋白质表达模式的特征sRNA_154年氮限制和氮充足下一维sds - page显然证明差异蛋白质模式只有在氮气消耗(图5)。至少有三个不同的蛋白质被不同氮限制在缺乏sRNA下合成_154年与野生型相比(图5(一个))。两种蛋白质的分子质量(1和2)约66和40 kDa专门或突变更强烈的表达,而35 kDa蛋白质(3)存在于野生型,但似乎没有突变。这些发现表明,sRNA_154年控制蛋白表达都直接或间接地再一次强烈支持一位著名sRNA的函数_154年在氮的监管。

(一)

(b)

(一)
(b)

图5

sRNA_154年 m . mazei sRNA_154年, 成, 4 m . mazei sRNA_154年 蛋白质表达模式的分析在氮限制的条件下与野生型(a)和(b)下氮充足。的菌株和野生型生长在50毫升标准nitrogen-limiting条件下介质或氮充足(见图)。细胞收获指数增长阶段。等量的细胞提取物(65g)应用于12% SDS-PA凝胶,这是后来沾Coomassie蓝色。箭头1 - 3表明蛋白质乐队的微分表达式和野生型菌株。通用电气医疗集团标志:流明瓦标志。

的sRNA_154年突变体代表了第一个小RNA的染色体缺失突变体m . mazei。只有转录固氮条件下,大概全球氮调节器的控制下NrpRI [7),我们建议sRNA_154年在氮代谢调节中扮演核心角色。胞质蛋白的差异模式导致的增长sRNA_154年在固氮条件下的重要角色sRNA争论_154年固氮的监管。转录后的调控,sRNA_154年将添加另一个水平的氮代谢的调节m . mazei可能导致更严格的控制或微调的翻译目标mrna。

4所示。结论

通过生成一个成应变和等位基因的质粒替代,我们成功地应用markerless交换系统m . mazei。该方法进一步优化利用媒介与减少酵母提取物,从而提高在counterselection 8-ADP的毒性作用。一代的sRNA_154年揭示sRNA的角色_154年氮代谢,减少经济增长以及微分合成至少三种蛋白质缺乏sRNA固氮的条件下_154年。

确认

摘要财务支持的德意志Forschungsgemeinschaft (DFG)优先项目的一部分SPP 1258”在Prokaryoten Sensorische和regulatorische rna。”

