纳米二氧化铈对大鼠腹膜炎的抗炎作用葡萄球菌epidermidis感染

摘要

客观的．研究了二氧化铈(ceo2)的作用₂)纳米颗粒对腹膜炎大鼠炎症反应的影响葡萄球菌epidermidis感染。方法．采用透射电镜、紫外-可见光谱、红外光谱和粉末衍射仪对绿茶多酚CeO2纳米颗粒进行了表征。40只成年雄性SD大鼠随机分为4组(n= 10):对照组、模型组、CeO2组、CeO2 +模型组。葡萄球菌epidermidis腹腔注射10⁷CFU /毫升细菌溶液模型组,而对照组腹腔注射等量的生理盐水,CeO2和CeO2 +模型组注射0.5毫克/公斤CeO2纳米颗粒为2 h,然后通过尾静脉注射生理盐水或细菌的解决方案2 h,分别。造模0 h、3 h、12 h、24 h、48 h后处死大鼠，收集血清和腹腔灌洗液。测定腹腔灌洗液中白细胞总数及各类型白细胞百分比。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测炎症因子TNF-水平α检测血清和腹腔灌洗液中髓过氧化物酶(MPO)活性。实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测腹膜组织中TLR2、TLR4的表达，western blotting检测TLR2、TLR4的表达及NF-的激活情况κB信号通路也是。结果．CeO2的平均粒径为37±3 nm，对蛋白质、酚类化合物和生物碱具有结合活性。通过对腹腔灌洗液中白细胞计数，发现模型组白细胞总数和中性粒细胞百分比均明显增加(均明显增加) ），而CeO2处理显著逆转了上述变化 ）．ELISA结果显示，与对照组相比，TNF-α模型组腹腔灌洗液和血清中细胞数量均呈时间依赖性增加 ）;而CeO2组无明显变化( ）;同时在CeO2 +模型组，TNF-α内容显著减少 ）．腹膜组织中MPO活性的检测显示，腹膜炎下MPO活性显著增加(所有 ），而CeO2处理可以缓解这种增加(所有 ）．RT-PCR结果显示，与对照组相比，模型组腹膜中TLR2、TLR4 mRNA表达水平呈时间依赖性升高(均与对照组相比) ），CeO2组无明显变化( ）;而在CeO2 +模型组，TLR2和TLR4 mRNA水平显著降低(均降低) ）．建立模型48 h后采集腹膜组织进行Western blotting检测。与对照组相比，TLR2、TLR4、p-NF -水平明显升高κB,》κBα模型组蛋白均显著升高 ），CeO2组无明显变化( ）模型构建前给予CeO2可显著逆转上述蛋白活化(均 ）．结论．CeO2纳米颗粒对所致腹膜炎有抗炎作用葡萄球菌epidermidis感染。

1.背景

虽然随着医学的发展，疾病的诊断和治疗取得了进展，但与腹腔感染和严重腹膜炎相关的死亡发生率仍然很高。当感染性病原体/微生物或它们的有毒代谢物存在于腹膜时，就会发生腹膜炎[1］.如果因处理不当等原因导致感染加重，往往会发展为弥漫性腹膜炎和器官功能障碍。腹膜透析也是引起腹膜炎的重要原因。通常称为腹膜透析相关性腹膜炎，其中，葡萄球菌epidermidis感染是最常见的类型[2］.据报道，大多数腹膜炎的器官损伤是由全身性炎症反应综合征(systemic炎性response syndrome, SIRS)的发展引起的。在SIRS的发生发展过程中，炎性细胞因子、组织活性氧水平升高，各器官中单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞浸润增多;所有这些因素加在一起会导致组织损伤[3.］.

铈是一种镧系金属，可以从铈中进行氧化还原循环^4＋(氧化)Ce^３＋(还原)态，常以二氧化铈(CeO2)的形式存在。之前的研究已经证实，CeO2纳米颗粒可以作为超氧化物歧化酶模拟物[4和过氧化氢酶仿制品[5]，并可减低肺动脉高压[6]，并减少缺氧引起的氧化应激[7]以及抑制环磷酰胺诱导的细胞凋亡[8］.在腹膜炎的研究中，有报道称CeO2纳米颗粒可减少腹膜炎相关的SIRS [2]，其他研究发现CeO2纳米颗粒可改善腹膜炎引起的膈肌功能障碍[9］.此外，绿茶多酚作为抗氧化剂的主要成分，以其抗氧化、抗炎、抗癌、抗心磷脂、抗菌、抗高血糖、抗肥胖等特性而闻名[10］.

