不同的表面的残留物Methanothermobacter thermautotrophicusMCM解旋酶与单-和双链DNA

文摘

minichromosome维护(MCM)复杂的函数被认为复制的解旋酶古生菌,分离的两条链染色体DNA复制过程中。催化活性驻留在MCM的c端区域蛋白质,而氨基部分在DNA结合蛋白质multimerization扮演着重要的角色。对齐的MCM同系物从几个热点显示数量守恒的氨基酸。这里的几个守恒的残留位于表面的解旋酶突变和他们的角色在MCM函数确定。发现某些突变导致的亲和力增加ssDNA而dsDNA的亲和力却降低了。其他突变体表现出相反的效果。因此,数据表明,这些守恒的表面残留可能参与MCM-DNA交互。

1。介绍

minichromosome维护(MCM)解旋酶被认为函数作为复制的解旋酶在真核生物和古菌。大多数热点包含单个MCM同系物生化属性类似于真核酶。古细菌和eukaryal MCM解旋酶表现出ATP-dependent 3′5′解旋酶的活动,可以绑定和把单链(ss)和双链DNA (ds)、解除DNA rna杂交而把DNA链,并且可以取代蛋白质的DNA(了1- - - - - -3])。古细菌MCM蛋白可分为三个部分;氨基地区,AAA +催化核心,c端区域,可能会形成一个helix-turn-helix (HTH)域4- - - - - -7]。的氨基端部分的三维结构Methanothermobacter thermautotrophicus和硫化叶菌solfataricusMCM蛋白质显示三个域架构(4,5]。生化研究表明,域参与调节解旋酶的活动,参与DNA结合域B, C和领域参与六聚体形成、DNA结合和氨基之间的通信部分和催化域(了:(1,3])。尽管MCM的氨基端部分不如AAA +守恒的地区,一个对齐的氨基端地区热点显示几个高度保守的残留物的存在,尤其是在域C(图1(一))。这些残留的几个曾被报道在氨基之间的交流起着关键作用DNA结合和c端催化活性8,9]。在这项研究中,几个域C的守恒的残留物m . thermautotrophicusMCM蛋白质单独(除了一个双突变体)突变和对MCM的影响功能检查。除了一个氨基酸分析的研究位于解旋酶的表面(图1 (b)),因此他们可能发挥功能而不是结构作用。氨基酸分析在这项研究中,突出显示在图1(一),是Gln176 Pro210 Gly211 Asp212, Val214, Gly218。这里显示的是,虽然V214或G218 Ala替换不显著改变了MCM的生化特性,P210 g或G211 Ala突变促进增强约束力dsDNA ssDNA和减少绑定。Q176阿拉巴马州或D212 Asn显示更好的绑定dsDNA相比ssDNA绑定。这些残留在MCM的可能角色功能进行了讨论。

2。材料和方法

2.1。材料

ATP和(γ- - - - - -³²P] ATP来自通用电气医疗集团,寡核苷酸合成由NIST / DNA合成UMD格式工具。

2.2。MCM突变蛋白质的表达和纯化

所有m . thermautotrophicusMCM突变蛋白在这项研究中的应用是长篇的衍生品酶和生成使用pcr定点诱变如前所述[10]。所有结构包含一个c端₆标签和被克隆到心好XhoI pET-21a向量(Novagen)的网站。使用的寡核苷酸突变补充表1所示。野生型和突变体蛋白的过表达大肠杆菌DE3密码子+细胞(Stratagene) 37°C和纯化Ni-column如前所述[11]。

2.3。凝胶过滤

野生型和突变体一百微克MCM蛋白质被分馏superose-6凝胶过滤柱(HR10/30,通用电气医疗集团)预平衡缓冲区包含20毫米Tris-HCl (pH值7.5),150毫米生理盐水、10%甘油。列运行22°C 0.2毫升/分钟的流量。蛋白质的存在是由紫外吸光度在280海里。

