净化、初步的结构特征和在体外对消化酶的抑制性影响β从Qingke葡聚糖(西藏Hulless大麦)

文摘

背景和目的。Qingke(西藏hulless大麦,大麦芽L。)包含一个高的内容β葡聚糖在所有的谷物品种。虽然β葡聚糖有多个生理功能,qingke的生理功能β葡聚糖是很少研究。在这项研究中,β葡聚糖分离,纯化,确定的结构特征,并测量酶的抑制活性相关的血糖和血脂。方法。β葡聚糖酶的水提物隔绝qingke通过使用除蛋白,脱色,DEAE-52柱层析法和琼脂糖CL-4B琼脂糖凝胶柱层析法。的结构β使用红外光谱和葡聚糖决心¹³理化性质谱分析,并通过使用HPSEC-dRI-LS分子质量。运动粘度测量。的抑制作用β葡聚糖酶在四个。结果。这β葡聚糖分子量201000 Da是相同的β-(1⟶4)主链和β-(1⟶3)侧链。的β葡聚糖提供了一个相对强劲的抑制活性α葡糖苷酶、转化酶适度抑制,抑制弱α淀粉酶,而它没有抑制脂肪酶。结论。研究表明,酶β葡聚糖qingke有潜力的天然辅助降糖功能医学或食品添加剂。

1。介绍

Hull-less大麦是一种栽培大麦品种在世界各地广泛传播在高原地区。皮覆盖内稃和引理是跌落在收获,它也被称为裸大麦。Hull-less大麦的主要粮食来源是当地居民在喜马拉雅山等寒冷地区国家和北非(1]。Qingke(西藏hulless大麦,大麦芽L。)是一种hull-less分配在中国的高地地区大麦(青藏高原、云南和四川)。在过去的十年里,它是逐渐注意到qingke是健康的,可以用作功能性食品。

是著名qingke含量高β葡聚糖在谷类作物(2,3]。β葡聚糖qingke是一种无支链的多糖组成的β-D-glucopyranose单位通过链接(1⟶4 1⟶3)糖苷键。麦片β葡聚糖是一种支持植物细胞壁和膳食纤维具有许多功能,其中包括降低血液胆固醇水平,降低胰岛素水平,衰减餐后血糖(4,5]。的β葡聚糖的qingke研究显示一些活动在活的有机体内和在体外。的β葡聚糖提取物qingke显示明显的生命起源以前的特点(6]。它可以有效降低动脉硬化的风险通过降低血清葡萄糖、血清脂质和胰岛素抵抗[7]。的酶β葡聚糖提取qingke辅助降糖功能在老鼠的8]。纯化的化学改性β葡聚糖有助于提高脂肪酶的抑制在体外发布的,因为郭et al。9- - - - - -11]。然而,到目前为止,还没有系统的研究对纯化的活动β葡聚糖从qingke直接对有关血清葡萄糖糖苷酶抑制活性。糖苷酶,如α葡糖苷酶,α淀粉酶、转化酶可以水解多糖增加血糖(12]。的抑制消化酶(糖苷酶和脂肪酶)可能导致的健康关怀和治疗高血糖和高脂血症。在我们先前的研究,qingkeβ葡聚糖酶提取了扩大应用的目的(8]。和酶的生物活性β葡聚糖没有调查。在这项研究中,我们分离和净化酶β从qingke葡聚糖,然后探索结构表征和bio-activities,纯化β葡聚糖,消化酶占增加葡萄糖和脂质。它可能有助于扩大qingke的应用β葡聚糖。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

的酶β葡聚糖粗提取液得到qingke的京品牌Chizhengtang药业有限公司,有限公司所有的化学试剂都是分析品位和购自国药控股集团有限公司(中国)。α淀粉酶(EC 3.2.1.1数量),蔗糖酶(EC 3.2.1.26数量),和α葡糖苷酶(EC 3.2.1.20数量)从σ(美国)购买的产品目录号A3176, I4504和G5003分别。脂肪酶(CAS号9001-62-1)是购自国药控股集团有限公司的目录数量64005761。阿卡波糖的积极化合物从拜耳(德国)购买。奥利司他(目录O4139)的化合物,p-nitrophenyl吡喃葡萄糖苷(目录编号877250)p硝基酚(目录编号N2752)购买的σ。可溶性淀粉(产品目录号10021318),蔗糖(产品目录号10021487),和3,5-dinitrosalicylic酸(目录号30073424)购自国药控股集团有限公司