在本研究中，建立了大鼠模型葡萄球菌epidermidis目的:研究生物合成CeO2纳米颗粒对该模型炎症反应的影响。

2.材料和方法

2．1．植物收集和提取

收集绿茶，晾干后制成粉末。取干茶粉10 g，加入250 ml烧杯，蒸馏水100 ml，连续煮沸10 min。煮沸的溶液用滤纸过滤，收集滤液，4℃保存。

2．2．多酚CeO2纳米颗粒的合成

取上述滤液20 ml加入锥形烧瓶中，加热至沸腾，冷却至50℃，将滤液与硝酸铈铵溶液(1 g加入50 ml蒸馏水)混合搅拌至乳黄色。然后将溶液转移到一个干净的离心管中，在4°C下离心10分钟(12,000 rpm/min)。弃上清，将离心管底部的乳白色固体沉淀转移到石英坩埚中，置于马弗炉中(600℃煅烧1 h)。1h后得到黄白色固体，进一步研磨得到CeO2纳米颗粒[11］.

2．3.合成CeO2纳米颗粒的表征

通过透射显微镜(JEM-2010，日本JEOL)对合成的CeO2纳米颗粒进行观察，并通过紫外-可见光谱(125个分光光度计，德国PerkinElmer)对其进行表征和鉴定，使用FT-IR仪器(JASCO，美国)进行红外光谱分析。此外，使用粉末衍射仪(D8, BRUKER-AXS, Germany)分析XRD谱图。

２.４.大鼠腹膜炎模型的实验设计与建立

雄性sd大鼠40只(10周龄，250 ~ 300 g)购自常州卡文斯实验动物有限公司。实验后2周内将大鼠置于室内温度20°C - 24°C、光暗交替循环(每12 h)的笼内。老鼠可以自由获得标准的啮齿动物食物和水。本研究经我院伦理委员会审核批准，所有手术操作均按照指南进行。大鼠随机分为4组(n= 10):对照组、模型组、CeO2组、CeO2 +模型组。准备葡萄球菌epidermidis解决方案，请参阅相关文献[12］.具体地说,葡萄球菌epidermidis将菌株(ATCC 35984)接种于300 ml常规培养基中，37℃，250 rpm/min摇匀过夜。次日，4℃，10000 rpm/min离心5分钟。弃上清，收集颗粒。将颗粒悬浮于50ml预冷生理盐水中，离心，以5000rpm /min洗涤5min，重复三次。最后的颗粒在预冷生理盐水中重悬准备葡萄球菌epidermidis溶液的浓度为10⁷CFU /毫升。溶液置于4℃保存，以备后续实验使用。对照组大鼠腹腔注射生理盐水;模型组小鼠腹腔注射葡萄球菌epidermidis解决方案10⁷CFU /毫升;CeO2组:尾静脉注射0.5 mg/kg CeO2纳米颗粒(溶解于200ml无菌水中)2 h后腹腔注射生理盐水;CeO2 +模型组在造模2 h前经尾静脉腹腔注射0.5 mg/kg的纳米CeO2颗粒(溶解于200ml无菌水中)葡萄球菌epidermidis溶液注入。造模后0 h、3 h、12 h、24 h、48 h处死大鼠，离心全血，取血清、腹膜灌洗液、腹膜组织进行后续实验。

2．5．计算腹腔灌洗液中白细胞的数量

腹腔灌洗液在室温下1000rpm离心10min，收集上清，−80℃保存，用于后续检测炎症因子。收集颗粒并在200重悬μl PBS，含0.6 mM EDTA。采用密度梯度离心法和赖特-吉姆萨染色法计数白细胞。

2．6．ELISA法检测血清和腹腔灌洗液中炎性因子

TNF-的浓度α采用ELISA试剂盒(R&D, USA)，根据制造商说明书进行检测。

2.7。腹腔组织中髓过氧化物酶水平的检测

将3 ml 0.05 M含0.5%十六烷基三甲基溴化铵的k -磷酸盐缓冲液(pH = 6.0)加入到总共200 mg腹膜样品中，超声20 s制备匀浆。匀浆冻融3次，10000 rpm离心15分钟。加入0.1 ml上清，加入2.9 ml 0.05 M k -磷酸盐缓冲液(pH = 6.0)，其中含有0.53 mM邻二苯胺和0.15 mM H₂O₂．用分光光度计在460 nm处每15 s连续测量溶液的吸光度5 min。MPO活性以U (units)/mg蛋白表达，1u定义为1μM过氧化物/min at 25°C [13］.

