的基因组序列Methanohalophilus mahii方案得到^T揭示了能量代谢的差异的成员之一Methanosarcinaceae栖息于淡水和盐水环境

文摘

Methanohalophilus mahii属的物种类型吗Methanohalophilus目前由三个不同的物种和有效发布的名字。民族主义者行动党(Mhp)。mahii代表中度嗜盐的产甲烷古菌和严格methylotrophic新陈代谢。应变SLP类型^T孤立于高盐沉积物来自南方的大盐湖,犹他州。在这里,我们描述这种生物的特点,结合完整的基因组序列和注释。2012424个基点的基因组是一个复制子63 2032个编码蛋白质和RNA基因的一部分细菌和古菌的基因组百科全书项目。比较重建能量代谢的嗜盐的物种民族主义者行动党(Mhp)。mahii与其他的代表Methanosarcinaceae揭示了一些有趣的差异淡水物种。

1。介绍

嗜盐的产甲烷菌对碳矿化在海洋和咸水环境中作出了重大贡献。首选基质的甲烷生成这些栖息地颈- 1甲基化合物,例如,提供的主要是不断退化osmolytes如甜菜碱或膜化合物如胆碱。颈- 1甲基化合物的偏好在氢产甲烷菌与硫酸盐还原菌在盐水环境中蓬勃发展反映了竞争能够更有效地利用氢产甲烷菌,但通常不能使用甲醇或主要基质(1]。应变方案得到^T(= DSM 5219^T=写明ATCC 35705^T)的模式菌株是中度嗜盐的产烷生物Methanohalophilus mahii(2]。方案得到^T(盐湖Paterek)是唯一的这个物种可以从文化集合和隔绝缺氧沉积物犹他州的大盐湖(美国)(3]。

虽然得到^T代表这个物种的唯一描述应变,培养独立研究表明,产甲烷菌密切相关民族主义者行动党(Mhp)。mahii在缺氧的盐水环境中是十分常见的。最近邻的16 s rRNA基因序列,Methanohalophilus portucalensis应变FDF-1,股99.8%序列的身份得到^T而所有其他物种的菌株类型Methanosarcinales与SLP分享不到94.7%^T(4]。许多克隆16 s rRNA超过99%的基因相同的方案得到的序列^T从咸水环境微生物垫太阳能盐场检索在格雷罗州黑人(墨西哥南下加利福尼亚州)[5)和埃拉特(以色列)6内陆河咸水湖泊在洛杉矶玛莎),西班牙(EF031086,未发表),深海缺氧盐湖二氧化铀,东部地中海(AM268272,未发表)和一个青海油田,中国(EF190085,未发表)。此外,克隆的甲基辅酶还原酶α亚基(McrA)基因从咸水环境微生物垫在格雷罗州黑人池塘(EU585971-EU585973,未发表)显示high-sequence相似(> 97%)McrA蛋白基因的氨基酸水平民族主义者行动党(Mhp)。mahii(Mmah_0612)。

民族主义者行动党(Mhp)。mahii应变方案得到^T是第一个基因组测序属的成员吗Methanohalophilus代表中度嗜盐的,methylotrophic产甲烷菌。比较与其他淡水和嗜盐的物种的基因组属于家庭Methanosarcinaceae提供了新颖的见解产甲烷菌的基因组适应他们的环境。

2。材料和方法

2.1。生长条件和DNA隔离

民族主义者行动党(Mhp)。mahii方案得到^TDSM 5219^T,479年DSMZ培养基生长的厌氧7]在37°C。DNA分离出1 - 1.5 g细胞粘贴使用MasterPure革兰氏阳性DNA净化设备(MGP04100中心)按照制造商的指示修改圣/ DLALM细胞溶菌作用吴et al . 2009中描述8]

2.2。基因组计划的历史

这种生物是选择排序的基础上的系统发育地位(9)的一部分细菌和古菌的基因组百科全书项目(8]。基因组计划是存入基因组在线数据库(10)标识符Gc01255和完整的基因组序列可以在CP001994基因库。排序、整理和注释是由美国能源部联合基因组研究所(变得)。总结项目信息如表1所示的在网上补充材料doi 10.1155 / 2010/690737

2.3。基因组测序和组装

的基因组民族主义者行动党(Mhp)。mahii方案得到^T使用6.8 kb桑格DNA库测序。所有的图书馆建设的方方面面和测序在变得更可以发现(http://www.jgi.doe.gov)。程序集是基于12365读草案。这个库提供覆盖基因组的6.8倍。phr / Phrap /缺点软件包(http://www.phrap.com)是用于序列组装和质量评估11- - - - - -13]。鸟枪测序后阶段读与平行phrap组装(高性能软件,LLC)。可能的错误装配与Dupfinisher[纠正14]。叠连群关闭差距通过编辑在缺点,定制底漆散步,或PCR扩增(罗氏应用科学,印第安纳波利斯)。共有222个引物走5 pcr反应和粉碎图书馆有必要关闭差距,解决重复区域,提高成品的质量序列。完整的基因组序列含有14767读取,实现平均8番序列覆盖率基础100000年出错率小于1。

2.4。基因组注释

基因被确定使用浪子[15]的橡树岭国家实验室基因组注释管道,紧随其后的是人工管理的使用变得更GenePRIMP管道(16]。预测信用违约互换翻译,用于搜索的国家生物技术信息中心(NCBI) nonredundant数据库,UniProt, TIGRFam,包含了,普里阿摩斯,KEGG,齿轮,InterPro数据库。额外的基因预测分析和人工微生物基因组功能注释内进行集成专家评估(IMG-ER)平台(17]。