2.4。atp酶测定

反应混合物(15中atp酶活性测定μl)包含25毫米Hepes-NaOH (pH值7.5),MgCl 1毫米二硫苏糖醇、5毫米₂,100年μg / ml牛血清白蛋白(BSA)和1500 pmol [γ- - - - - -³²P] ATP (3000 Ci /更易;通用电气医疗集团)和10个或30纳米MCM蛋白质的存在与否(单体)50 ng ssDNA (5′-GCAGATAACAGTTGTCCTGGAGAACGACCTGGTTGACACCCTCACACCC-3′)。孵化后60°C 60分钟,样本放在冰,然后一个整除(1μl)被发现在聚乙烯亚胺纤维薄层板,和ATP和色谱分离的1 M甲酸和0.5 M氯化锂。ATP水解的程度被phosphorimager量化分析。atp酶化验都是重复三次,和他们的平均值与标准差图所示。

2.5。硝基筛选DNA结合分析

单链和dsDNA基质筛选结合化验是由标记寡核苷酸使用(γ- - - - - -³²P] ATP和T4多核苷酸激酶。非公司(γ- - - - - -³²P]从DNA衬底中删除了ATP提取从聚丙烯酰胺凝胶(如前所述)12]。ssDNA绑定一个49-mer寡核苷酸序列5′-GCAGATAACAGTTGTCCTGGAGAACGACCTGGTTGACACCCTCACACCC-3′是使用。dsDNA同样的寡核苷酸杂交其互补序列。

滤波器结合分析进行了反应混合物(20μl)包含25毫米Hepes-NaOH (pH值7.5),MgCl 2毫米德勤,10毫米₂,100年μ50 g / ml BSA, fmol³²P-labeled ss或dsDNA基质和10 30或90纳米MCM蛋白质(单体)。孵化后60°C 10分钟混合物过滤是一个alkaline-washed硝基过滤器(微孔,0.45公顷μ米)(13),随后洗20毫米Tris-HCl (pH值7.5)。的放射性物质吸附过滤被液体闪烁计数测量。所有的DNA结合实验重复三次,和他们的平均值与标准差图所示。

2.6。DNA解旋酶测定

基质的解旋酶化验是如前所述[14使用下面的寡核苷酸。分叉的衬底两寡核苷酸5′-GGGACGCGTCGGCCTGGCACGTCGGCCGCTGCGGCCAGGCACCCGATGGCGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTT-3′, 5′-TTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGCCGACGTGCCAGGCCGACGCGTCCC-3′和底物只有一个3′过剩地区(平面衬底)使用的寡核苷酸5′-CCGACGTGCCAGGCCGACGCGTCCC-3′, 5′-GGGACGCGTCGGCCTGGCACGTCGGCCGCTGCGGCCAGGCACCCGATGGC-3′。

在反应混合物测量DNA解旋酶活性测定(15μl)包含20毫米Tris-HCl (pH值8.5),MgCl 2毫米德勤,10毫米_2,100年μ10 g / ml BSA, 3.33毫米ATP, fmol(0.66海里)³²P-labeled衬底和10、30或90纳米MCM蛋白质(单体)平面衬底或3,9日或27 nM MCM分叉的基质蛋白(单体)。孵化后60°C 1小时反应是停止通过添加5μl加载缓冲区包含1% SDS, 100毫米EDTA, 0.1%二甲苯苯胺,0.1%溴酚蓝,50%甘油和寒冷的冰。整除(10μl)被加载到本地8%聚丙烯酰胺凝胶在0.5 x此种和电泳40分钟在180 V。凝胶被phosphorimaging可视化和量化。解旋酶实验重复三次,和他们的平均值与标准差图所示。

2.7。差示扫描量热法(DSC)测量

利用DSC确定野生型和突变体蛋白的变性温度作为酶的热稳定性的指标。纯化蛋白质是透析在室温下对缓冲区包含20毫米磷酸钾(pH值7.5),100毫米甘油氯化钠和10%。蛋白质浓度测定使用280 nm的吸光度和消光系数的计算_280年28730厘米的⁻¹·米⁻¹。透析袋外的解决方案是保留和实验提供了参考依据。