2.8。实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测腹膜组织TLR2、TLR4 mRNA水平

采用RNA提取试剂盒(DP420，中国天根)从腹膜组织中提取总RNA，用分光光度计测定其浓度和纯度。1μg的RNA逆转录为cDNA，然后SYBR Green实时荧光定量扩增。引物序列见表1．β以-Actin为内参基因，用2^−△△Ct方法。

2.9。TLR2、TLR4和NF-的表达κb Western Blotting检测腹膜组织中信号通路蛋白

用预冷PBS洗涤组织后，加入一定量的RIPA强裂解液和蛋白酶抑制剂(均购自中国碧云天)，超声下组织完全裂解。然后从腹膜组织中提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天)进行蛋白定量，然后将蛋白加热变性。在SDS-PAGE凝胶孔中加入一定量的蛋白进行电泳，然后转移到膜上。然后堵住细胞膜，加入一种抗体。经孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜等步骤后，将ECL发光液滴在膜上进行荧光显影。TLR2、TLR4、NF -κB p65, NF-磷酸化κB p65 (p-NF -κ我p65)κBα导出,κBα,β-actin购自美国Cell Signaling Technology。

2.10。统计分析

本研究计量资料以均数±标准差的形式表示。t两组间比较采用检验，单因素条件下组内比较采用方差分析。被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.纳米CeO2的透射电子显微镜和紫外可见光谱分析

CeO2纳米颗粒的透射电镜图像如图所示1(一)．每30分钟进行一次多酚CeO2纳米颗粒混合物的紫外-可见光谱分析。如图所示1 (b)，在267 nm处观察到的表面等离子体共振峰表明CeO2纳米颗粒的形成。

3．2.纳米CeO2的FT-IR分析

如图所示2，多酚CeO2纳米颗粒的官能团波长为400 cm⁻¹到4000厘米⁻¹．3423厘米⁻¹(COOH-OH), 2960厘米⁻¹(CH), 1618厘米⁻¹(酰胺II带或n -二胺)，1421厘米⁻¹(正),1270厘米⁻¹和1067厘米⁻¹(硫和乙烯基)，916厘米⁻¹， 831厘米⁻¹(有机硫化合物)，CeO2达到峰值，证实了茶多酚中存在多个官能团。通过FT-IR对多酚合成的纳米CeO2进行分析，发现纳米CeO2可以与蛋白质、酚类化合物、生物碱等化合物结合。这些化学物质在纳米粒子的合成中起着盖帽剂的作用。

3．3.纳米CeO2的XRD分析

如图所示3.， x射线衍射强度记录在20°到80°两个角度。所有衍射峰均得到了CeO2纳米颗粒的良好表征。狭尖衍射峰的强度出现在2θ分别为28.02、33.08、47.01、57.45、59.37、69.39和78.43，对应于CeO2纳米颗粒的111、200、220、311、222、400和331晶格面。上述结果表明，纳米CeO2呈球形。采用Debye-Scherrer方程计算纳米粒子的平均粒径为37±3 nm [13］.

3．4．各组大鼠腹腔灌洗液白细胞数

如图所示4(一)，与对照组比较，模型组腹腔灌洗液中白细胞总数明显增加(均有统计学意义) ）并且是依赖于时间的 ）;而CeO2组无显著性差异( ），与图所示的模型组进行比较4 (b)，4 (c),4 (d)结果表明，CeO2预处理显著降低了小鼠外周血白细胞总数(全部 ）．各组中性粒细胞百分比的变化与白细胞总数的变化一致，而巨噬细胞和淋巴细胞百分比的变化相反。

3．5．各组大鼠腹腔灌洗液和血清中炎性因子的表达

如表所示2，与对照组相比，模型组大鼠腹腔灌洗液中TNF-α水平在3 ~ 48 h时呈时间依赖性升高葡萄球菌epidermidis刺激( ）;而CeO2组与对照组比较，差异无统计学意义( ）．另一方面，与模型组比较，感染前给予CeO2可显著降低TNF-α水平( ）．表格3.结果表明，血清检测结果与腹腔灌洗液检测结果一致。

3.6。各组大鼠腹膜组织中MPO的活性

如图所示5，与对照组相比，模型组腹膜组织中MPO活性显著升高(均p < 0.05) ）并且是依赖于时间的 ）．CeO2组无显著性差异( ）与对照组比较。然而，与模型组相比，感染前给予CeO2显著降低MPO活性(均与模型组相比) ）．

