聚合物组装介孔碳酸钙的合成_3.纳米粒子的分子靶向和ph响应药物控释

摘要

CaCO_3.纳米颗粒具有理想的生物相容性和生物降解性，特别是对pH值的敏感性，非常适合作为智能载体_3.纳米粒子作为智能载体，海藻酸钠和壳聚糖作为交替组装材料，叶酸作为目标分子，并利用层层组装技术实现敏感分子靶向和pH响应药物释放。介孔CaCO_3.杂化纳米粒子对多柔比星具有高药物负载。通过用不同pH值调节模拟体液来研究不同pH值对体外药物释放的影响。通过细胞生命力和成像实验研究了人宫颈癌细胞系（HELA）的细胞毒性，靶向效果和药物释放。所有证据表明智能介孔的Caco_3.纳米颗粒可能是一个潜在的癌症治疗临床应用平台。

1.介绍

在癌症治疗中，由于单靠抗癌药物并不能区分癌细胞和健康细胞，严重的副作用几乎不可避免[1-3.]为了克服这些问题，人们开发了各种智能给药系统，以提高给药效率[4.-6.].各种刺激策略，包括光照[7.那8.，离子强度[9.那10]，氧化还原潜力[11]，温度[12]，酶学[13]及pH值[14-17已经被开发用于这些药物输送系统。其中，pH响应策略引起了人们的特别关注，因为它具有使癌组织形成酸性环境的能力[18］.肿瘤组织的pH值(5.7-7.2)低于血液和正常组织，核内体和溶酶体的pH值更低(5.0-5.5)[19］.

碳酸钙(CaCO_3.)是一种重要的生物矿物，在生物医学应用方面引起了极大的关注[20.］.与以往在控制运输系统中广泛应用的其他无机材料相比，CaCO是一种新型的无机材料_3.纳米球由于其理想的生物相容性、生物降解性和特别自然的pH敏感性，非常适合作为一种无毒的天然生物矿物[21-25］.到目前为止，晶体碳酸钙_3.还显示出于为药物，基因和蛋白质开发智能载体的有希望的潜力[6.那26-31].然而，先前开发的CaCO_3.混合颗粒通常是具有较小BET表面的晶体固体球，并且较大的BET表面积可以大大提高装载药物分子的能力，无论其表面电荷和亲水性如何。小粒径Caco的研究_3.以纳米介孔纳米颗粒作为药物载体的介孔纳米颗粒报道甚少。

近年来，基于带电衬底交替吸附的层逐层(LbL)技术由于其独特的特性，在制备pH响应传递方面一直具有吸引力[22那26那31]，包括温和的制备条件和易于定制（如厚度、尺寸和可变壁材）。特定细胞的靶向吸收也可以通过使用生物靶向分子（叶酸或抗体等）对载体表面进行功能化来实现，因为其具有温和的制造条件并且易于定制其特性[32那33］.

本文以海藻酸钠(SA)和壳聚糖(CS)为替代组装材料，用聚乙二醇(PEG)和靶向分子进行表面修饰，采用LbL自组装技术制备了具有pH响应性和分子靶向功能的纳米级MCNs作为智能药物载体(图)1)、叶酸(FA)，广泛用作癌细胞的特异性靶向分子[34-36].从混合介孔CaCO中控制药物释放_3.通过调节不同pH值的模拟体液，对纳米粒子进行了体外研究。通过细胞活力实验和影像学实验研究人宫颈癌细胞株(HeLa)的细胞毒性、靶向性和药物释放作用。

2.材料和方法

2．1．化学品和材料

CaCl₂, Na₂CO._3.盐酸阿霉素(DOX)和可溶性淀粉由上海阿拉丁试剂有限公司生产。壳聚糖(CS)由金壳生化有限公司采购。中国浙江。海藻酸钠(SA)和戊二醛(GA)从上海生工中分离得到。生物技术。N-羟琥珀酰亚胺(NHS)和N-(3-二甲氨基丙基)-N ' -乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)购自Sigma-Aldrich Co.， Ltd。所有的化学品都是直接使用的，没有进一步的净化。NH₂-PEG-NH₂从北京凯正生物工程开发有限公司购买，微孔水（18.2 M·在所有实验中均使用25°C下的cm。