进行了DSC测量使用VP-DSC微热量计从Microcal Inc .(北安普敦,MA)。解决方案的数量和参考船0.511毫升,扫描速度慢(15 K人力资源⁻¹)或中等速度(60 K的人力资源⁻¹),温度从25 - 85°C。自扫描的蛋白质样品是不可逆转的,第二个扫描每个样本作为基线。减法后蛋白质的基线扫描,产生的原始数据微分权力作为时间的函数除以扫描速率转换成一个热容作为温度的函数。利用考试项目(15两个州),,过渡模型安装在热容作为温度的函数扫描来确定范霍夫焓()扫描从转变峰的形状;转变温度()和量热转变焓()从转变峰下的面积计算(mJ)除以摩尔的蛋白质在样品室(浓度的蛋白质×0.511毫升)。DSC扫描样本重复两次。

3所示。结果

3.1。突变的守恒的MCM残留不影响整体结构的蛋白质

为了获得有用的信息从一个突变体酶有必要表明,突变没有影响整体结构的分子。所有残留研究除了G218位于表面的氨基端MCM蛋白质(图的一部分1 (b)),因此预计不会大幅改变分子的整体结构。如图2这的确是如此。所有突变体蛋白质的大小类似于野生型酶(图2(一个))虽然有些突变蛋白洗提建议他们早些时候可能更倾向于形成细丝。之前表明细丝与dodecameric和hexameric形式平衡浓度的方式(16]。这种突变可能会改变不同形式之间的平衡。根据CD分析,所有突变蛋白质保留类似整体二级结构表明突变引入不可能影响整体结构的蛋白质(图2 (b))。此外,DSC分析表明,所有突变蛋白质也有类似的热稳定性随着野生型酶虽然热容变化(表1)。目前还不清楚什么导致了大偏差和热容变化的差异。然而,总的来说,这些结果表明,突变不会大幅改变蛋白质的结构。

3.2。MCM突变蛋白保留解旋酶的活动

建立后,突变体蛋白保留他们的整体结构,每个突变对MCM解旋酶活动的效果确定。如图3(一个),大多数突变蛋白质显示野生型分叉的DNA衬底enzyme-like活动。例外是D212N突变体酶,减少活动随着酶浓度的增加。之前它已经表明,MCM蛋白质更活跃在分叉的衬底基质相比,只包含一个3′过剩ssDNA地区(平面衬底)(例如,见:[11])。这种差异在活动之前用于分析轻微突变对MCM解旋酶活动的影响(例如,8])。因此,解旋酶化验也表现了平坦的衬底。如图3 (b)、P210G G211A, PG210,211GA突变酶减少了解旋酶的活动,特别是在低酶浓度。D212N突变蛋白也展览减少解旋酶活性在平坦的衬底但没有解旋酶的抑制活性高蛋白质浓度(图3 (b))。

3.3。MCM的突变影响DNA结合蛋白质

图中给出的数据3显示,一些突变体酶解旋酶活性降低。这可能是由于DNA结合减少或降低ATP水解既需要DNA解除。为了验证这一点,DNA结合和atp酶与野生型和突变体酶进行了分析。所有突变蛋白质显示低绑定dsDNA相比野生型蛋白(图4(一))。特别是G218A显示~ 25%,Q176A, P210G, G211A显示~相比减少50%双绑定的野生型酶。当突变蛋白的结合能力ssDNA发现P210G, G211A或PG210,211GA突变酶显示绑定比野生型蛋白而D212N和Q176A展览减少绑定ssDNA(图的能力4 (b))。然而,无论他们的DNA结合蛋白质能力拥有解旋酶活性(图3),尤其是Q176A突变酶的解旋酶活性与野生型所用MCM叉形和平坦的衬底(图3),但展品减少DNA(数据结合的能力4(一)和4 (b))。它曾表明,ATP提高ssDNA绑定m . thermautotrophicus罗马数字(17,18)的影响,因此ATP ssDNA绑定的突变酶进行评估(图4 (c))。在ATP的存在表现出相似的DNA结合蛋白质的活动。突变蛋白的能力来绑定ssDNA ATP的存在可以解释为什么一些突变蛋白质野生型解旋酶活性而没有可衡量的ssDNA绑定可以发现在缺乏ATP。

