小说对血红素的生物合成途径古生菌:Genome-Based生物信息学预测和实验证据

文摘

血红素是一个重要的辅基对许多蛋白质参与基本生物过程在所有三个领域的生活。在真核生物和细菌血红素形成通过保存和研究生物合成途径。令人惊讶的是,在古生菌血红素生物合成过程通过另一种路线是知之甚少。为了制定一个工作假说新颖的途径,我们搜查了59古细菌基因组的完整测序的存在建立了血红素生物合成的基因组成的基因簇,与守恒的候选基因。大多数古细菌基因组中可以识别这种血红素生物合成基因簇。从这个分析我们能够识别一些新颖的血红素生物合成基因限于古生菌。有趣的是,几个编码蛋白质显示相似的酶参与血红素d₁生物合成。启动的实验验证两个建议甲烷八叠球菌属巴氏细菌蛋白质预测催化初始步骤的热点血红素生物合成重组生产,提纯,预测酶功能验证。

1。介绍

血红素、修改四吡咯作为必不可少的许多酶的辅基,感官和调节蛋白。血红素也基本组件的电子传递链驱动有氧和无氧呼吸作用和光合作用在几乎所有生物体。因此,heme-containing蛋白质被发现在所有三个领域的生活,真核生物,细菌,古生菌。这一重要的生物合成,无所不在地分布式分子一直在深入研究真核生物和细菌,但在古生菌血红素生物合成是知之甚少。现在建立了细菌和真核生物,血红素生物合成过程沿着一条守恒的途径与高度相关的酶和生物合成的中间体(图相同1(一))[1]。血红素合成代表只是一个更大的一个组成部分,支四吡咯生物合成途径,也负责叶绿素的合成,细菌叶绿素、维生素b12, siroheme,血红素d₁F和辅酶_430年(图1 (b))[2]。

血红素的共同前体的形成和所有其他四吡咯5-aminolevulinic酸(ALA)。根据生物分子是通过缩合合成甘氨酸和琥珀酰辅酶(Shemin通路)阿拉巴马州合酶(-^一个从glutamyl-tRNA)或在一个两步酶过程通过中间glutamate-1-semialdehyde glutamyl-tRNA还原酶(- (GSA)^B)和GSA-2 1-aminomutase (HemL) (C₅通路)[3,4]。然后转换成八个分子的阿拉巴马州uroporphyrinogen III (UROGEN),第一环状四吡咯的通路,连续三酶步骤。首先,两个阿拉巴马州分子凝聚了胆色素原合成酶(HemB)吡咯衍生物胆色素原(PBG) [5]。在下一步中,百事装瓶集团四分子oligomerized百事装瓶集团的线性四吡咯pre-uroporphyrinogen脱氨酶(HemC)最后uroporphyrinogen III (UROGEN)是由环化的pre-uroporphyrinogen UROGEN合成酶(HemD) [6]。中间uroporphyrinogen三世代表所有四吡咯的最后共同的前体,因此通路的一个重要的分歧点。转移的生物合成路线导致血红素和(bacterio)叶绿素的形成通过中间coproporphyrinogen III (COPROGEN)和其他代表维生素b12的第一步,siroheme,血红素d₁F,辅酶_430年从花色通过常见的中间precorrin-2。COPROGEN和precorrin-2由UROGEN分歧点的关键酶uroporphyrinogen三世脱羧酶(血红素)和年代分别-adenosyl-L-methionine-dependent uroporphyrinogen三世甲基转移酶(SUMT)。真核生物和细菌血红素生物合成更多的收益通过COPROGEN转化为第九protoporphyrinogen (PROTOGEN) coproporphyrinogen三世氧化酶(HemF)或脱氢酶(HemN)和随后的氧化protoporphyrinogen第九氧化酶(铁窗栏栅,HemG)原卟啉IX(原型)7]。最后,二价铁插入原型由亚铁螯合酶(HemH)收益率最终产品血红素(8]。所有血红素生物合成的酶已经从许多不同的真核和细菌纯化生物和生化特征(1]。相应的基因(丙烯酸-,l,B,C,D,E,F,N,Y,G,H)都被克隆和测序9]。在图1(一)常用的基因名称为所有细菌血红素生物合成基因一起给出相应的酶的名称。