3.7。各组大鼠腹膜组织TLR2、TLR4 mRNA表达水平

如图所示6RT-PCR结果显示，与对照组相比，模型组大鼠腹腔组织中TLR2、TLR4 mRNA表达水平在感染后逐渐升高葡萄球菌epidermidis(所有 ），而CeO2组无显著性差异( ）．但与模型组比较，TLR2 mRNA表达水平(图6(一))和TLR4(图6 (b))降低，差异有统计学意义(均有统计学意义) ）．ELISA和RT-PCR结果显示，随着模型的建立，炎症反应随时间逐渐增强。因此，在western blotting实验中，选择48 h作为最终检测时间点。

3.8。各组大鼠腹膜组织中TLR2、TLR4、NF-κB信号通路蛋白的表达

如图所示7western blot结果显示，与对照组相比，TLR2、TLR4、p-NF -水平κB,》κBα模型组蛋白均显著升高 ）．而CeO2组无明显变化( ）．与模型组比较，大鼠TLR2、TLR4、p-NF -κB,》κBαCeO2 +模型组大鼠血清中蛋白水平显著降低(p < 0.05) ）．

4.讨论

腹膜炎是腹膜透析的主要并发症，该技术用于治疗终末期肾脏疾病[14］.其中,葡萄球菌epidermidis是腹膜炎中重要的致病菌，具有极强的耐药性，因此很难完全清除。在腹膜炎发生时，致病菌可通过导管或导管出口进入腹腔，激活腹膜间皮细胞和巨噬细胞，进而释放促炎介质等一系列产物，引起炎症反应[15］.

纳米技术在改善日常生活质量方面显示出巨大的潜力，并已被广泛应用于新材料生产、工业、消费品和医疗应用领域。研究已经发现CeO2纳米颗粒在抗氧化治疗、神经保护、辐射保护和眼睛保护方面的积极作用[16］.Meldrum等人已经证实，CeO2纳米颗粒可以通过调节排气颗粒和过敏原引起的肺部炎症来影响过敏性气道疾病的发生[17］.随着纳米医学研究的深入，纳米粒子与生物活性药物的有机结合逐渐成为研究热点。绿茶多酚作为抗氧化剂的主要成分，具有抗炎作用[10］.鉴于CeO2纳米颗粒具有抗炎的优势，且目前尚无关于CeO2纳米颗粒对腹膜炎影响的相关报道，本研究在文献的基础上首次生物合成了CeO2纳米颗粒，并通过透射显微镜观察进一步对其进行了表征和鉴定。紫外可见光谱、红外光谱、x射线衍射谱图，进而诱导腹膜炎葡萄球菌epidermidis建立大鼠模型，探讨生物合成CeO2纳米颗粒在腹膜炎炎症反应中的作用。

NF -κB通路是典型的促炎信号通路，在炎性反应性疾病的发病机制中发挥重要作用。NF -κB可以通过激活toll样受体(TLRs)来上调促炎基因，包括细胞因子、趋化因子和粘附分子[18］.tlr是单一的I型跨膜糖蛋白，通过激活固有和适应性免疫反应中的免疫细胞反应发挥重要的防御作用[19］.当配体与tlr结合时，可触发髓系分化一级反应蛋白88-TNFα受体相关因子6-转化生长因子β-激活激酶1-IκB激酶蛋白磷酸化，导致NF-的激活κB轻链增强子，从而促进炎症因子的产生并诱导炎症反应。在本研究中，通过检测TLR2和TLR4的mRNA和蛋白表达水平，我们发现这两个受体的表达在腹膜炎的情况下都有不同程度的增加。通过进一步测试下游IκBα和NF -κB信号通路，我们发现它们的磷酸化水平升高，表明该信号通路被激活。腹腔灌洗液中白细胞数量及各类型白细胞百分比，髓过氧化物酶活性，炎症因子TNF-蛋白表达水平α在这项研究中也进行了测量。白细胞计数和中性粒细胞比例可直接反映细胞的炎症状态;MPO是髓系分化过程中合成的一种血红素蛋白。作为中性粒细胞中的一种特殊成分，其浓度与炎症的严重程度有关;肿瘤坏死因子-α是单核细胞分泌的促炎因子，以其强烈的炎症作用而闻名。本研究通过检测上述指标，证实腹膜炎状态可增加白细胞总数和中性粒细胞比例，增强MPO活性，诱导TNF-显著增加α腹腔灌洗液和血清中的水平。而纳米CeO2可以不同程度地降低上述指标的水平，从而发挥抗炎作用。