引用

1. J.E.罗杰斯和w·b·惠特曼Eds。微生物生产和消费的温室气体:甲烷、氮氧化合物、卤代甲烷,ASM出版社,华盛顿,美国,1991年。
2. 埃勒斯,c . r . Grabbe k Veit, r . a .施密茨”GlnK1的表征甲烷八叠球菌属mazei应变Go1:互补的大肠杆菌glnk突变株G1nK1。”细菌学期刊,卷184,不。4、1028 - 1040年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. k·弗鲁格a Ehrenreich k .鲑鱼et al .,“识别基因参与archaeon盐适应甲烷八叠球菌属mazeiGo1使用全基因组基因表达分析,“《微生物学字母,卷277,不。1,第89 - 79页,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. Deppenmeier和诉穆勒,“生活接近热力学限制:产甲烷古菌如何节约能源,”结果在细胞分化和问题,45卷,第152 - 123页,2008年。视图:谷歌学术搜索
5. r·霍维,美国“Lentes a Ehrenreich et al .,“DNA微阵列分析甲烷八叠球菌属mazeiGo1揭示了适应不同的产甲烷基质,”分子遗传学与基因组学,卷273,不。3、225 - 239年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. g·格鲁伯,d . i Svergun Coskun et al .,“结构洞察A1 archaeon atp酶,甲烷八叠球菌属mazeiGo1。”生物化学,40卷,不。7,1890 - 1896年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. d .贼鸥c . m . Sharma j·汤姆森,埃勒斯,c . j .沃格尔和r . a .施密茨的“深度测序分析甲烷八叠球菌属mazeiGo1转录组对氮的可用性”,美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷106,不。51岁,21878 - 21882年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. 埃勒斯,c . k . Weidenbach k . Veit Deppenmeier, w•w•麦特卡尔夫和r . a .施密茨”遗传染色体的方法和建设的发展glnK1突变体甲烷八叠球菌属mazei应变Go1。”分子遗传学与基因组学,卷273,不。4、290 - 298年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. j·k·w·w·麦特卡尔夫得知张e . Apolinario k . r .苗圃和r·s·沃尔夫”为古生菌属的遗传系统甲烷八叠球菌属:liposome-mediated转型和建设航天飞机向量,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷94,不。6,2626 - 2631年,1997页。视图:谷歌学术搜索
10. m·a·普里切特、张j·k·w·w·麦特卡尔夫”markerless遗传交换方法的发展甲烷八叠球菌属acetivoransC2A及其用于建设新的产甲烷古菌的遗传工具,”应用与环境微生物学,卷70,不。3、1425 - 1433年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 埃勒斯,k . Weidenbach c j·考克,a Ehrenreich施密茨和r . a,“洞察NrpR调节子甲烷八叠球菌属mazeiGo1。”档案的微生物学,卷190,不。3、319 - 332年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. k . Weidenbach埃勒斯,c·j·考克,r . a .施密茨“NrpRII介导接触NrpRI archaeon和通用转录因子甲烷八叠球菌属mazeiGo1。”2月期刊,卷277,不。21日,第4411 - 4398页,2010年。视图:谷歌学术搜索
13. 美国Deppenmeier, a·约翰·t . Hartsch et al .,”的基因组甲烷八叠球菌属mazei:细菌和古生菌之间的横向基因转移的证据,”分子微生物学和生物技术杂志》上,4卷,不。4、453 - 461年,2002页。视图:谷歌学术搜索
14. 井上h, h . Nojima h .日本冈山,“高转换效率大肠杆菌与质粒基因,卷96,不。1,23-28,1990页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. 埃勒斯,k . Weidenbach j .戴手套,c . k .睡魔j . n·里夫和r . a .施密茨”古细菌组蛋白的缺失甲烷八叠球菌属mazei增长和基因组转录Go1导致降低。”分子微生物学,卷67,不。3、662 - 671年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. 诉l·米勒和j。j Mekalanos表示“小说自杀向量及其在建设使用插入突变:渗透调节的外膜蛋白和致病因素霍乱弧菌需要toxR”,细菌学期刊,卷170,不。6,2575 - 2583年,1988页。视图:谷歌学术搜索
17. 吉田y, y, y山下式,t·郎”建设的一系列pACYC-derived质粒向量,”基因,卷162,不。1,第158 - 157页,1995。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. 美国Deppenmeier m . Blaut a Mahlmann, g . Gottschalk以及“减辅酶F_420年:heterodisulfide氧化还原酶,proton-translocating氧化还原系统产甲烷细菌。”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷87,不。23日,第9453 - 9449页,1990年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 埃勒斯,c . k . Veit和施密茨r . a . g . Gottschalk以及单一的功能性组织nif嗜中温archaeon集群甲烷八叠球菌属mazei应变Go1。”古生菌,1卷,不。2、143 - 150年,2002页。视图:谷歌学术搜索
20. 埃勒斯,c . k . Weidenbach k . Veit k . Forchhammer和r . a .施密茨”独特的机械翻译后调控谷氨酰胺合成酶活性的特性甲烷八叠球菌属mazei应变Go1氮的可用性,”分子微生物学,55卷,不。6,1841 - 1854年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. c . Hildenbrand t .股票,c·兰格m·洛特和j . Soppa”基因组拷贝数和基因转换产甲烷古菌”细菌学期刊,卷193,不。3、734 - 743年,2011页。视图:谷歌学术搜索

版权

版权©2011埃勒斯等克劳迪娅。这是一个开放的分布式下条知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。