在2002年和2008年在两个独立的生物信息学研究血红素生物合成基因在原核生物的分布调查分析目前微生物基因组测序(10,11]。它被发现,几乎所有的细菌合成血红素新创拥有完整的一套哼哼基因(即,丙烯酸-^一个或丙烯酸-^B,hemL,hemB,hemC,hemD,亚铁血红素,hemF和/或hemN,铁窗栏栅或hemG,hemH)。相比之下,一些细菌(例如,梭状芽胞杆菌和脱磷孤菌属物种)和几乎所有的古细菌被发现拥有只有UROGEN形成所需的基因编码的酶(丙烯酸-^B,l,B,C,D)和缺乏所需的基因编码的酶UROGEN转化为血红素(10,11]。这样的发现可以解释为(i)的可能性,这些生物不需要血红素,需要初始氰钴胺素基因,siroheme,辅酶F_430年,或血红素d₁形成,(ii)的可能性,他们从环境中血红素,或(3)另一种的存在,未知,血红素生物合成途径。对于许多浮游细菌和古生菌血红素吸收不是很可能由于血红素是不可以在自己的环境中。然而,这种情况下的几个例子中存在古生菌和细菌(12,13]。此外,一些病原菌从他们的主机和使用它作为一个血红素铁源。然而,这些细菌通常拥有一个完整的血红素生物合成装置(11]。

大家都知道有一段时间了脱磷孤菌属物种和许多古生菌含有细胞色素和其他heme-containing蛋白(14- - - - - -22),因此它们必须能够合成自己的血红素。事实上,硫酸盐还原细菌脱磷孤菌属寻常的和产甲烷archaeon甲烷八叠球菌属巴氏细菌这是实验表明,另一种血红素生物合成路径必须存在。在这些情况下在活的有机体内标签的研究表明,他们的血红素含有甲基环A和B,源于蛋氨酸(通过年代-adenosyl-L-methionine)而不是从阿拉巴马州血红素合成通过经典的途径(23,24]。此外,在d .寻常的sirohydrochlorin (precorrin-2的氧化形式),12日18-didecarboxysirohydrochlorin,粪卟啉三世,原型被孤立为潜在的血红素生物合成中间体(25]。因此,替代血红素生物合成途径的经典途径似乎分支UROGEN阶段。在第一步的替代路线UROGEN是甲基化环A和B SUMT-like酶产量precorrin-2(图1 (b))。这种UROGEN SUMT-dependent甲基化也从花色所需的维生素b12, siroheme,血红素d₁F,辅酶_430年(图1 (b))。最近,在d .寻常的双功能酶带UROGEN合成酶和SUMT活动和precorrin-2脱氢酶(PC2-DH)催化氧化precorrin-2 sirohydrochlorin生化特征(26]。这两个酶可能参与在这个生物替代血红素生物合成途径。

除了在活的有机体内标记的研究m·巴氏细菌另一种血红素生物合成途径尚未研究古生菌,到目前为止。在过去的几年里古细菌基因组的完整测序的数量大大增加,因此我们决定开始调查的热点血红素生物合成与寻找潜在这些基因组内血红素生物合成基因簇。我们发现许多古生菌基因组成的集群包含已知的早期血红素生物合成基因(丙烯酸-^B,hemL,hemB,hemC,hemD)和“近红外光谱——“基因编码蛋白同源蛋白质参与血红素d₁反硝化细菌的生物合成。此外,经常的基因编码一个假定的SUMT和潜在PC2-DH局部被发现在这些热点血红素生物合成基因簇。在这里,预测SUMT和PC2-DHm·巴氏细菌重组生产、纯化和显示在体外分别携带SUMT和PC2-DH活动。

2。材料和方法

2.1。化学物质

所有化学品、试剂和抗生素是来自Sigma-Aldrich默克(Taufkirchen、德国)或(达姆施塔特,德国)。DNA聚合酶、限制性内切酶和PCR条件购买来自新英格兰生物学实验室(法兰克福点。,德国)。寡核苷酸引物了元生物型国际AG (Martinsried,德国)。PCR和凝胶萃取净化包买来试剂盒GmbH(希尔登,德国)。镍琼脂糖6快流购买通用电气医疗集团(德国慕尼黑)。尿卟啉三世从前沿科学获得欧洲(英国Carnforth)。