综上所述，本研究发现在腹膜炎的发生发展中所引起的葡萄球菌epidermidisCeO2抑制TLR2和TLR4基因的转录，抑制NF-的激活κB信号通路，并进一步抑制其下游的炎症因子TNF-α减少了白细胞的数量，从而减轻了炎症反应的发生。因此，提示CeO2在细胞中起保护作用葡萄球菌epidermidis为本病的治疗提供了新的思路。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目NSFC81300346资助。

参考文献

1. J. O. A. M. van Baal, K. K. van de Vijver, R. Nieuwland等人，“腹膜的组织生理学和病理生理学，”组织和细胞，第49卷，第49期。1, pp. 95-105, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. N. D. P. K. Manne, R. Arvapalli, N. Nepal等，“氧化铈纳米颗粒治疗sprague-dawley大鼠多重微生物损伤引起的腹膜炎的潜力，”危重病医学号，第43卷。11，页477 - 489,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. M. Bosmann和P. A. Ward，《脓毒症中的炎症反应》免疫学的趋势第34卷第3期3，页129-136,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. V. Baldim, N. F. Bedioui, I. MargaillBerret，“氧化铈纳米颗粒的酶样催化活性及其对Ce3+比表面积浓度的依赖”，纳米级，第10卷，第5期。15, pp. 6971-6980, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. B.-H。Chen和B. Stephen Inbaraj，“控制氧化铈纳米颗粒生物活性的各种物理化学和表面性质，”生物技术评论第38卷第2期7, pp. 1003-1024, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. M. B. Kolli, N. D. P. K. Manne, R. Para et al，“氧化铈纳米颗粒可减弱野百合碱诱导的肺动脉高压后右心室肥厚”，生物材料第35期37, pp. 9951-9962, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. A. Arya, N. Sethy, S. Singh和M. Das，“氧化铈纳米颗粒保护啮齿动物的肺免受低压缺氧诱导的氧化应激和炎症，”国际纳米医学杂志，第8卷，第2期8, pp. 4507-4520, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. M. Hamzeh, S. J. Hosseinimehr, A. Karimpour, A. R. Mohammadi，和F. Talebpour Amiri，“氧化铈纳米颗粒保护环磷酰胺诱导的小鼠睾丸毒性，”国际预防医学杂志，第10卷，第5期。第5页，2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. S. Asano, R. Arvapalli, N. Manne等，“氧化铈纳米颗粒治疗改善腹膜炎诱导的隔膜功能障碍，”国际纳米医学杂志， vol. 10, pp. 6215-6225, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. M. Prasanth, B. Sivamaruthi, C. Chaiyasut, T. Tencomnao，“绿茶(茶树)在抗光老化、抗应激、神经保护和自噬中的作用综述”，营养物质，第11卷，第5期。2, p. 474, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. xie -Li Tencomnao, Li Sun, Yi Fan等，“curcumine对急性腹膜炎大鼠腹膜toll样受体2和6表达的影响”，中国肾透析移植杂志，第21卷，第244-248页，2012。视图:谷歌学术搜索
12. Chen G.， Xu Y.，“氧化铈纳米颗粒的生物合成及其对脂多糖(LPS)诱导雄性sd大鼠败血症死亡率和相关肝功能障碍的影响”，材料科学与工程:C，第83卷，148-153页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 夏颖，“含白细胞组织中髓过氧化物酶的测定”，分析生物化学号，第245卷。1，第93-96页，1997。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. R. Mehrotra, O. Devuyst, S. J. Davies和D. W. Johnson，“腹膜透析的现状”，美国肾脏学会杂志第27卷第2期11, pp. 3238-3252, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. C. C. Johnson和S. J. Jenkins，《浆液腔巨噬细胞的生物学》，细胞免疫学，第330卷，第126-135页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. S. Hussain, F. al - sour, A. B Rice等人，“二氧化铈纳米颗粒不调节脂多糖诱导的人类单核细胞炎症反应，”国际纳米医学杂志，第7卷，第1387-1397页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. K. Meldrum, S. Robertson, I. Römer等人，“柴油尾气颗粒和尘螨诱导的气道炎症是由二氧化铈纳米颗粒修饰的，”环境毒理学与药理学，第73卷，第103273页，2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. S. Mitchell, J. Vargas和A. Hoffmann，“通过NF发出信号κB系统”,威利跨学科评论:系统生物学和医学，第8卷，第2期3, pp. 227-241, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. A. M. Hosseini, J. Majidi, B. Baradaran等，“自身免疫性疾病发病机制中的toll样受体”，先进的制药公告，第5卷，第5期。1, p. p605, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权所有©2020李艳等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。