发展Nanozyme-Labeled仿生免疫测定食品中磺胺嘧啶残留的测定

文摘

磺胺类药物的过度使用和摄入残留对人体和环境造成危害。满足最大残留限度的要求由农业部指定的中国,迫切需要开发快速检测方法。在目前的研究中,分子印迹聚合物(MIP)能选择性地识别磺胺嘧啶(SDZ)准备使用SDZ为模板分子,甲基丙烯酸为功能单体。利用MIP仿生抗体和Au@Pt@SiO₂nanozyme作为一个标记,一个新的仿生免疫测定了检测磺胺嘧啶。在最优条件下,检测极限( )和敏感性( )该方法的分别为0.09和6.1 mg / L,分别。确定该方法的准确性,蜂蜜和牛奶样品中掺入磺胺嘧啶进行了分析,与复苏的范围70.8% - -90.2%。定量分析的方法也用于磺胺嘧啶残留在奶粉和牛奶样品,生产结果,相关与那些通过高效液相色谱法。

1。介绍

磺胺类药是常见的一种广谱抗生素,广泛应用于畜禽养殖,因为它们是有效的和低成本的1]。然而,不当和过度使用这些药物会导致残留在食品和环境中,对人类健康造成潜在的危害通过食物链(2,3]。因此,磺胺药物的残留在研究引起了巨大的关注。消费者,以确保食品的安全,中国农业部规定,磺胺类药的最大残留在动物食品应0.1毫克/公斤(4]。为了满足这种需求,发展监测和磺胺残留的快速检测方法的重要性。

许多农药、兽药残留的检测方法已经建立。其中,微生物抑菌方法缺乏敏感性,特异性,并需要繁琐的准备,所以他们的应用程序已经不那么受欢迎5]。其他的报道方法包括分光光度法(6),酶联免疫测定(7)、色谱和质谱(8]。这些方法,高效液相色谱法(HPLC)已成为最广泛使用的检测方法由于其优点选择性好,灵敏度高,重现性(9- - - - - -11]。然而,这种方法需要昂贵的设备,复杂的操作过程,并且耗时。酶联免疫测定是一种常见的小分子药物残留检测技术,利用免疫反应的抗原和抗体之间和酶催化反应的能力12,13]。因此,这个操作很敏感和特异性很好(14]。然而,低生物抗体的稳定性限制了其在免疫测定中的应用。为了克服这个问题,许多研究把重点放在了发展仿生抗体。分子印迹聚合物(MIP)有很多互补的蛀牙的模板分子的形状,大小,和化学功能,使它们特定的和选择性的目标分子15- - - - - -17]。在过去的几十年里,不断增加的趋势,印迹分子生物活性化合物从小型制药大《包括肌红蛋白、萘普生,抗氧化剂,双氯芬酸和尿素被无数地报道18- - - - - -22]。合成聚合物具有高稳定性的23),具体的识别,和低成本和已被证明是一个理想的仿生抗体取代生物抗体(24,25]。最近,许多仿生酶联免疫吸附试验(BELISA)方法已报告(26,27]。然而,大多数这些方法的使用自然酶标记;尽管他们的高催化活性、复杂的结构和较低的稳定可能会影响分析结果(28]。因此,需要一个新的标记取代天然酶。

Nanozyme是一种人工纳米颗粒(NP) [29日,30.]。用可调enzyme-like催化活性的特点,简单的准备,和高稳定性,它已经申请检测小分子(31日- - - - - -33]。例如,铂纳米颗粒(Pt NPs)经常表现出高的催化活性,特别是当与其他金属杂化,所以他们电化学催化[已得到广泛关注34和催化加氢35]。仅与Pt相比,双金属纳米结构不仅可以提高催化活性,而且可以提高NPs的稳定性。Pt在金表面也表现出良好的增长模式(36),Au@Pt双金属材料可以降低Pt NPs的聚合和提高催化活性37- - - - - -40]。SiO₂NPs是理想的航空公司当结合其他金属NPs (41,42]。提高效率抗原连接,Au-Pt NPs与介孔二氧化硅表面改性研究。使用MIP作为仿生抗体和Au@Pt@SiO₂nanozyme标签,小说和敏感BELISA决定将建立SDZ残留的方法。影响因素的敏感性分析方法将优化细节,和过氧化物酶活性和稳定性的纳米结构将被评估。