2.2。重组蛋白生产建设向量

的基因mba_A1461编码一个潜在PC2-DHm·巴氏细菌使用引物PCR扩增01 cysgn_mba_吗BamHI_fw(棉酚GGG ATC CGA TGA CCA AAA CCA ATA ATT TTC)和02 cysgn_mba_不I_rev(棉酚CGC GGC公司治理文化TTA ACG GTT GCT GTT CAC)包含Bam你好,不我限制网站(下划线)和克隆到适当削减pET-Duet-1 (Novagen,达姆施塔特,德国)生成pET-Duet_mba_A1461。的质粒pMA_mba_A1461(GeneART、雷根斯堡、德国),它包含一个合成的副本mba_A1461基因,codon-optimized表达大肠杆菌用作PCR DNA模板。

的基因mba_A1791编码一个假定的SUMTm·巴氏细菌使用的引物PCR扩增MbarcobA-ATG (CA吗C ATA TGT CAG棉酚ATT ACG棉酚和MbarcobA-Stop(亚美大陆煤层气有限公司)GG ATC CAA一AC标记T助教AAA GTC AAC太极拳TGT包含20)濒死经历我和Spe我- - - - - -Bam嗨限制性位点从基因组(下划线)m·巴氏细菌DNA。结果PCR碎片和向量pET14b (Novagen)随后被消化濒死经历我和Bam嗨生成pET14b_和结扎mba_A1791。

2.3。菌株和生长条件

大肠杆菌DH10B用作克隆的主机。重组蛋白的生产大肠杆菌菌株BL21 (DE3)和恒星BL21 (DE3) pLysS被使用,分别。的表达载体pET14b_mba_A1791变成了大肠杆菌pLysS恒星BL21 (DE3)。向量pET-Duet_mba_A1461变成了大肠杆菌BL21 (DE3)。重组蛋白的生产大肠杆菌菌株携带相应的向量被种植在37°C LB-medium包含适当的抗生素。通过添加50个蛋白质生产感应μM异丙基异丙基-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)文化在578纳米的光密度为0.6。的大肠杆菌包含pET-Duet_ BL21 (DE3)应变mba_A1461进一步培养在37°C 4 h。的大肠杆菌恒星BL21 (DE3)包含pET14b_ pLysS应变mba_A1791进一步培养18 h的17°C。细胞被离心收获和储存在−20°C。

2.4。酶和四吡咯的净化

重组酶的亲和色谱净化进行描述之前(27用微小的变化)。短暂的再悬浮大肠杆菌细胞,窝藏生产重组蛋白,缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸液pH值(7.5),300毫米氯化钠,10% (w / v)甘油)包含1毫米phenylmethanesulfonyl氟化物的使用。细胞被破坏了使用法国媒体(1000 p.s.i。)和可溶性蛋白质分数获得了超速离心法(60分钟175000×g 4°C)。上层清液应用于1毫升的镍琼脂糖6快流(通用电气医疗集团)。积累在包含四吡咯的主要材料在活的有机体内蛋白质生产应用于1毫升硅胶100 C₁₈逆转阶段列(Sigma-Aldrich)和之前描述的提取四吡咯27]。Ni-resin与结合蛋白被广泛与缓冲a . preelution一步后缓冲区包含20毫米的重组蛋白质筛选了咪唑咪唑缓冲区包含300毫米。后立即洗脱缓冲交换进行厌氧室(美国腼腆的实验室、青草湖、MI)通过蛋白质溶液通过NAP-25列(通用电气医疗集团)已经包含5毫米二硫苏糖醇平衡与脱气缓冲。蛋白质是储存在−20°C,直到需要。

2.5。蛋白质浓度测定

布拉德福德试剂(Sigma-Aldrich)是用于确定蛋白的浓度,根据制造商的指示,用BSA作为标准。

2.6。分子质量测定

为了确定蛋白质的低聚物的状态进行凝胶渗透色谱法使用Superdex 200 10/30 GL列AKTA净化器系统(通用电气医疗集团)。包含5毫米的列与缓冲的时候使用四个标准蛋白质二硫苏糖醇和校准:细胞色素c,伴清蛋白,乙醇脱氢酶,β淀粉酶(Kit凝胶过滤分子量标记(Sigma-Aldrich))。蛋白质样品(1毫克毫升¹)应用于列和蛋白的洗脱被洗出液的吸收测定监控像之前描述的那样在280海里(27]。