2.5。系统发育分析

总基因组蛋白质序列来自13个成员类的“Methanomicrobia“(18和一群分类单元(Haloterrigena turkmenica(19),Halobacteriaceae)从IMG检索网站(http://img.jgi.doe.gov/cgi-bin/geba/main.cgi从NCBI)或(Methanocella paludicola高市早;NC_013665)。”Methanomicrobia”作为妹妹的出现Halobacteriaceae在最近的一次全面的16 s rRNA树(20.]。爆炸的“所有人针对所有蛋白质进行使用mpiBLAST版本1.5 (http://www.mpiblast.org/NCBI BLAST(的),一个并行实现21),而是使用软屏蔽复杂的过滤。确定直接同源,爆炸e-values转换使用我们自己重新实现OrthoMCL算法(2208 - 312)与制程版本(http://micans.org/mcl/)使用一个通货膨胀参数为2.0。OrthoMCL集群包含inparalogs减少通过选择最“中央”的几个序列相同的基因组,也就是说,最高的序列之和within-cluster爆炸的分数。减少OrthoMCL集群一致使用肌肉(3.7版本23]。流氓包版本的程序scan_orphanerrs 1.3.4 [24)是用于检测孤儿序列比对。孤儿序列(如果存在),删除后不对齐列和不同地区GBLOCKS version 0.91 b(惨遭淘汰。25)使用两个氨基酸和允许的最小块长度差距在所有序列。

过滤OrthoMCL集群联盟包括至少四个序列连接形成一个supermatrix进行系统发育分析。最大似然(ML)系统发育树推断的supermatrix Pthreads-parallelized RAxML包(267.2.5)版本,应用快速引导后续寻找最好的树(27),autoMRE bootstopping标准(28)和LG的氨基酸模式进化(29日)结合gamma-distributed替代率(30.)和实证氨基酸频率。树搜索下最大的吝啬(MP)标准进行PAUP *版本4 b10 [31日]使用100轮随机序列加法和后续为分支交换,保存不超过10每轮最佳树和潜在崩溃期间长度为零的分支树搜索。议员引导支持计算与PAUP * 1000(使用复制10轮启发式搜索/复制。

一组全面的16 s rRNA序列包括大多数种类的描述Methanosarcinales结合使用行动纲领》2.0版(32与GBLOCKS)和过滤。系统发育树下推断毫升如上所述,但使用GTR +γ替代模型。

3所示。结果与讨论

3.1。生物学与进化民族主义者行动党(Mhp)。mahii

3.1.1。表型特征

细胞的民族主义者行动党(Mhp)。mahii方案得到^T不规则的球菌有0.8到1.8的直径吗μ单独出现的m或小块(图1)。细胞染色革兰氏阴性,是不动的2]。增长的适宜盐度的中度嗜盐的应变是介于0.5和3.5之间M氯化钠。最高的增长率实现中含有氯化钠2.0米,但密度最高的文化被发现在盐度为1.2 M氯化钠(2]。除了钠,金属离子毫克^{2 +}K⁺、钙^{2 +},菲^{2 +}对于甲烷生成和增长至关重要。增长的pH值范围是6.5到8.2的最佳pH值7.5 (3]。

民族主义者行动党(Mhp)。mahii方案得到^T严格厌氧和成长heterotrophically使用甲醇或主要为甲烷生成的基板。没有增长发生lithotrophically与氢和二氧化碳或醋酸有机碳源,甲酸,蛋氨酸,胆碱、甜菜碱(2]。生物素刺激增长这一毒株在矿物中三甲胺作为底物(33]。

的极性脂质成分民族主义者行动党(Mhp)。mahii应变方案得到^T分析了四郎et al。34]。他们发现了脂质成分如下:β-hydroxyarchaeol核心脂质、糖脂糖和葡萄糖myo肌醇、乙醇胺及甘油作为phospholipid-polar头组。推导出结构的极性脂质二醚在协议与当前地方属的分类Methanohalophilus在家庭中Methanosarcinaceae(35]。进一步的数据属chemotaxonomical特征Methanohalophilus,包括细胞色素的测定或methanophenazine目前不可用。分类和通用的特点民族主义者行动党(Mhp)。mahii应变方案得到^T按照董事长建议(36表2)总结补充。

3.1.2。发展史和分类法

根据当前分类嗜盐的产甲烷菌主要是附属于几个属在家庭中Methanosarcinaceae。大多数代表进化枝的嗜盐古生菌有球菌样的形态和methylotrophic和中性或alkaliphilic。中度嗜盐的methylotrophic物种属于属Methanohalophilus和Methanosalsum,略嗜盐的产甲烷菌属Methanolobus和Methanococcoides属和极端嗜盐菌进行分类Methanohalobium。此外,略嗜盐的物种Methanolobus siciliae描述(37),但后来转移到属甲烷八叠球菌属(38]。目前属Methanohalophilus由三个物种有效发表的名字:民族主义者行动党(Mhp)。mahii(类型的物种),民族主义者行动党(Mhp)。halophilus和民族主义者行动党(Mhp)。portucalensis。第四个物种。”民族主义者行动党(Mhp)。euhalobius”,被Obraztsova et al。39)和Davidova et al。40),但物种绰号尚未验证。