2.2。隔离和净化β从Qingke葡聚糖

的酶β葡聚糖qingke准备如前所述的粗提物8]。随后的分离和净化过程称为文学方法(13,14),包括四个主要步骤:除蛋白,脱色,DEAE-52柱层析法和琼脂糖CL-4B琼脂糖凝胶柱层析法(图1)。氯仿和n丁醇喜忧参半的体积比4:1。然后被添加到混合酶β葡聚糖溶液的体积比1:4,然后用颤抖的大力20分钟和离心。变性蛋白层结的水相、有机相被过滤删除。上层溶液与HP-20混合比例的大孔树脂20:1 (v / g),搅拌均匀后,pH值调整到4.0,然后站在80分钟60°C。上层清液的混合物是离心收集20分钟在5000 r / min获取脱色β葡聚糖的解决方案。上层清液加入5倍量的95%乙醇沉淀过夜,然后离心20分钟在9000 r / min收集沉淀。降水和离心重复两次。水的溶解沉淀筛选了使用DEAE-52纤维素柱层析法和纯水。整个洗脱,紫外检测器(SPD-10A、日本岛津公司、日本)结合馏分收集器用于检测蛋白的洗脱液在280 nm波长。洗脱液的糖浓度在每管anthrone-sulfuric酸测定的方法在620 nm波长(15]。洗脱液的主要糖分数是收获,相结合,通过冷冻干燥和冻干。再溶解糖分数被琼脂糖然后纯化CL-4B琼脂糖凝胶柱层析法和筛选了纯水。由anthrone-sulfuric酸法测定洗脱液在620 nm波长跟踪糖浓度。然后,糖分数也收获,相结合,通过冷冻干燥得到纯化酶冻干β从qingke葡聚糖(EGQK)。

2.3。粘度

EGQK解决方案是由分散在去离子水EGQK浓度为0.1%。然后,乌氏毛细管粘度计是用于确定运动粘度( )根据以前报道的方法(16]。悬浮流从5次测量时间平均,和运动粘度的计算方程:

2.4。EGQK的分子质量分析

的分子量分布EGQK是获得高效凝胶排阻层析法(HPSEC)使用的列(Shodex sb - 803总部,昭和电工株式会社,日本)17]。样本过滤一个注射器过滤器(0.45μ米孔),20μl滤液被注入HPSEC列。列是筛选了0.15纳米₃0.6毫升/分钟的流量,用激光散射检测器(Wyatt heleos-II黎明,黎明怀亚特技术,美国)(LS)和示差折光检测器(Optilab霸王龙,怀亚特黎明技术,美国)(dRI)。

2.5。傅里叶变换红外光谱法(ir)光谱EGQK分析

EGQK的傅立叶变换红外光谱被记录在一个力量向量22日光谱仪(力量Optik GmbH,德国)使用KBr丸。

2.6。¹³理化性质谱EGQK的单糖组成的分析

的样本EGQK(30毫克)溶解在1.0毫升D₂O % D(99.9)核磁共振分析。的¹³在298 K C NMR谱获得了力量drx - 600核磁共振谱仪(力量BioSpin GmbH,德国)与TMS内部标准。MestReNova软件(6.1.1.2.2.4)被用来计数数据。

2.7。体外酶抑制试验

2.7.1。抑制作用,α淀粉酶、转化酶

活动抑制化验α淀粉酶、转化酶测定3、5-dinitrosalicylic酸(DNS) (18]。EGQK样本或积极控制复合酶(阿卡波糖)被添加到解决方案,然后孵化10分钟37°C或55°Cα淀粉酶、转化酶测定,分别。底物的解决方案是添加到每个管,然后反应进行了20分钟的37°C。每个管增加了800人μl和600μl DNS解决方案α淀粉酶、转化酶测定,分别。然后,加热管时在100°C 5分钟。800年μl解决方案在每个管被转移到24-well板块,OD值在540 nm。

2.7.2。抑制作用,α葡糖苷酶测定

活动抑制作用的分析α葡糖苷酶是衡量p-nitrophenyl吡喃葡萄糖苷(pNPG) [19]。在96孔板中,EGQK样本或阿卡波糖酶添加到解决方案,然后孵化为5分钟37°C。每个好了20μl(2.5毫米pNPG解决方案,然后在37°C加热30分钟。每一个与80年好了μl 0.2 Na₂有限公司₃停止解决方案,然后在405 nm OD值读取。