2.7。体外酶活性分析

在体外酶活性的重组生产和纯化Mba_A1791和Mba_A1461蛋白质测量像之前描述的那样使用耦合酶测定(27]。试验是在厌氧室(腼腆实验室)在严格的厌氧条件下(O₂= 0 ppm)。衬底uroporphyrinogen III生成酶使用纯化HemB从阿拉巴马州1毫米(0.14μ米)从铜绿假单胞菌HemC (0.15μ0.17米)和HemD (μ米)从芽孢杆菌megaterium在最后一卷1毫升的脱气缓冲B包含50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸液pH值(8.0),100毫米氯化钾,MgCl 5毫米₂,50 mM氯化钠。为了研究Mba_A1791酶的活性是1.5添加到最终的浓度μM,山姆作为甲基供体是200年添加到最终的浓度μm .为了确定Mba_1461的活动,precorrin-2是使用生成的铜绿假单胞菌NirE SUMT (271.5)的浓度μm . Mba_1461被添加到最终浓度为1.5μ与100μ米纳德⁺。一夜之间,反应混合物被孵化在37°C在黑暗中。的紫外可见光谱测定混合物被记录在v - 650分光光度计(Jasco, Gross-Umstadt,德国)。

2.8。生物信息学分析

古细菌的基因组分析和比较的“比较分析微生物基因组数据库”(http://mbgd.genome.ad.jp/)使用28- - - - - -30.]。这个数据库包含68古细菌基因组的完整测序。这些68年我们最初选择一个用于每个物种基因组分析,也就是说,不同菌株并不包括在一个物种,造成我们59基因组。古细菌物种的基因组选择表中列出1。我们还包括的基因组大肠杆菌,铜绿假单胞菌,d .寻常的作为我们的搜索的积极的和消极的控制。首先,数据库搜索已知的早期血红素生物合成基因大肠杆菌(丙烯酸-^B,hemL,hemB,hemC,hemD),然后在数据库被用来找到“古细菌基因组同源集群”。“同源集群”工具所有同源哼哼选择基因组的基因和多个基因组地图显示比较可以。我们选择聚类参数默认值的数据库。使用多个基因组地图比较“工具我们确定了基因具有相似的集群组织在附近已知的早期的古细菌基因组中血红素生物合成基因。

3所示。结果与讨论

3.1。末血红素生物合成基因缺失古细菌基因组

为了识别潜在的血红素生物合成基因簇59古细菌基因组分析我们第一次检查的存在和基因组定位早期血红素生物合成基因丙烯酸-^B,hemL,hemB,hemC,hemD。接下来,我们检查的基因位于附近直接使用MBGD数据库。59岁的古细菌基因组包括在这项研究中我们发现12个基因组不包含任何显而易见的哼哼基因(表1)。这些生物显然不合成四吡咯新创除非通过一个全新的途径。此外,这些成员古生菌不需要血红素和其他四吡咯,分别,或者他们能够拿起这些化合物从环境如前所述12]。例如,近日有报道称,许多热点拥有基因编码假定的同系物的原核BtuFCD维生素b12吸收系统(31日]。在缺乏的12个基因哼哼我们还发现基因btuFCD同源染色体的异常Korarchaeum cryptofilum和Nanoarchaeum equitans基因组(没有显示)。

然而,在大多数(47)的基因组研究我们发现所有5个哼哼基因(丙烯酸-^B,hemL,hemB,hemC,hemD),其编码的蛋白质产品已知负责四吡咯UROGEN前体的形成。的基因组是一个例外Aeropyrum pernix错失了一个可辨认的是哪一个hemD基因。(之前已经观察到10,11我们未能发现的基因亚铁血红素,hemF / N,hemG / Y,hemH编码已知的血红素生物合成后期酶催化UROGEN成血红素的转换。从这个规则例外来自的分析Picrophilus torridus,热原体属acidophilum,热原体属volcanium基因组。这三个物种的基因组包含亚铁血红素和hemH基因编码UROGEN脱羧酶和亚铁螯合酶,分别强调了在先前的研究10,11]。但是,没有基因编码识别COPROGEN氧化酶类/脱氢酶(hemF / N)或PROTOGEN氧化酶类(hemG / Y)被发现。因此,大多数古生菌具有遗传潜力综合UROGEN glutamyl-tRNA通过中间体GSA,阿拉巴马州,空气层,pre-uroporphyrinogen似乎heme-containing蛋白质的基因。因此,为了使血红素他们必须变换UROGEN的小说途径不同于已知的血红素生物合成路线。这是与观测一致,产甲烷archaeonm·巴氏细菌综合其血红素通过中间precorrin-2 [24]。