2。实验

2.1。材料

牛奶(包括a和b样品),牛奶,和蜂蜜从超市获得样本(泰安,山东,中国)在2019年11月。

2.2。试剂和化学物质

磺胺嘧啶(纯度> 98%)从山东购买Xiya化工有限公司有限公司(临沂,中国),硼氢化钠(NaBH₄AR)天津Kemiou化学试剂有限公司,有限公司(天津),cetyltrimethylammonium溴铵(CTAB, AR), 3、3 ,5、5 - - - - - -tetramethylbenzidine(三甲,99%纯度)和氯金酸(HAuCl₄.3H₂O, AR)从北京Biotopped科技有限公司有限公司(中国,北京),tetraethoxysilicane(张志贤,纯度> 99%)来自上海Macklin生化有限公司有限公司(上海,中国),3-aminopropyl triethoxysilane (apt,纯度> 99%)来自上海原液生物技术有限公司有限公司(中国上海)、甲基丙烯酸(MAA,纯度> 99%),2,2-azobisisobutyronitrile (AIBN,纯度> 99%),乙二醇利用(EGDMA,纯度> 99%),甲醇(AR)、乙酸(AR)和乙腈(AR)从天津化学试剂厂(天津),硝酸银(AgNO₃,纯度> 99%)和L-ascorbic酸(AR)从天津Kaitong化学试剂有限公司(天津)和二甲亚砜(DMSO溶液,99%纯度)从上海阿拉丁生化科技有限公司有限公司(上海,中国)。

2.3。装置

紫外光谱记录使用UV - 5500分光光度计(上海Metash仪器有限公司、上海、中国)。的紫外吸收特征峰nanozyme UV - 2450测定整个波长扫描(上海Metash仪器有限公司)。KBr的傅立叶变换红外光谱得到的那些时光iS10使用NICOLET光谱仪(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。高效液相色谱法(HPLC)是用于检测牛奶中磺胺嘧啶残留,蜂蜜,和奶粉(日本岛津公司集团,日本京都)Kromasil 100 - 5 - c18色谱柱( ,5μ米)(Nouryon分离产品,Bohus,瑞典)。

2.4。合成的非盟NPs

非盟NPs被seed-mediated合成方法(43]。首先,7.5毫升的CTAB(0.1米)水溶液混合着100年μL (HAuCl₄(24毫米),然后添加1.8毫升的去离子水稀释混合物。然后0.6毫升的冰冷的NaBH₄(0.01米)迅速增加了。解决搅拌磁3分钟后,溶液的颜色变化从明亮的黄色到棕色,这表示,非盟的种子已经形成。240年μL非盟的种子被加入到准备增长解决方案和孵化28°C 12 h,然后非盟NPs被离心分离纯化( ,10分钟)两次。沉积物redispersed在重蒸馏的水。

非盟NPs的增长解决方案包括100毫升CTAB(0.1毫米),2.04毫升HAuCl₄(24毫米),2毫升H₂所以₄(0.5米),1毫升AgNO₃(10毫米),800年μL L-ascorbic酸(0.1毫米)。

2.5。合成Au@Pt NPs

Au@Pt NPs是合成如下:非盟NPs(1毫升)和去离子水稀释2毫升,然后120年μL K₂竞购₄解决方案和1.2毫升L-ascorbic酸补充道。混合物混合后大力,解决方案是在30°C反应30分钟。后加1毫升的CTAB停止反应,混合解决方案被离心分离纯化( ,10分钟)。由此产生的沉淀再溶解在去离子水1毫升。

2.6。合成Au@Pt@SiO₂和Nanozyme共轭

的Au@Pt@SiO₂NPs准备如下:10毫升Au@Pt NP方案是离心机( ,10分钟),沉淀是分散在10毫升的去离子水。溶液的pH值被调整到10.6使用氢氧化钠溶液(0.1米)。混合搅拌磁20分钟,然后10μL teo乙醇溶液(20% )添加了3次30分钟的间隔。最后,该混合溶液反应在30°C 24 h。经过20μ恰当的添加L,混合解决方案是ultrasonicated 2 h,乙酸乙酯和乙醇洗涤两次。

5毫升的Au@Pt@SiO₂NPs和10μL戊二醛的添加到反应容器。在磁搅拌1 h, SDZ的解决方案是添加的克分子数相等的质量,然后解决方案是激起了另一个1 h。最后,这些产品与甲醇洗除去未反应的原料和保存在4°C。

2.7。SDZ MIP的准备

MIP的合成过程如下:0.25 g(1更易)磺胺嘧啶和0.35 g MAA(4更易)在11毫升的乙腈溶解,然后4毫升的DMSO补充道。混合物在室温下搅拌30分钟,然后3.77毫升EGDMA(20更易)和0.02克AIBN补充道。混合物是ultrasonicated 15分钟,用氮气吹5分钟,然后反应60°C 18 h。聚合过程结束后,刚性聚合物是200 -孔筛碎和渗。MIP (20 g)是索氏提取的300毫升甲醇/冰醋酸混合(9/1, )为24小时,然后用200毫升甲醇洗12 h。最后,MIP在60°C vacuum-dried 12 h。