2．2．分级介孔碳酸钙的制备_3.纳米颗粒（MCN）

介孔CaCO_3.制备纳米颗粒，然后通过LbL技术进行功能化₂(0.5 M） ，不适用₂CO._3.(0.5 M)和可溶性淀粉(5% wt%)为原料，氯化钙₂将可溶性淀粉溶液放入烧杯中搅拌30分钟。在强烈的搅拌下，娜₂CO._3.溶液快速注入混合溶液中。搅拌10 min，盖住烧杯，静置24小时，离心收集产物。在这个实验中，氯化钙的最终浓度₂和钠₂CO._3.相同条件下，可溶性淀粉的最终浓度为1.25 wt%，反应体系的总体积为400 毫升。

2．3.特征的价值

将分散在水中的样品滴入过量溶剂蒸发的碳包覆铜栅中，制备透射电镜样品。在JEOL JEM-1200 EX上记录Tem图像，加速电压为100 kV。表面分析由ASAP 2020吸附分析仪在77k下进行。用Brunauer-Emmett-Teller (BET)法计算了比表面积，用Barrett-Joyner Halenda (BJH)法计算了孔径分布。用Perkin Elmer Lambda 750紫外-可见分光光度计获得紫外-可见光谱。傅里叶变换红外光谱(FTIR)由Nicolet公司的Nicolet公司提供。

２.４.DOX加载到mcn

盐酸阿霉素可以很容易地封装在mcn中。在486 nm处测定了DOX-MCNs在pH = 1的盐酸溶液中的吸附量。将DOX在介质中卸载后，可直接用于下一批等效DOX。载药量和包封率计算公式如下:

2．5．层一层的功能化DOX-MCNs

多层杂化包覆介孔CaCO_3.通过LBL组装技术制备纳米粒子。Caco的第一步_3.纳米粒子涂层是在CaCO表面沉积一层聚电解质多层膜（CS/SA/CS）_3.模板。CaCO的最外层_3.纳米粒子是一种阳离子聚电解质CS，使粒子表面带正电荷。利用带负电荷的碳酸钙之间的静电相互作用建立了复合多层膜_3.纳米粒子和聚阳离子Cs，和200毫克的可可_3.纳米粒子分散在40 mL去离子水中，加入100 mg CS作用1 h。经过3次离心和水洗，CS、脱乙酰度和分子量分别为96%和6.0 × 10^5.，分别沉积在碳酸钙上_3.纳米颗粒获得杂化复合粒子。然后用40 mL SA(0.25%蒸馏水，粘度350 cps, 1 mg·mL)孵育60 min^-1溶液)，然后离心干燥。通过对两种聚电解质的连续吸附，制备了由1 ~ 6层CS/SA组成的多层组件。

2.6。Folate-Conjugated DOX-MCNs

表面的混合复合碳酸钙_3.使用双官能PEG进行修饰纳米颗粒。简而言之，约200mg上述混合复合性Caco_3.纳米颗粒分散在25%的溶液中 毫升去离子水和1.5毫升 加入1%戊二醛（GA）mL以引入官能团。离心混合物并用水洗涤三次后，50 氨毫克₂-PEG-NH₂取5 mL硼氢化钠(2.0 mg·mL^-1）加入悬浮液中。将约65mg（0.15mmol）的Fa溶解在2.5ml二甲基硫化物氧化物（DMSO）中。然后将40mg的N-羟基琥珀酸盐（NHS）和30mg（3-二甲基氨基丙基）-N-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC 1HCl）加入到溶液中以激活FA的COOH基团。FA / NHS / EDC的最终摩尔比为1：2.2：1.1。然后将溶液加入悬浮液中。24小时后，通过离心除去游离Fa并用几次洗涤。

2.7.尺寸和Zeta电位测量

用zeta粒度仪(Nano ZS 90, Malven仪)测定了制备的纳米粒子的粒径和zeta电位。测定前，去离子水(800五十） 增加到200 L含有纳米颗粒的稀释溶液。数据为平均值 ± 标准偏差（SD）。

2.8.体外控制药物释放

体外释药实验:将10mg叶酸偶联PEG修饰DOX-MCNs粉末分散到2ml去离子水中。将分散后的溶液转移到透析袋中(切断分子量7000)，然后在37℃下将透析袋浸泡在pH值(5.4、6.4、7.4)不同100 mL的PBS溶液中。每隔一定时间取等量样品溶液(1.0 mL)，再供应等量新鲜PBS溶液。用紫外分光光度法测定药物的释放量。