16 s rRNA-based树图2显示了系统发育的位置民族主义者行动党(Mhp)。mahii应变方案得到^T成员之间的秩序Methanosarcinales。应变SLP的基因组^T包含三个不同的16 s rRNA基因拷贝了一个核苷酸以前公布的16 s rRNA基因序列生成相同的应变(M59133),其中包含23个模棱两可的基本要求。基因组数据之间的差异和herereported 16 s rRNA基因序列中最有可能是由于测序错误之前报道的序列。

为了获得更准确的进化观的嗜盐的成员Methanosarcinaceae基于全基因组测序数据的系统发育重建的代表阶级”Methanomicrobia”(18]。对齐和过滤OrthoMCL集群的数量(即包含至少四个条目。,genes from distinct genomes) was 2344 and their length ranging from 27 to 1732 amino acids (267.45 on average). The concatenated supermatrix thus comprised 626,903 columns, including 577,297 variable and 291,638 parsimony-informative characters. The ML phylogeny inferred from the concatenated gene alignments is shown in Figure3毫升和议员引导支持值。最后的日志可能获得最高−10355411 0,而最好的议员树有1907449分(不含不提供信息的网站)。毫升和议员拓扑都是相同的除了姐妹群关系Methanoculleus marisnigri和Methanosphaerula palustris首选的议员(数据没有显示)。支持最大(100%)下的所有分支毫升,但两个分支在议员和最大。分类很好恢复,树显示所有家庭和订单的单系统是包含在示例。然而,家庭内的分支指令Methanosarcinaceae16 s rRNA, whole-genome-based树之间的不同。有趣的是,嗜盐的物种Methanococcoides burtonii,Methanosalsum zhilinae和民族主义者行动党(Mhp)。mahii增长依赖于生理盐水(表3),形成一个单元在全基因组树分支,而在重建16 s rRNA树Methanosalsum zhilinae形成一个单独的行血统的极端嗜盐的物种Methanohalobium evestigatum。因此,树很可能基于公司数据比16 s rRNA树更准确,因此在更高的协议与表型。此外,whole-genome-based树表明,进化的产甲烷菌细胞色素的生产起源于共同祖先的Methanocellales和Methanosarcinales。最初,人们认为细胞色素的存在被限制为订单Methanosarcinales,但最近发现了基因编码细胞色素的产甲烷菌水稻根际土壤代表提出的新秩序Methanocellales(41]。

3.2。基因组结构和内容

基因由2012424个基点长染色体GC含量为42.6%(表1和图4)。2095个基因的预测,2032年是蛋白质编码基因,和63年rna;45伪基因也被确定。大多数的蛋白质编码基因(69.7%)被分配一个假定的函数,而其余的人注解为假想的蛋白质。基因的分布为齿轮的功能类别提出了表2。

3.3。比较基因组分析

三种不同类型的产甲烷菌,可以主要由管家基因的系统发育分析,区分一些表型性状提出了安德森et al。44]。类我产甲烷菌属于订单Methanobacteriales,Methanococcales和Methanopyrales类二世产甲烷菌由订单Methanomicrobiales和III类产甲烷菌Methanosarcinales。这个物种民族主义者行动党(Mhp)。mahii属于这个家庭Methanosarcinaceae因此第三类。

假设标志特征由所有第三类共享产甲烷菌包括甲基化合物的利用率作为甲烷生成唯一的基质,细胞色素的表达和基因编码的蛋白质:N, K,子单元减少辅酶F_420年(F_420年H₂)脱氢酶、bacterial-type磷酸甘油酸酯变位酶、细菌腺苷酸激酶,噬菌体休克蛋白,非组蛋白的染色体蛋白MC1的细长的变体condensin亚基ScpB [44]。可用的基因组数据集上的代表Methanosarcinales延长呈现的完整基因组民族主义者行动党(Mhp)。mahii方案得到^T,从而使进一步评估假设分布的签名在第三类产甲烷菌的蛋白质。

此外,产甲烷途径的适应环境盐浓度的增加Methanosarcinaceae可以通过比较基因组的重建saltwater-adapted物种民族主义者行动党(Mhp)。mahii,相比。burtonii(45),甲烷八叠球菌属acetivorans(46)的遗传库存淡水喜欢物种Msc。mazei(47),Msc。巴氏细菌(48]。