3.2。古细菌哼哼基因集群和SUMT PC2-DH基因

在接近bioinformatical检查染色体组织检测的热点哼哼基因我们发现他们通常位于基因集群包含两个或两个以上哼哼基因(表1和图2)。有趣的是,在这些哼哼基因簇,我们也发现基因可能编码一个SUMT和precorrin-2脱氢酶(PC2-DH)。SUMT蛋白质催化年代-adenosyl-L-methionine-dependent UROGEN的甲基化在A和B环位置给precorrin-2(图2和71 (b))。PC2-DH蛋白质进而氧化的precorrin-2 sirohydrochlorin河畔⁺端依赖反应。不幸的是,这两个基因的命名MBGD数据库是相当一致的SUMT编码基因有时命名cobA,cysG-1,cysG-2,cysG,uroM,或hemX,基因编码PC2-DH称为sirC,hemX,cysG,或cysG1。在下面我们将参考基因编码甲基转移酶和脱氢酶的SUMT和PC2-DH基因,分别。在古菌SUMT可能是需要所有四吡咯的合成包括血红素,维生素b12, siroheme,辅酶F_430年(24,32]。PC2-DH已经显示最终参与siroheme在细菌和厌氧氰钴胺素的形成(33,34),可能会履行这个功能也在古生菌。参与血红素和辅酶F_430年从花色尚未证明,需要进一步的实验证据。

虽然酶都需要所有这些不同的形成四吡咯在古生菌,有趣的是,几乎所有热点有只有一个SUMT和一个PC2-DH基因。从这个规则是唯一的例外Archaeoglobus fulgidus拥有两个SUMT基因。如前所述,SUMT和PC2-DH基因往往聚集在基因组与早期哼哼基因。这个聚类的基因编码酶负责阿拉巴马州的变换成precorrin-2或sirohydrochlorin为生物提供了协调基因表达的可能性和连续生产的酶催化生物合成的步骤。然而,这样的血红素生物合成基因簇没有发现古细菌基因组。一些调查的物种,像Ignicoccus hospitalis和Caldivirga maquilingensis血红素生物合成基因发现,随机分散在整个基因组(表1)。

3.3。潜在的参与近红外光谱例如在古细菌血红素生物合成基因

有趣的是,在32包含早期的古细菌的基因组哼哼我们还发现所谓的基因近红外光谱基因(nirD,nirH, nirJ)硝唑在大型基因簇丙烯酸-^B,hemL,hemB,hemC,hemD,SUMT,PC2-DH基因(表1和图2)。这是以前报道,d .寻常的和一些产甲烷古菌港近红外光谱基因的基因组。这是推测的近红外光谱基因可能参与了替代血红素生物合成途径在这些生物26]。在这里,我们不仅显示产甲烷古菌含有近红外光谱基因,而且大部分古生菌合成血红素新创需要这些基因(表1)。这些近红外光谱基因编码的蛋白质同源蛋白质参与血红素d₁等反硝化细菌的生物合成铜绿假单胞菌。的dioxoisobacteriochlorin血红素d₁作为一个重要的辅基细胞色素cd₁亚硝酸还原酶催化脱氮的第二步36]。然而,根据氨基酸序列同源性搜索,Pyrobaculum aerophilum,Pyrobaculum arsenaticum,Pyrobaculum calidifontis拥有一个潜在的细胞色素cd₁亚硝酸还原酶。所有其他古细菌基因组分析在这项研究中没有。因此,大多数的热点近红外光谱基因是没有参与血红素d₁生物合成。相反,它们可能参与血红素生物合成。因此,我们重新命名近红外光谱——基因的古生菌ahb(古细菌血红素生物合成)近红外光谱基因。

3.4。结构潜在的血红素生物合成基因簇古生菌

正如上面提到的,ahb-nir基因通常是集群的哼哼,SUMT,PC2-DH古细菌基因组的基因。最完整的基因簇,由10的11潜在血红素生物合成基因的基因组中发现了p . aerophilum和p . arsenaticum(图2)。在p . aerophilum这些基因形成一个大的、不间断的基因簇。另一个显著的集群中可观察到血红素生物合成基因的潜力Methanosarcinales(图2)。例如,在基因组的m . acetivorans和m·巴氏细菌的基因丙烯酸-^B,hemL,hemB,hemC,ahb-nirD,ahb-nirH,ahb-nirJ1,PC2-DH组织作为一个连续的基因簇,而基因吗hemD,ahb-nirJ2,SUMT本地化在一起,第二个基因簇。在Halobacterium sp。NRC-1三个血红素biosynthesis-related基因簇被发现。第一个集群包含的基因hemL,hemB,hemC,hemD,SUMT,第二个包含丙烯酸-^B,PC2-DH,ahb-nirD,ahb-nirH第三个包含ahb-nirJ1,ahb-nirJ2(图2)。在其他拥有的热点ahb-nir基因的聚类哼哼,SUMT,PC2-DH基因不太明显,但仍有经常colocalization一个或两个ahb-nir与一个或几个的基因哼哼基因(表1)。