2.9。体外肿瘤细胞抑制的评价

2.9.1。MTT检测

根据上一份报告[37那38]，采用MTT细胞分析法评估功能化DOX-MCNs介孔载体的细胞活力。HeLa细胞在添加10%胎牛血清(FBS)和青霉素(100单位·mL)的DMEM中培养^-1)、链霉素(100 mg·mL^-1)及5% CO₂．用3[4,5-二甲基-[2-基]2,5-二苯四溴苯(MTT, Sigma)分析细胞的活力。按以下方式进行3个重复试验，未添加MCNs载体和DOX的对照试验视为100%生长。然后用不同浓度DOX负载的MCN、无药物MCN和游离DOX孵育细胞。约1ml的完整培养基和MTT (60L 5 mg·毫升^-1)然后将其添加到每个孔中，然后在37°C下孵育4小时，然后小心地去除上清液并将其去除 将L的DMSO加入每个孔中以溶解由活细胞产生的甲藻晶体。使用微孔板读取器（BiOR550）在570nm下测量溶液的吸光度以确定OD值。细胞存活率计算如下：

在OD_治疗， OD_控制未经任何处理从细胞中获得，并且OD_空白的仅从培养基和试剂溶液中获得。基于三个独立的测量，数据以均数±标准差(SD)给出。

2.9.2。细胞成像

为了检查功能化DOX-MCN的细胞摄取和DOX释放，HeLa细胞在培养基（DMEM）中每个腔室底部带有盖玻璃的12孔滑块中培养，并在含有200μg的培养基中培养 μg·mL^-1在37℃下的纳米复合材料。在去除培养基后，用PBS（pH = 7.4）洗涤细胞三次（pH = 7.4），在激光扫描共介质显微镜（TCSP5，Leica）下观察盖玻璃。

3.结果和讨论

3．1.逐层组装的分级介孔碳酸钙的表征_3.纳米粒子

层状介孔的制剂和随后的层间Caco层的层组件_3.纳米颗粒如图所示2．首先是纳米介孔碳酸钙_3.纳米粒子合成。制备的mcn具有208 m的高表面积²·g^-1孔径为11 纳米，如图S1所示（支持信息），表明其介孔结构可能有助于随后的载药和可控释放。

采用LBL自组装技术，通过交替吸附阴离子聚电解质海藻酸盐（SA）、阳离子聚电解质（CS）制备了包覆的多层混合纳米粒子通过静电相互作用和阴离子层状MCN。对复合纳米颗粒的Zeta电位进行跟踪，以跟踪聚电解质多层涂层，如图所示2（a）．纯MCNs的Zeta电位为−7.47 mV，在LBL自组装过程中，纳米粒子表面的负电荷作为杂化阴离子。当第一层CS沉积在MCNs模板上时，zeta电位约为23.43 mV，第二层SA电位为−7.14 mV。可以证明聚电解质的变化是吸附在MCNs模板表面的。我们还注意到，当包覆的聚电解质层数超过5层时，纳米粒子表面的正负电位均大于20 mV。一般认为，表面以上20mv的电势会使纳米粒子在溶液中稳定，这说明聚电解质的沉积可以提高其在水中的分散性和稳定性[39那40］.考虑到更多的聚电解质(CS/SA)沉积会导致更大的流体力学尺寸，五层聚电解质作为最好的沉积和进一步的研究。当与功能性nhh结合时₂-PEG-NH₂聚电解质混合MCN的zeta电位从−33.1 mV −17.7 mV 那而降至−32.2 mV 在FA被绑定到表面之后。zeta电位的变化与NH的结合一致₂-PEG-NH₂和FA，因为NH₂-PEG-NH₂被带正收费，而FA负责。

数字2（b）显示了纯MCN和不同涂层工艺的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。与SA制备的MCN相比，CS和SA功能化MCN的FT-IR光谱在1110处有一个新的峰值 厘米^-1，这与C-O-C的伸缩振动有关。在1230 cm处出现了一个新的碳氮对称拉伸振动峰^-1，证实了NH的功能化成功₂-PEG-NH₂组。接枝FA后，在1735 cm处出现新的吸附峰^-1这可归因于C=O的拉伸振动，表明FA的接枝是成功的。

动态光散射(DLS)数据表明了多层碳酸钙的水动力大小_3.(FA/PEG/SA/CS-MCNs)在约300 nm的水溶液中。此外，通过监测其在含10% FBS的完整细胞培养基中的水动力大小来评估其稳定性，如图S2、S3、S4(支持信息)所示。多层包覆的MCNs在96 h内动态尺寸没有明显变化，说明这些纳米微球在生理pH值下的生物流体中相对稳定，可进一步应用于生物体系中。