3.3.1。底物利用率和甲烷生成

应变方案得到^T据报道,专门种植的颈- 1化合物甲醇和甲胺而替代基质等甲烷生成氢,甲酸,乙酸不利用作为生长的基质2]。的甲烷生成途径的示意图民族主义者行动党(Mhp)。mahii如图5。的第一步methylotrophic甲烷生成的转移是一个甲基辅酶M (CoM)。然后,辅酶M绑定,都会降低甲基辅酶B(棒子)甲烷,从而形成的CoM-S-S-CoB heterodisulfide。甲基转移酶系统的产甲烷菌一般包括以下三个组件本地化在细胞质中:一个methyl-accepting corrinoid蛋白质(蛋白质C),底物特定甲基转移酶的催化甲基化corrinoid蛋白质(蛋白质B)和甲基转移酶催化甲基转移甲基化corrinoid蛋白辅酶M (MtbA)。甲基化corrinoid蛋白质需要减少的有限公司(II) corrinoid到公司(I)状态。corrinoid ATP-dependent还原活化的蛋白质催化iron-sulfur methylotrophic产甲烷菌的蛋白质罗摩(Mmah_1683) [49]。在甲烷八叠球菌属物种证明corrinoid蛋白和基质特定的甲基转移酶形成一个紧密的复杂,相应的在一个操纵子基因转录,而MtbA基因分别本地化别的地方在基因组和转录(50]。这似乎也如此的基因组民族主义者行动党(Mhp)。mahii应变方案得到^T确定下面的基质,甲基转移酶系统:甲醇(Mmah_0975 / Mmah_0976), monomethylamine (Mmah_1136 / Mmah_1137 Mmah_1154 / Mmah_1155)、二甲胺(Mmah_0498 / Mmah_0499和Mmah_1674 / Mmah_1675),和三甲胺(Mmah_1680/1682)。基因编码透性酶的吸收主要在靠近甲基转移酶系统也可以发现:Mmah_1133/1134 (monomethylamine运输车)、Mmah_0500(二甲胺运输车)和Mmah_1679(三甲胺转运体)。此外,六种不同的同功酶methylcobalamin:辅酶M甲基转移酶(MtbA)可以发现:Mmah_0008, Mmah_0279, Mmah_0518, Mmah_0901 Mmah_0970, Mmah_1478。在民族主义者行动党(Mhp)。mahii如同在其他几个研究甲烷八叠球菌属物种和相比。burtonii基因编码甲胺甲基转移酶含有一种琥珀密码子(UAG),通常会导致翻译停止,但在这种情况下可以被特定的抑制tRNA,修改后的氨基酸pyrrolysine [51]。结果表明,这种氨基酸中发挥着重要作用的催化甲基转移到同源corrinoid蛋白质。Pyrrolysine琥珀解码tRNA的结扎^所有供试由pyrrolysyl-tRNA合成酶所有(Mmah_0283)。

的减少CoM-bound甲基甲烷催化的酶methyl-coenzyme M还原酶(Mcr)只在产甲烷菌。它由三个子单元:McrA (Mmah_0612) McrB (Mmah_0616)和McrG (Mmah_0613)和包含镍porphinoid F_430年作为辅酶。减少所需的减少等价物的甲基甲烷生成在严格methylotrophic产甲烷菌的氧化甲基二氧化碳。化学计量的,一个甲基的氧化有限公司₂提供电子代三分子的甲烷。

的第一步氧化的分支methylotrophic甲烷生成的转移甲基从CoM tetrahydromethanopterin (H₄MPT),它是由膜结合酶催化的复杂tetrahydromethanopterin S-methyltransferase (MtrA-H)。这已被证明multisubunit酶夫妇放能转让methylgroup从tetrahydromethanopterin辅酶M两个钠离子的易位(52]。因此,在methylotrophic甲烷生成这个复杂的需要一个动力,使钠的吸能转移从CoM methylgroup H₄MPT。在民族主义者行动党(Mhp)。mahii所有子单元的这种酶编码在一个假定的操纵子(mmah_1776 - 1783),然而,另外一些基因被发现在几个网站的假字的基因组。

随后,酶methylene-H₄MPT还原酶(Mmah_1513)和methylene-H₄MPT脱氢酶(Mmah_0679)氧化甲基methenylgroup使用deazaflavin辅因子F_420年作为电子受体。这种酶methenyl-H₄MPT cyclohydrolase methenyl-H (Mmah_1138)然后催化水解₄MPT, formyl-H₄MPT。甲酰集团的进一步氧化需要转移到代数余子式methanofuran (MF) formyl-MF: H₄MPT formyltransferase (Mmah_2027)。

最后,大型酶复杂formyl-MF脱氢酶氧化甲酰集团有限公司₂使用铁氧还蛋白作为假定的电子受体。这是先前表明,两种不同类型的formyl-MF脱氢酶编码的基因组甲烷八叠球菌属物种,也观察到民族主义者行动党(Mhp)。mahii。公认的含钼酸酶基因被安排在一个单元(mmah_1266 - 1271)钨酸而可能含有酶的编码基因在不同的网站本地化或转录在不同的方向(Mmah_0590 mmah_0950 - 952、Mmah_0956 Mmah_1821)。但是,没有基因编码子单元包含formyl-MF的钨酸脱氢酶(fwdA)被发现,这可能表明这种酶功能民族主义者行动党(Mhp)。mahii。另外,失踪的亚基可以替换为相应的亚基的含钼酸酶(FmdA)。

基因编码酶替代基质利用甲烷生成,如甲酸脱氢酶(fdhAB),F_420年端依赖酒精脱氢酶(adf),或者节能(镍铁)氢化酶(决定自)的H₂没有检测到带注释的基因组序列,从而确认的严格methylotrophy这个物种。的活化甲烷生成的乙酸甲烷八叠球菌属物种使用醋酸激酶(消)和phosphotransacetylase (家长会)或一个ADP-forming acetyl-coenzyme合成酶(acdAB)。然而,这些基因被确定的民族主义者行动党(Mhp)。mahii基因组。

3.3.2。能量代谢

新陈代谢的生成有用的能量methylotrophic产甲烷菌严格取决于化学渗透假说的梯度的形成可以利用ATP通过膜局部ATP合酶复杂形式。建立一个ion-motive力通常需要膜结合蛋白复合物,将电子传递过程的自由能变化的易位质子或细胞外钠离子。产甲烷古菌的节能电子传递途径是终止的减少heterodisulfide CoM-S-S-CoB到相应的硫醇衍生物CoM-SH和CoB-SH41]。可能的电子给体电子传递链的成员Methanosarcinaceae依赖于衬底和氢分子,F_420年H₂或减少铁氧还蛋白(53]。详细描述潜在的电子转移路线和膜结合复合物参与民族主义者行动党(Mhp)。mahii,包括一个与该路径甲烷八叠球菌属物种,如下所示,如图6。