3.5。提出的函数ahb-nir在血红素生物合成基因的古生菌

正如上面已经提到的ahb-nir基因编码的蛋白质与蛋白质参与血红素d₁生物合成。我们比较Ahb-Nir蛋白质的氨基酸序列m·巴氏细菌与近红外光谱参与血红素蛋白质d₁生物合成的铜绿假单胞菌。我们发现以下序列的身份:m·巴氏细菌Ahb-NirD和铜绿假单胞菌NirD: 36.3%;Ahb-NirH NirH: 40.1%;Ahb-NirJ1 NirJ: 29.5%;Ahb-NirJ2 NirJ: 38.8%。因此,Ahb-NirJ2更类似于血红素d₁生物合成蛋白质NirJ Ahb-NirJ1比。此外,我们发现31.8%的氨基酸序列的身份两个Ahb-NirJ之间的蛋白质。

尽管准确的功能近红外光谱参与血红素蛋白质d₁生物合成尚未建立,一些合理的建议是26,36- - - - - -40]。首先,众所周知,血红素d₁从precorrin-2 biosynthesized [27,35]。为了获得血红素d₁必须从这个前体以下修改:(一)脱醋酸环C和D组,丙酸(b)切除在a和b环侧链含氧的团体和更换,(C)形成的丙烯酸酯侧链戒指D (D)氧化四吡咯macrocycle, (e)铁插入。这些反应是未知的。然而,它提出了氧化反应(b)可能被NirJ蛋白催化血红素d₁形成(37]。NirJ属于所谓的激进山姆酶家族成员被认为是催化化学挑战的反应通过radical-based机制(41,42]。也推测NirD NirL, NirG, NirH蛋白质可能负责脱羧反应(一)38]。

为了形成血红素从环precorrin-2乙酸组进行脱羧反应的酶C和D的反应(a)是必需的,因此可能被Ahb-NirD催化和Ahb-NirH。此外,醋酸在A和B环侧链必须被移除,可能在一个类似的反应的机理反应(B)。因此,激进的山姆酶Ahb-NirJ2股票38.8%序列的身份铜绿假单胞菌NirJ催化这个反应是一个很好的候选人。这个函数之前提出了NirJ-like蛋白之一d .寻常的(26]。另一个反应所需血红素从precorrin-2已经形成,但是,没有等价的血红素d₁生物合成的氧化脱羧丙酸侧链在A和B环对应的乙烯基组。这个反应也发生在古典在大多数细菌和血红素生物合成途径真核生物。在细菌催化HemF或HemN(见图1(一))。HemN也属于激进的山姆酶家族43]。因此,Ahb-NirJ1(激进的山姆的家庭成员)可能催化形成所需的乙烯基组。总之,我们建议Ahb-Nir蛋白催化反应后期的一些步骤在古细菌从precorrin-2血红素生物合成(图3)。

3.6。分布的ahb-nir古细菌基因组的基因

按照提出的函数ahb-nir基因产物在后期步骤的热点血红素生物合成我们未能发现任何的ahb-nir在那些古细菌基因组没有任何基因哼哼基因(表1)。然而,的存在哼哼基因在一个古细菌基因组并不意味着ahb-nir基因也存在。正如上面提到的,47个古细菌的基因组包含所有五早哼哼只有32也包含的基因ahb-nir基因。拥有15个热点哼哼,但没有ahb-nir基因可能合成UROGEN仅仅作为siroheme前体(44,45),钴胺素(31日),在产甲烷菌的情况下,为辅酶F_430年(46]。然而,很可能他们不形成血红素。因此,几乎所有这些15种也拥有一个SUMT和一个PC2-DH基因siroheme所需的维生素b12,辅酶F_430年生物合成。一个例外是p . torridus不包含一个可辨认的吗PC2-DH基因。此外,t . acidophilum和t . volcanium不具备SUMT基因。有趣的是,这三个物种是唯一的代表古生菌的亚铁血红素和hemH基因被发现(见上图)。为p . torridus和t . acidophilumheme-containing蛋白质生化特征(18,20.]。然而,考虑到观测,其基因组缺乏辨认ahb-nir基因和有些晚了哼哼他们的血红素生物合成途径基因目前仍不清楚。