相比之下,nonimprinted聚合物(夹)是准备使用相同的实验过程,但没有添加磺胺嘧啶。

2.8。直接竞争BELISA过程

BELISA的过程如下:5毫升nanozyme-labeled磺胺嘧啶抗原和5毫升标准溶液(0.0512 -32 mg / L)或5毫升的样品提取被添加到容量瓶,然后5毫克的MIP补充道。摇晃后90分钟和离心( )10分钟,上层清液的吸光度测量在270海里。单独计算抑制率。

2.9。样品制备

确定BELISA方法的可行性、牛奶和蜂蜜样品掺入了磺胺嘧啶进行了评估,与磺胺嘧啶残留的水平取决于高效液相色谱法。首先,5.0克的牛奶(样品)和蜂蜜样本准确重量为50毫升圆底烧瓶,然后上升为1.0毫升的磺胺嘧啶标准溶液(0.50,2.50,和12.50 mg / L)。在4°C孵化后24 h,混合物提取两次使用20毫升的乙酸乙酯。溶剂提取收集,被旋转蒸发器。提取然后再溶解1毫升的甲醇。结果分析了提取BELISA过程后过滤,0.22μm膜。

样品检测磺胺嘧啶残留水平,牛奶(b)和奶粉样本准备如上所述,没有添加任何磺胺嘧啶标准。提取检测BELISA和高效液相色谱法(GB 29694 - 2013)的方法,和磺胺嘧啶的含量进行了计算。

3所示。结果与讨论

3.1。Au@Pt纳米结构的表征

非盟NPs的吸收光谱和Au@Pt纳米结构评估使用UV-vis-NIR(图S1)。非盟NPs在810海里有一个吸收峰,这表明,他们已经成功地合成37]。非盟NPs与Pt涂层形成核壳Au@Pt纳米结构。与Pt NPs涂层后,乐队是红移835海里,这表示,非盟NPs@Pt纳米结构已经形成。

3.2。优化MIP合成的条件

SDZ模板分子之间的比例,功能单体MAA和cross-linkers EGDMA用于MIP的制备进行了优化,以确保准备聚合物表现出较高的吸附容量。各种比率和吸附能力调查如表所示S1。聚合物表现出最大吸附容量的比率(41.09毫克/克)SDZ: MAA: EGDMA 1: 4: 20。这比使用整个实验。

3.3。MIP的表征

印迹膜萃取后的傅立叶变换红外光谱(a),印膜萃取(b)之前,nonimprinted电影(c)和磺胺嘧啶(d)进行了比较。图S2显示了磺胺嘧啶拉伸峰值附近的3475厘米¹和3405厘米¹,表明h伸缩振动,峰值附近的1195厘米¹被指派给S = O组。MIP的电影在提取之前,大约1190厘米的特性¹被确定为S = O伸展振动。伸展转变(S = O)可能导致的氧原子磺胺嘧啶结合S = O集团-哦的氢原子MAA形成氢键。然而,S = O伸缩振动峰并没有发现印膜萃取后,这表明磺胺嘧啶被提取完全。这些结果表明,MIP电影已经成功做好准备。

热重分析(TGA)印电影图所示的曲线S3。在温度0到370°C之间,没有明显减少的质量MIP的电影。当温度超过370°C,质量大幅下降。这表明,印迹膜有很好的热稳定性。

测量压印材料的吸附能力,20毫克的MIP和夹添加到10毫升的磺胺嘧啶标准溶液(100 - 500 mg / L)。混合物在室温下4 h动摇了然后离心机 10分钟。吸附能力( )MIP和夹计算如下: 在哪里和磺胺嘧啶的含量是在溶液中吸附前后,分别溶液的体积,MIP的质量或夹。

MIP的吸附容量和夹SDZ增加SDZ浓度增加,但SDZ MIP的吸附能力明显优于夹(图1)。SDZ相同的初始浓度、吸附容量的MIP SDZ夹的大约1.6倍,表明MIP可以吸附SDZ专门为SDZ和有较高的吸附能力。

MIP(20毫克)的吸收动力学也调查SDZ摇晃的标准溶液为5 300 mg / L, 30岁,60岁,90年,120年,180年,和240分钟(图S4)。摇晃后60分钟,30.53毫克/克的高吸收能力,米兰理工大学管理学院获得了最大吸附容量的74.45%。120分钟内吸附几乎接近平衡。的快速吸附动力学MIP能满足BELISA方法快速检测的需要。