氢化酶和氢循环
最近,一位hydrogen-cycling机制提出了减少heterodisulfide还原酶的主要机制Msc。巴氏细菌(54),Msc。mazei(55]。在这些淡水物种减少的代数余子式铁氧还蛋白(Fd)_红色的)和F_420年(F_420年H₂)可能是氧化膜结合电解珩磨氢化酶和胞质Frh F_420年氢化酶,分别。生产H₂由膜结合进而氧化methanophenazine-reducing氢化酶(Vht / Vho)。最后,减少methanophenazine(英里₂)使用的膜结合heterodisulfide还原酶减少CoM-S-S-CoB hdr和伴随质子跨膜易位(59)(图6(一))。有趣的是,没有中标识功能氢化酶基因编码民族主义者行动党(Mhp)。mahii基因组。这将意味着H₂期间不能用于减少heterodisulfide methylotrophic增长。在表3结果表明,基因编码单元的镍铁氢化酶也缺席相比。burtonii,另一个属于嗜盐的物种Methanosarcinaceae。尽管几种类型的氢化酶编码halotolerant海洋物种Msc。acetivorans实验数据表明,没有明显的氢化酶活性存在,因此H₂可能不发挥作用的中间这个物种的产甲烷途径56]。因此,有可能发现氢化酶基因沉默或有一个未知函数(42]。从上述数据,这是显而易见的民族主义者行动党(Mhp)。mahii以及Msc。acetivorans和相比。burtonii必须进化出了不同的策略减少辅因子再生的,不依赖于H的一代吗₂中间。

F的再生_420年
在Msc。mazei和Msc。巴氏细菌,F的再生的替代路线_420年可能取决于F_420年H₂脱氢酶复杂(Fpo),表明这些物种中的一个分支电子传递链。Fpo是multimeric与质子膜结合复杂易位与规范化NADH脱氢酶活动,有一些相似之处我(诺)的需氧细菌60]。在民族主义者行动党(Mhp)。mahii和其他产甲烷菌,这种酶复杂编码在一个大的操纵子(mmah_1589 - 1601)与守恒的基因排列fpoABCDHIJJKLMNO。亚基的基因FpoF (Mmah_1512)包含催化活性部位为F_420年H₂氧化是编码的其他地方。有趣的是,在的情况下民族主义者行动党(Mhp)。mahii,毗邻methylene-H的基因₄MPT还原酶(Mmah_1513),代表的两种酶的氧化分支methylotrophic甲烷生成减少F_420年。如细菌NADH脱氢酶Fpo F_420年H₂脱氢酶的产甲烷菌减少亲脂性的氧化还原局部细胞质膜的载体。Methanophenazine迄今研究的物种被发现在所有Methanosarcinaceae(41)作为一个功能模拟的呼吸lipoquinones减少细菌NADH脱氢酶。因此,在民族主义者行动党(Mhp)。mahii,Fpo脱氢酶可能是负责的再生氧化F_420年代数余子式使用methanophenazine作为电子受体。民族主义者行动党(Mhp)。mahii编码的膜结合heterodisulfide还原酶hdr (Mmah_0632/0633)催化的还原heterodisulfide CoM-S-S-CoB英里每小时₂作为还原剂。

再生氧化的铁氧还蛋白
几个氧化铁氧还蛋白的再生机制没有氢最近提出的生成。一个可能的途径包括膜结合蛋白复合物,被证明是高度表达Msc。acetivorans和类似于Rnf复杂的细菌(42]。假设Rhodobacter capsulatus,这个复杂的采用化学渗透假说的梯度,使铁氧还蛋白的吸能减少NADH (61年]。在Msc。acetivorans电子转移可能发生在相反方向,放出能的铁氧还蛋白氧化与methanophenazine电子受体和伴随的质子或钠离子易位(57]。值得注意的是,淡水物种甲烷八叠球菌属编码一个电解珩磨氢化酶催化铁氧还蛋白氧化不包含基因Rnf复杂而在的基因组民族主义者行动党(Mhp)。mahii(mmah_1689 - 1696)相比。burtonii一个假定的Rnf操纵子检测(表3),这表明这样的铁氧还蛋白再生是首选选项的嗜盐的和saltwater-inhabiting物种Methanosarcinaceae(图6 (b))。
铁氧还蛋白氧化的另一个途径是由Buan和麦特卡尔夫(假设58]。根据他们的研究结果与基因缺失突变体的获得Msc。acetivorans,他们假定一个细胞质HdrABC复杂的使用减少了铁氧还蛋白的直接还原CoM-S-S-CoB heterodisulfide。可能利用这个反应将methanophenazine不会被要求作为一个中间从而使加快铁氧还蛋白再生的流动率。此外,可能阻碍增长overreduction methanophenazine池的Rnf避免复杂。支持这种假设发现细胞质heterodisulfide还原酶条件下允许快速增长尤为重要Msc。acetivorans的再生与减少methanophenazine CoM-SH可能代表病原反应步骤(58]。在民族主义者行动党(Mhp)。mahii两组基因编码胞质heterodisulfide还原酶被发现。一组被组织在一个假定的转录单元(mmah_0415 - 0417)而另一组编码HdrA (Mmah_0955)和HdrBC (Mmah_1786/1787)分开。