组内包含的32个热点ahb-nir基因几个子组可以认出来。首先,有一整套的这些物种ahb-nir基因(ahb-nirD,ahb-nirH,ahb-nirJ1,ahb-nirJ2)被发现。32的基因组包含ahb-nir27包含所有四个基因。5中并不是所有的基因组ahb-nir基因存在,这些的Halorhabdus utahensis和Methanopyrus kandleri人失踪ahb-nirD和ahb-nirH。的基因组硫化叶菌acidocaldarius,Haloquadratum walsbyi,Nirosopumilus maritimus不包含ahb-nirJ1和ahb-nirJ2。因此,对于这五种值得怀疑的是,他们自己合成血红素,如果需要。例如,对于m . kandleri和n maritimus在文献中没有发现迹象或数据库,他们拥有heme-containing蛋白质。此外,两个子组的ahb-nir包含古生菌可以区分取决于他们是否拥有两种截然不同的ahb-nirD和ahb-nirH基因或他们是否包含一个ahb-nirDH基因融合。事实上,几乎所有的古菌具有融合基因除了那些包含的产甲烷古菌ahb-nir基因(表1)。然而,在这些产甲烷菌ahb-nirD和ahb-nirH基因彼此总是位于一边在基因组上唯一的例外Methanosaeta thermophila。同样,这两个ahb-nirJ基因也常常(15 29)硝唑基因组,直接邻居或接近对方,表明基因复制两份的起源。

的生物信息学研究59古细菌的基因组结合实验证据表明两个甲基的热点血红素是来自年代-adenosyl-L-methionine强烈表明,血红素生物合成的古生菌是一部小说,但大多是未知的路线。它开始的甲基化UROGEN SUMT precorrin-2催化,紧随其后的是氧化precorrin-2 sirohydrochlorin PC2-DH和进一步转换(乙酸乙酸脱酸组、删除组、氧化脱羧丙酸乙烯基组,和插入的铁)macrocycle侧链的最可能执行的Ahb-Nir蛋白质(图3)。显然,这些提案需要测试实验。因此,我们决定先验证的预测功能m·巴氏细菌蛋白质Mba_1791和Mba_1461 SUMT PC2-DH,分别。

3.7。生产和纯化重组Mba_1791 Mba_1461

的m·巴氏细菌蛋白质Mba_1791和Mba_1461重组产生的氨基端His-tagged融合蛋白大肠杆菌。在这两种情况下,重组蛋白以可溶性形式生产和高产。我们净化Mba_1791和Mba_1461明显的同质性使用单一affinity-chromatographic一步镍琼脂糖流(图6快4(一))。纯化Mba_1791表现出轻微的棕色。紫外可见吸收光谱表明存在copurified四吡咯,可能的反应产物Mba_1791(数据没有显示)。对于其他SUMTs(例如,铜绿假单胞菌NirE)反应产物的co-purification之前已经报道过(27,35,47]。因此,纯化Mba_1791四吡咯的存在是第一个提示SUMT对这种蛋白质的功能。相比之下,纯化Mba_1461出现无色。

寡聚Mba_1791状态和Mba_1461取决于凝胶渗透色谱法。这个实验显示本机相对分子质量为55300840 Da Mba_1791和60800±7300 Da Mba_1461,分别(图4(一))。计算分子的质量基于蛋白质的氨基酸序列是26350 Mba_1791哒Mba_1461和27230年哒。因此,凝胶渗透色谱法显示蛋白质二聚的结构。其他SUMTs48,49]和PC2-DH [33,50)也被认为是二聚的蛋白质。

3.8。Mba_1791充当SUMT体内

在Mba_1791生产大肠杆菌一个红色化合物积累和保持在无细胞提取的可溶性蛋白质分数破坏细胞和超速离心法。这种化合物提取使用C₁₈反相硅胶通过紫外可见吸收光谱和分析。提取的化合物的紫外可见吸收光谱表现出强烈的吸收最大值378海里像以前报道光谱sirohydrochlorin(图4 (b))[50]。显然,重组产生m·巴氏细菌Mba_1791显示显著的SUMT生产主机的活动大肠杆菌导致的累积sirohydrochlorin, precorrin-2 SUMT反应的氧化形式产品。这样四吡咯积累在重组SUMT生产之前被描述。根据酶的来源要么trimethylpyrrocorphin的形成,这是一个nonphysiological trimethylated反应产物,或sirohydrochlorin报道(27,35,47,51- - - - - -53]。显然,Mba_1791属于一类SUMT酶积累sirohydrochlorin,不催化overmethylation precorrin-2 trimethylpyrrocorphin。