众所周知，碳酸钙_3.通过在不同pH值（5.4、6.4和7.4）的缓冲液中浸泡，测试了多层涂层MCNs的pH敏感性。在pH 7.4的条件下，MCNs溶液在2小时内没有显著变化 小时，而在pH值为6.4的弱酸缓冲液中，相应的MCNs溶液在2小时后逐渐澄清 h、 更重要的是，MCNs溶液在pH值为5.5时迅速澄清，表明纳米粒子对pH值的敏感性。此外，不同pH值下纳米粒子的流体动力学尺寸随时间的变化，进一步证实了DLS对MCNs的pH敏感性。如图所示3.在中性pH值为7.4的条件下，多层涂层MCN分散缓冲液的流体动力学尺寸没有显著变化，并且在pH值为6.4时，纳米颗粒的粒径随时间而减小，表明MCN的解离缓慢，而在pH值为5.4时，解离过程显著加快加速。

3．2.载药效率高

MCNs具有介孔结构，可用于载药，以常用抗癌药物阿霉素（DOX）为模型药物，吸附在多孔CaCO上_3.纳米粒子。表格1结果表明，在不同的DOX/MCNs重量比下，随着DOX/MCNs的增加，MCNs的DOX负荷迅速增加，达到108.9 mg·g^-1在" DOX/MCNs " = 0.8。结果表明，该载体对DOX有较高的载药量。

3．3.多层涂层DOX- mcns的DOX释放

然后测量多层涂层DOX MCN在不同pH值（5.4、6.4、7.4）下的DOX释放，如图所示4.．如预期的那样，DOX的释放是显着的pH依赖性，在37℃的生理pH（7.4）中没有观察到显着的释放，但在温和的酸条件下，将药物从载体中释放到大量的外部环境。2小时后，DOX的累积释放可以在pH 5.5下达到92％，分别高于pH6.4（50％）和7.4（13％）。

3．4．细胞吸收

用HeLa细胞评价ph响应型mcn给DOX的可行性。如图所示5.， DOX- mcn孵卵后，细胞内出现强烈的红色DOX荧光信号，表明我们的纳米颗粒被细胞有效吸收。共培养4小时后，DOX从载体中释放出来，然后在细胞核区域迅速浓缩，这与以往的报道一致[41那42］.这些结果表明，DOX负载的MCN可以以pH应答方式特异性地响应病理微环境中的药物释放。

3．5．mcn的靶向功能和体外细胞毒性

为了评估FA介导的聚电解质（MCN）靶向性，比较了含有FA的DOX负载的聚电解质杂化MCN和不含FA的DOX负载的杂化MCN。如图所示6.此外，与PEG修饰的MCN相比，负载DOX的FA-靶向聚电解质杂化MCN表现出显著的细胞抑制作用，表明这种抑制作用主要是由于酸介导的靶向m多孔微球[26那27那43］.

还研究了载DOX的聚电解质杂化介孔纳米球体外对HeLa细胞的细胞毒性。数字7(一)显示Hela细胞在24小时内用不同浓度的功能MCN孵育的可行性。清楚地观察到，即使在72小时后，所有剂量中HELA细胞的可行性也高达91.0-102.5％，表明没有DOX药物的多层涂覆的MCN载体显示出非常低的细胞毒性。在自由DOX的情况下，将DNA碱对的快速插入核酸[44那45导致细胞死亡(图7 (b)-7 (d))细胞摄取后DOX MCN的pH值反应决定了细胞内生理环境中的持续杀伤作用。此外，经这些纳米颗粒处理的细胞活性表现出典型的时间依赖性细胞死亡（图7 (b)-7 (d)).

4.结论

综上所述，我们成功开发了一种具有pH响应和分子靶向功能的多功能纳米载体，这是一种单分散纳米尺度MCN，通过LBL自组装技术进行修饰，使用SA和CS作为替代组装材料靶向分子FA作为表面改性剂。在7.4的生理pH值下，多层涂层MCNs-DOX稳定，而在微酸条件下，MCNs迅速降解，导致DOX的有效释放。纳米颗粒与HeLa细胞共培养，细胞摄取效率高，细胞毒性低，分子靶向性强。考虑到CaCO固有的生物相容性和生物降解性_3.以及对pH值和肿瘤分子靶点的敏感反应，制备的杂交mcn是一种很有前途的智能纳米给药平台，具有很大的临床应用前景。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

我们非常感谢江苏省计量研究所（JSIM，中国）提供的资金支持（KJ175911）。

补充材料

补充材料包括N₂制备的MCNs在DMEM + 10%FBS中随时间变化的吸附-脱附等温线和多层膜MCNs在DMEM + 10%FBS中的动态光散射(DLS)。（补充材料的）

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