ATP合酶复杂和离子动力
一个共同的遗传特质的嗜盐的代表Methanosarcinaceae似乎存在基因编码multisubunit钠/质子转运体(表3)。这种类型的逆向转运是由6到7个不同的基因编码和第一次描述细菌multiple-resistance / pH调节(Mrp)复合物[62年]。在民族主义者行动党(Mhp)。mahii,Mrp复杂编码在一个假定的操纵子(mmah_0736 - 0742)。这些膜相关复合物功能提出了proton-driven射流泵的钠离子来实现细胞内稳态的pH值和钠(62年]。通常情况下,基因编码Mrp复合物排列磁带和经常发现结合独特的电子传递链的酶,如甲酸脱氢酶或能量转换氢化酶应该把质子或钠离子(63年]。可能是受限制的原因分布的Mrp复杂的嗜盐的种类Methanosarcinaceae吗?一个想法是,Mrp复杂在能量代谢中发挥作用,当化学渗透假说的梯度的Na⁺而不是用于质子ATP合成。没有直接证据,这样的假设,但它是由基因表达分析显示,利用醋酸Msc。acetivorans刺激生产ATP合酶复杂和Mrp的逆向转运(42,57),这可能表明,Mrp复杂对ATP合酶的正常运行至关重要。紧密耦合的电子传递与ATP合成乙酸产甲烷菌的生长期间是最重要的,因为这个衬底的能源产量非常小(焦每摩尔CH₄),接近极限允许细胞生长55]。一个可能的解释为缺乏淡水物种的Mrp复杂甲烷八叠球菌属是他们的ATP合成酶把质子而不是Na⁺,因此不依赖体内平衡钠相比,海洋甲烷八叠球菌属物种暴露在不同盐度和pH值。
与几个甲烷八叠球菌属包含两种不同类型的ATP合成酶的物种,民族主义者行动党(Mhp)。mahii只包含一个ATP合酶的热点₁一个₀类型编码在一个假定的操纵子(mmah_1442 - 1450)。生物信息学分析ion-translocating含蛋白脂质c-subunit ATP合成酶会表明Na⁺使用易位甲烷八叠球菌属物种的合成ATP (42]。然而,实验室实验的比萨et al。64年)表明,ATP合酶的淡水物种Msc。mazei取决于质子移位,因此耦合离子的生物信息学预测不可靠或ATP合成酶甲烷八叠球菌属物种可以依靠,质子和钠离子,这取决于生长条件。

3.3.3。生物合成的代谢

碳同化
民族主义者行动党(Mhp)。mahii能够在最小的媒体以甲醇为唯一碳源生长,这表明所有生物合成的前体可以从颈- 1合成的化合物。碳同化的第一步是由胞质乙酰辅酶a合成酶催化脱氢酶/公司复杂的(mmah_1166 - 1172),合成乙酰辅酶a的有限公司₂、检验和methyl-H₄MPT的反应取决于降低铁氧还蛋白。另外,外部乙酸可以运输到细胞,然后通过一个激活腺苷5′一磷酸(AMP)和焦磷酸形成乙酰辅酶a合成酶(Mmah_1375)。膜结合的基因proton-translocating焦磷酸酶(Mmah_1380)位于接近5月基因组和焦磷酸的化学能源债券转换成可用于ATP合成化学渗透假说的梯度,从而恢复的一些能源投资醋酸的激活。碳同化进一步收益还原的乙酰辅酶a羧化作用是由丙酮酸催化丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(Mmah_0351/0354)。所需的铁氧还蛋白减少碳同化formyl-MF脱氢酶提供的可能是复杂的。

中心碳代谢
从丙酮酸,进一步产生的碳骨架生物合成可以是柠檬酸循环或糖质新生。在民族主义者行动党(Mhp)。Mahii,酶磷酸烯醇丙酮酸合成酶(Mmah_0997)和丙酮酸磷酸dikinase (Mmah_0650)丙酮酸转化为磷酸烯醇丙酮酸(PEP),可以进入gluconeogenic Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)由烯醇酶通路(Mmah_1993)和磷酸甘油酸酯变位酶,存在于一个热点(Mmah_0223)和细菌(Mmah_1844)版本,在所有研究的成员Methanosarcinales(44]。在民族主义者行动党(Mhp)。mahii,所有必要的基因存在操作EMP途径也在糖酵解的方向,这可能表明,糖原或淀粉用作储备在饥饿条件下材料在这个物种和退化。另一方面,丙酮酸可以定向到柠檬酸循环的酶丙酮酸羧化酶(Mmah_0621/0622)生成草酰乙酸。的重要前体代谢物琥珀酰辅酶可能从草酰乙酸通过还原合成柠檬酸循环的分支。带注释的基因代表酶还原叉的柠檬酸循环包括苹果酸脱氢酶(Mmah_1107)、延胡索酸酶(Mmah_0724和Mmah_1279/1280)和延胡索酸盐还原酶(Mmah_0725/0726和Mmah_1949/1950)。虽然规范琥珀酰辅酶合成酶基因不确定,有可能是这样的一种酶的编码基因Mmah_1653(潜在的atp酶)和Mmh_1654(酰coa合成酶),导致的一套完整的酶部分还原柠檬酸循环。在民族主义者行动党(Mhp)。mahii,如的其他成员Methanosarcinaceae研究到目前为止,2-oxoglutarate从草酰乙酸通过氧化合成的柠檬酸循环使用酶柠檬酸合成酶(Mmah_0479),顺乌头酸酶(Mmah_0478)和异柠檬酸脱氢酶(Mmah_0582)。它必须被视为的柠檬酸合成酶基因民族主义者行动党(Mhp)。mahii包含一个琥珀177处终止密码子编码的核苷酸序列,所以它目前指定为假基因。另一方面,2-oxoglutarate是不可或缺的前体的合成谷氨酸和其他必需氨基酸,导致假设UAG终止密码子可以编码中的氨基酸pyrrolysine在上面讨论的甲胺甲基转移酶。