3.9。m·巴氏细菌Mba_1791是SUMT

为了调查在体外Mba_1791耦合的酶活性测定。衬底uroporphyrinogen III产酶学和孵化与重组纯化Mba_1791一夜之间。反应产物的形成后用紫外可见吸收光谱(图4 (c))。控制的吸收光谱测定混合物仅包含uroporphyrinogen III生产酶没有特征在厌氧条件下吸收特性。相比之下,增加纯化Mba_1791和山姆反应混合物导致隔夜孵化后黄颜色的解决方案。相应的吸收光谱表现出广泛吸收350 - 400和400 - 500 nm之间为precorrin-2特征(50,54]。因此,Mba_1791的确是一个SUMT。因此,我们将从现在开始Mba_SUMT名字的酶。Mba_SUMT决心与uroporphyrinogen三世的具体活动(由化学还原尿卟啉III)的浓度17μ米,200年萨姆的浓度μM和Mba_SUMT浓度为1.5μm .在这种情况下,我们观察到一个特定的活动616 nmol precorrin-2×h⁻¹×毫克⁻¹Mba_SUMT对应17 h的营业额⁻¹。这个特定的活动在同一范围的活动观察其他SUMTs27,55- - - - - -57]。

3.10。m·巴氏细菌Mba_1461是PC2-Dehydrogenase

为了验证假设PC2-DH Mba_1461的活动在体外分析产生的酶学uroporphyrinogen三世被转换为PC2-DH衬底precorrin-2之外的SUMT NirE铜绿假单胞菌。此外,纯化m·巴氏细菌Mba_1461和NAD⁺被添加到反应混合物。隔夜后孵化现在紫色反应混合物的紫外可见吸收光谱测量。谱(图4 (c))对应于一个典型的吸收光谱的sirohydrochlorin吸收最大值378海里(50]。因此,Mba_1461展出强大PC2-DH活动在体外和可以安全地分配Mba_PC2-DH。

我们还测试了的活动m·巴氏细菌酶Mba_SUMT和Mba_PC2-DH耦合分析。两人都添加到反应混合物包含所有酶uroporphyrinogen第三代。隔夜孵化后的紫外可见吸收光谱测定混合物的光谱相似反应混合物铜绿假单胞菌NirE (SUMT)和Mba_PC2-DH sirohydrochlorin的形成(图再次显示4 (c))。当山姆和/或河畔⁺省略了这个活动分析没有形成sirohydrochlorin观察(数据未显示)。

4所示。结论

在这项研究中我们发现了基因簇在许多古细菌基因组可能所需血红素的生物合成通过一种新的途径。这些基因簇包含已知的(我)哼哼基因(丙烯酸-^B,hemL,hemB,hemC,hemD)的形成所必需的血红素前体UROGEN, (ii)SUMT和PC2-DH所需基因的合成中间体precorrin-2 sirohydrochlorin,和(3)ahb-nir基因的蛋白质产物可能是负责sirohydrochlorin转化为血红素(图3)。我们建议检测ahb-nir基因是参与热点血红素生物合成和血红素d₁生物合成,因为几乎所有的古菌不具备细胞色素cd₁亚硝酸还原酶。然而,我们没有发现任何明显的潜在热点中的亚铁螯合酶基因编码血红素生物合成基因簇。的古生菌通常不具备hemH基因编码bacterial-type亚铁螯合酶,但包含多个拷贝的基因编码假定的钴-和/或镁chelatases,尽管他们不合成叶绿素。这些基因产物可能参与热点血红素生物合成。确认我们的生物信息学研究和预测需要进一步实验验证以确定的确切功能Ahb-Nir蛋白质在古细菌血红素生物合成过程。

确认

作者要感谢教授r·肖(MPI马尔堡)基因组DNA的礼物m·巴氏细菌。他们也感谢j•莫泽博士(TU布伦瑞克)有益的讨论。这项工作是财务支持由德意志Forschungsgemeinschaft的昏聩der Chemischen工业g层和BBSRC m·j·沃伦。

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