3.4。BELISA的优化方法

的敏感性BELISA方法可以提高了优化的反应条件:竞争反应时间和准备详细的解决方案。反应时间影响的竞争抗原和抗体之间的结合能力。在目前的研究中,不同的抗原抗体竞争结合乘以0,60岁,90年,120年,150年和180分钟进行调查,然后根据吸光度值计算抑制率。图2表明,抑制率随着反应时间的增加而增加。在竞争反应时间90分钟,磺胺嘧啶的抑制率达到最大。从90增加到180分钟时,抑制率没有变化,表明吸附达到平衡。因此,竞争响应时间被选为90分钟。

MIP对磺胺嘧啶的识别能力和选择性大大影响了准备解决方案,从而影响BELISA过程的准确性。使用甲醇、乙腈和硼酸缓冲盐水(BBS)研究了制备的解决方案。图3显示,当甲醇,抑制比和灵敏度的方法比其他解决方案实现。因此,甲醇在整个实验过程中使用的解决方案做准备。

3.5。BELISA参数的方法

BELISA方法的参数检测磺胺嘧啶在最优条件下进行评估。图4表明检测极限(LOD, )和敏感性( )该方法的0.09 mg / L(0.02毫克/公斤)和6.1 mg / L,分别。中国农业部规定,磺胺类药的最大残留在动物食品是0.1毫克/公斤(4]。因此,BELISA的LOD方法是足够低,适合确定SDZ残留在食物。

3.6。选择性BELISA方法的评价

评价该方法的选择性识别能力,MIP和夹作为仿生抗体,和BELISA标准曲线的建立在最佳实验条件下(图4)。相同浓度的SDZ, MIP表现出抑制率显著高于夹。SDZ 32毫克/ L的浓度,MIP的抑制率为63.48%,而夹的只有45.36%。因此,MIP对磺胺嘧啶有强烈选择性吸附能力。

新的BELISA方法的特异性也评估了一个大的实验有两个结构类似物的磺胺嘧啶(磺胺甲嘧啶和磺胺噻唑)。结果在表1和图5表明磺胺嘧啶的竞争效果更明显的结构类似物。仿生抗体与磺胺甲嘧啶和磺胺噻唑的大16.1%和20.3%,分别。这些结果证实,磺胺嘧啶的MIP有更好的识别能力和竞争免疫分析中发挥了至关重要的作用。

3.7。BELISA方法的准确性

该方法评估的准确性。蜂蜜和牛奶(a)样品掺入了各级SDZ(0.5, 2.5,和12.5 mg / L)使用BELISA过程进行评估。结果如表所示2具有良好的回收率达到71.80% - -90.20%。

评估方法的适用性,奶粉和牛奶(b)由高效液相色谱分析的样本,这新开发的方法。奶粉和牛奶中的SDZ (b)在水平的样本集 和 ,分别作为评估通过高效液相色谱法(图S4)。相应的浓度的BELISA方法获得的 和 ,分别,没有显著不同于那些通过高效液相色谱法( )。这些结果证实,BELISA技术有足够的精度检测食品中磺胺嘧啶。

3.8。开发方法的优点和缺点

与之前报道的方法相比,该方法有许多优点。当使用Au@Pt@SiO₂nanozyme标记,nanozyme是较小的结构比天然酶,因此结合可以减少的影响。使用MIP作为仿生比生物抗体和抗体提供了更好的稳定性也可以重复使用10倍以上没有损失的敏感性。因此,稳定的BELISA方法改进和分析的成本降低。BELISA方法被证明能表现出优异的灵敏度和适用性,这意味着它可以用于检测和分析磺胺嘧啶。然而,nanozyme目前的催化效率不如天然酶。此外,分子印迹聚合物的识别能力明显低于生物抗体。BELISA方法还有待进一步的研究改进。

4所示。结论

在目前的研究中,我们已经开发出一种新的BELISA方法通过使用人工合成的酶的天然酶作为标签。在最优条件下,检测极限( )和敏感性( )该方法的分别为0.09和6.1 mg / L,分别。该方法已成功应用于检测磺胺嘧啶残留和提供了良好的精度。拟议的分析方法具有潜在的应用在农业和食品抗生素残留,尽管它的敏感性较低。分子印迹技术的发展,灵敏度和精度MIP-based分析将会改善,他们可以提供一个重要的分析平台,分析抗生素残留在未来农业和食品。

数据可用性

将数据显示在结果与讨论部分。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是财务支持的山东省重点研发项目(2019号gnc106030)和济宁市的关键研发项目(2019 nyns002)。

补充材料

表S1:组件的效果比用于合成MIP吸附。图S1: Au@Pt纳米结构的紫外吸收光谱。图S2:傅立叶变换红外光谱的印迹膜后之前(a)和(b) (c)的提取和nonimprinted电影和磺胺嘧啶(d)。图S3: TGA曲线的MIP在加热20到600°C。图S4:动能吸收MIP的阴谋。图S5:高效液相色谱的SDZ牛奶样品。(补充材料)

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