代数余子式生物合成
合成的生化途径的酶学methanogenesis-specific代数余子式最近才开始公布。然而,详细研究合成methanofuran和辅酶F_430年是失踪65年]。
辅酶M生物合成进行了研究Methanocaldococcus jannaschii,,并描述了一个完整的途径包括相关基因(66年]。的四个酶催化CoM合成Methanocaldococcus jannaschii只有sulfopyruvate脱羧酶基因(comDE;Mmah_1754/1755)是确定的民族主义者行动党(Mhp)。mahii基因组,这可能表明存在多个通路在产甲烷菌sulfopyruvate生产。相反,可以发现一些基因可能编码酶参与2-oxoacid伸长7-mercaptoheptanoyl链的合成辅酶所需步骤B,也就是说,aksA(Mmah_1938),aksD(Mmah_0418),aksE(Mmah_0127),aksF(Mmah_0129)。同样的,一套完整的基因(cofC,cofD,钴铁,cofH)参与合成辅酶F_420年被确认的民族主义者行动党(Mhp)。mahii基因组。
的所有成员Methanosarcinaceae分析目前包含methanophenazine和细胞色素作为电子传递链的一部分,所以基因编码酶的合成也应该出现在民族主义者行动党(Mhp)。mahii。直到最近,小川et al。67年)确定一种酶Msc。mazei这是专门参与methanophenazine的合成。Methanophenazine包含C-25 polyprenyl侧链为亲脂性的膜锚和ether-linked redox-active吩嗪一半。人们认为methanophenazine生物合成途径的一个具体步骤是生产C-25 prenyl集团[(所有-)二磷酸geranylfarnesyl]随后结合2-hydroxyphenazine或其前体。在Msc。mazei的合成所有- - - - - -geranylfarnesyl二磷酸催化由(所有)prenyl二磷酸合酶的基因编码MM_0789而同源酶生产C-20(所有-)geranylgeranyl二磷酸可能是由MM_1767编码(67年]。C-20 polyprenyl碳氢化合物通常用于产甲烷古菌合成的膜脂质,表明这种酶的分布并不局限于methanogens-producing methanophenazine。实际上,发现高度相似的序列(值)的基因MM_0789被发现的基因组民族主义者行动党(Mhp)。mahii(Mmah_1452)和其他的成员Methanosarcinales而一个同样限制MM_1767分布没有明显的基因。有趣的是,在的基因组民族主义者行动党(Mhp)。mahii,集群血红素生物合成所需的基因(mmah_1457 - 1461)和ATP合酶操纵子是位于靠近初步(所有)geranylfarnesyl二磷酸合酶基因(Mmah_1452),这可能表明协调监管的基因参与电子传递磷酸化。

3.3.4。防止渗透和氧化应激

Halotolerance
嗜盐的或halotolerant微生物适应低水活动或不同盐浓度通过积累兼容条件下溶质平衡细胞膨的渗透压力。osmolytes的构成民族主义者行动党(Mhp)。mahii目前未知但调查系统相关的物种民族主义者行动党(Mhp)。portucalensis。在这个物种的主要渗透溶质是甜菜碱,乙酰-β赖氨酸,β谷氨酰胺和α-glucosylglycerate [68年]。精力充沛的原因有机兼容的溶质的吸收是首选新创共同渗透溶解物的合成,因此转运蛋白应该是编码的民族主义者行动党(Mhp)。mahii基因组。事实上,基因的ABC-type运输车甜菜碱(mmah_0337 - 0340)被发现。此外,基因替代BetT-type胆碱转运蛋白(Mmah_0372和Mmah_1398)可能参与了甜菜碱的吸收或其前体。
在甲烷八叠球菌属物种瞬态渗透压力补偿通常是通过细胞内钾(K⁺)浓度(69年]。因此,在民族主义者行动党(Mhp)。mahii一个K⁺吸收系统编码的基因trkA(Mmah_1614),trkI(Mmah_0056)和trkH(Mmah_2022)识别和可能发挥作用在salinity-dependent增加细胞质的K⁺浓度。hypoosmolarity条件下射流的K⁺和钠⁺钾离子能催化KefC-type /质子转运体(Mmah_1757 / Mmah_2010)和一个NhaP-type钠/质子转运体(Mmah_1674),分别。此外,它认为mechanosensitive离子通道(mscS1-3:Mmah_0364、Mmah_0563 Mmah_0666)封闭非特异性膜张力发挥作用的溶剂在反应流出低渗的压力(70年]。
细胞增加的直接适应外部盐浓度的快速吸收溶质通常是由细胞合成有机osmolytes补充。在民族主义者行动党(Mhp)。mahii,的合成乙酰-β赖氨酸是催化lysine-2 3-aminomutase (ablAMmah_1439)和β赖氨酸乙酰转移酶(ablBMmah_1438)而甜菜碱合成甘氨酸的产甲烷菌依赖于基因肌氨酸N-methyltransferase (Mmah_0524)和肌氨酸dimethylglycine N-methyltransferase (Mmah_0525) [71年]。