3.4。多样化的MCM突变对atp酶活性的影响

MCM蛋白质,包括m . thermautotrophicusMCM,利用ATP水解可能促使DNA。的腺苷三磷酸酶活性m . thermautotrophicusMCM刺激在DNA的存在19- - - - - -21]。上面描述的解旋酶和DNA结合实验表明,atp酶活性可能受损的突变体。如图5、P210G G211A, PG210,211GA突变蛋白表现出更大的(> 10倍)基底atp酶活性(在没有DNA)比野生型酶。由DNA无法评估这些蛋白质刺激最大atp酶活性水平存在没有DNA。然而,有趣的是,这三个突变体蛋白(P210G、G211A PG210,211GA)也表现出更好的ssDNA绑定与野生型酶(图4 (b))。

3.5。cdc 6蛋白抑制MCM的解旋酶活性突变酶

残留在蛋白质相互作用研究也可以发挥作用。古细菌cdc 6蛋白被证明与罗马数字和抑制解旋酶活性(11,22,23]。的m . thermautotrophicus基因组包含两个cdc 6同系物,Cdc6-1 Cdc6-2和蛋白质都显示出抑制MCM解旋酶活性(11]。表面残基突变可能在当前的研究中与cdc 6蛋白质交互。应对这种可能性的影响cdc 6突变蛋白是蛋白质解旋酶活动的评估。补充图1所示的cdc 6蛋白抑制解旋酶活性的突变蛋白相似程度上表明突变残留不需要与cdc 6蛋白的交互。

4所示。讨论

几个守恒的残留的作用m . thermautotrophicusMCM使用突变酶蛋白质检测。DNA突变P210G, G211A PG210,211GA展览高架绑定(图4(图)和腺苷三磷酸酶活动5)。P210和G211位于域表面C,他们面临着AAA +催化领域接近螺旋2 (3,7]。删除螺旋2的一部分,被称为螺旋2插入(H2i),导致没有解旋酶活性和酶的亲和力增加DNA (24]。可能的突变P210 G211影响螺旋2的局部结构和/或H2i。这些地方的改变可能是轻度,解旋酶活动可以检测到所有三个突变体酶(P210G、G211A和PG210,211GA)。

虽然P210G、G211A PG210,211GA突变酶显示增加ssDNA绑定他们表现出减少绑定dsDNA(图4)。Q176A D212N突变体蛋白,另一方面,表现出相反的效果,显示绑定到dsDNA比ssDNA(图4)。MCM蛋白结合时,它可能采用一种特定的构象ssDNA和另一个结合dsDNA。P210G, G211A, PG210,211GA突变可能导致采用MCM蛋白质构象,支持绑定ssDNA而Q176A和其他D212N可能稳定构象。

减少与Q176A ssDNA绑定观察突变蛋白可以恢复在ATP(图的存在4 (c))。此外,在尺寸排阻色谱法,Q176A突变蛋白显示一个相对广泛的洗脱图(图2(一个)),这表明突变可能导致不稳定的dodecameric戒指。Q176位于的结束β表7 (β7),跨域B和c .域B既涉及通过锌指DNA结合(10,18)和dodecamer形成(16,25]。可能变异Q176A可能影响的结构和/或取向域B与其他分子从而影响DNA结合和dodecamer的稳定性。

完善,中央腔内的带正电的残留hexameric MCM负责ss和dsDNA绑定(4,26]。它也被报道,解旋酶与DNA相互作用通过位于表面残留的MCM [27,28]。虽然尚不清楚,或者,MCM蛋白结合ss或dsDNA中央腔外,这里给出的数据可以表明,交互,至少部分是通过P210 G211, Q176。数据还表明,这种交互MCM表面可能发挥监管作用之间切换ss和dsDNA绑定。这些相互作用表面的分子,但是,并不是必不可少的解旋酶的活动在体外。在未来,当开发方法时,它将感兴趣的研究这些突变的影响在活的有机体内。

缩写

CD:	圆二色性,
DSC:	差示扫描量热法,
dsDNA:	双链DNA,
罗马数字:	Minichromosome维护,
ssDNA:	单链DNA。

承认

作者要感谢Lori凯尔曼博士对她的评论。这项工作是由NSF (mcb - 0815646)的资助授予z凯尔曼。

补充材料

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