氧气宽容
Cultivation-independent研究表明,产甲烷菌的应变类型密切相关民族主义者行动党(Mhp)。mahii丰富的上层光合成有效氧的微生物垫的太阳能盐田(5]。很可能这些微生物垫经常暴露在紫外线和氧气,导致生成的活性氧(ROS)被剧毒专性厌氧细胞。因此,这个物种的成员必须获得高度发达的机制来应对氧化应激。一个带注释的基因序列的分析民族主义者行动党(Mhp)。mahii表明氧化应激在这个物种保护系统由多个行防御酶的特征直接与氧反应及其衍生物或参与修复受损细胞的化合物。一系列的酶是推定地参与主要氧解毒:氧气分子进入细胞减少预测F_420年H₂氧化酶(fprA,Mmah_1537)。高活性超氧化物自由基()由自动氧化生成硫醇或黄素可以由两个不同的解毒desulfoferrodoxin-type过氧化物还原酶(Mmah_0553和Mmah_1131),减少过氧化氢过氧化物(H₂O₂)。反过来,H₂O₂减少水的几种类型的氧化物酶,包括rubrerythrin或红素氧还蛋白过氧化物酶(rbrferritin-like Dps Mmah_0444),蛋白(dpsMmah_0552),和一个bacterial-type双官能团的过氧化氢酶、过氧化物酶(katGMmah_1997)。
另一方面,一个有效的损伤修复机制安装后能够与细胞的化合物被活性氧氧化。民族主义者行动党(Mhp)。mahii编码三种不同同功酶的3-Cys硫氧还蛋白氧化酵素或抗氧化蛋白(Mmah_0555、Mmah_1055 Mmah_1299)可能函数作为烷基氢过氧化物还原酶和修复氧化细胞质膜的脂质。除了膜脂质蛋氨酸残留的细胞质蛋白质代表ROS的另一个主要目标。生成蛋氨酸亚砜可导致蛋白质结构的改变和其他有害的影响,所以有必要减少亚砜一半。在民族主义者行动党(Mhp)。mahii,这两种不同epimeric形式的蛋氨酸亚砜减少酶methionine-R-sulfoxide还原酶(msrBMmah_0636)和methionine-S-sulfoxide还原酶(同行Mmah_0990)。
电子传递链desulfoferrodoxins, rubrerythrin,可能是由抗氧化蛋白NADPH:硫氧还蛋白还原酶(Mmah_1201)或铁氧还蛋白:硫氧还蛋白还原酶(Mmah_0953)。

3.4。结论

安德森等人提出了产甲烷菌的分类在三个不同的类基于保守基因的系统发育分析和特征蛋白质的分布44]。基于这些标准,民族主义者行动党(Mhp)。mahii附属于第三类产甲烷菌除了没有噬菌体休克蛋白的基因检测,迄今为止已发现的所有成员吗Methanosarcinales。

本研究的一个有趣的结果民族主义者行动党(Mhp)。mahii和其他的嗜盐的物种Methanosarcinaceae使用不同的节能电子线路在methylotrophic甲烷生成比淡水物种。Msc。mazei和Msc。巴氏细菌依靠一个氢循环与分子H₂中间而物种适应盐渍环境喜欢代数余子式减少细胞内转移的能力上也有所降低。显然,能量代谢的类型Methanosarcinaceae不与继承halotolerance或系统的位置,但似乎适应的结果被占领的栖息地,这也解释了为什么Msc。acetivorans省略了一个H-cycle,但不是halotolerant淡水物种Msc。mazei和Msc。巴氏细菌。人们很容易推测安装H-cycle的优点是实现更快的增长速度。氧化还原反应迅速扩散的H₂分子可以进行非常快,因为他们不依赖于膜结合氧化还原运营商,与大酶复合体,这可能会减缓电子转移。这将提供一个可能的解释为产甲烷菌的观察没有methanophenazines可以翻倍低一个小时而产甲烷菌与膜结合一家传递链通常十个小时翻倍(41]。另一方面,利用H₂作为氧化还原载体可能导致细胞的还原能力的损失,如果自由扩散H₂由竞争微生物回收。放弃甲烷生成的氢分子作为中间基质嗜盐的代表Methanosarcinaceae因此可以解释为与硫酸盐还原微生物竞争,通常只有高度丰富的硫酸盐盐渍环境和消耗氢更有效地比产甲烷菌(53,72年]。观察到的栖息地盐度对产甲烷菌的能量代谢的影响似乎限制的成员Methanosarcinaceae。这可能是基于大约10倍降低氢的亲和力cytochrome-containing类I和II级的产甲烷菌与产甲烷菌相比,由hydrogenotrophic能够茁壮成长在盐水环境中甲烷生成(41]。

总之,获得基因组显示大量的数据允许的结论民族主义者行动党(Mhp)。mahii微生物垫的盐水和高盐环境是基于一个成功的竞争与其他厌氧生物,也许通过省略氢分子作为氧化还原载体,通过收购一个氧化应激的保护系统,完全比得上microaerotolerant体系硫酸盐还原菌(73年]。

确认

作者想感激地承认麻仁施罗德为越来越多的帮助民族主义者行动党(Mhp)。mahii细胞和Susanne施耐德进行DNA提取和质量控制(包括DSMZ)。这项工作进行的赞助下美国能源部科学办公室、生物和环境研究项目,以及加州大学劳伦斯伯克利国家实验室号合同下。号合同下DE-AC02-05CH11231,劳伦斯利弗莫尔国家实验室。号合同下DE-AC52-07NA27344和洛斯阿拉莫斯国家实验室。DE-AC02-06NA25396, UT-Battelle号合同下和橡树岭国家实验室。DE-AC05-00OR22725。德国研究基金会(DFG)支持下DSMZ本月599/1-2。

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