2.7.3。抑制对脂肪酶测定

活动抑制脂肪酶是衡量p硝基酚(p-NPP) [20.]。EGQK样本或奥利司他加入脂肪酶溶液然后孵化10分钟37°C。每个管增加了0.3毫克/毫升p-NPP解决方案然后孵化为30分钟37°C。每个管增加了300人μl 10%三氯乙酸(TCA),与300年之后μl 10%的钠₂有限公司₃停止的解决方案。1500年μl解决方案在每个管被转移到24-well板块,OD值在405 nm。指示酶抑制试验的参数见表1。酶抑制活性表现出抑制%和计算如下:

3所示。结果

3.1。准备EGQK的结果

原油的洗脱曲线β葡聚糖通过DEAE-52纤维素柱层析法如图2。洗脱峰出现在16-48管,96 - 106 64 - 78管,管。蛋白质杂质的含量少,只有出现在66 - 84年管弱吸光度和洗脱峰。主要的糖分数呈现在16-48管结合,进一步纯化获得EGQK。图3显示的洗脱曲线由琼脂糖EGQK CL-4B琼脂糖凝胶柱层析法,表明EGQK有一个统一的分子量。随着β葡聚糖提取和纯化使用这个程序,22.8克β葡聚糖可以准备1 kg qingke干粉。

3.2。EGQK的外观和粘度

EGQK显示的外观淡黄色粉末(图4)。0.1%解决方案的运动粘度EGQK是1.87毫米的²·秒¹。

3.3。分子质量的EGQK

如图5,EGQK HPSEC概要文件的一个高峰,指示一个统一的分子量。的分子质量EGQK由阿斯特拉软件进一步分析和计算。这表明EGQK分子量的分布范围是201000 Da(±1.323%)和弥散系数(Mw / Mn)为1.525 (±2.107%)。

3.4。傅立叶变换红外光谱表征EGQK

红外光谱的EGQK(图6根据以前的报告()被分配21,22]。其光谱分析显示宽带在3500 ~ 3200厘米¹代表羟基的伸缩振动吸收,而一个乐队在1655厘米¹代表其弯曲振动吸收峰。弱吸收在2800 ~ 2950厘米¹和1350 ~ 1300厘米¹表示弯曲和碳氢键的伸缩振动。变形吸收1425厘米¹可能表明存在拉伸振动的终端亚甲基(葡萄糖)。1158厘米的吸收峰¹被分配主要是为了切断伸缩振动环。醇羟基的角振动在1120厘米¹和1039厘米¹双吸收峰。

3.5。¹³C NMR分析

¹³C NMR谱EGQK(图7根据以前的报告()被分配23,24]。共振峰在104.04 ppm, 103.40 ppm的颈- 1异头碳β- (1⟶3)-D-glc,以及β- (1⟶4)-D-glc [25,26]。分析了峰值为87.75 ppm的颈- 3碳β- (1⟶3)-D-Glc。峰值为73.40,71.06,76.73,和61.28 ppm是c - 2, c - 4 c - 5,其他的β分别为(1⟶3)-D-glc残留(24]。有共鸣的68.74,72.66,80.77,75.38,和60.71 ppm,分配给c - 2,颈,其他c - 4 c - 5,碳的β- (1⟶4)-D-glc残渣分别。作业被展示在表2。的比例β-(1⟶4)联系β-(1⟶3)联系在EGQK大约是3:1根据异头碳的共振峰的比例(颈- 1)¹³C NMR谱。因此,我们推测EGQKβ葡聚糖。和EGQK包含一些β-(1⟶3)与葡萄糖残基主要之一β-(1⟶4)与线性葡聚糖链。

3.6。酶抑制

这是显示在图8,EGQK有一定的抑制性影响糖苷酶的活动(α葡糖苷酶,α淀粉酶、转化酶),但是所有的抑制效果低于阿卡波糖。所有的影响表现出剂量依赖性的方式增加EGQK浓度的增加抑制%。EGQK提出了一个相对强劲的抑制活性α葡糖苷酶。的抑制作用α葡糖苷酶的浓度达到77%的高原5毫克/毫升和10毫克/毫升。EGQK在蔗糖酶的抑制活性适中,与阿卡波糖相似。抑制率最高约50%浓度的6.66 mg / ml EGQK。EGQK显示弱的抑制作用α淀粉酶,它也有剂量依赖性的方式。抑制率为25.6%,10毫克/毫升EGQK。然而,EGQK没有显示出对脂肪酶的抑制效果(数据没有显示)。发现抑制%很低,不存在剂量依赖性的方式由EGQK脂肪酶抑制试验,而奥利司他显示良好的剂量依赖性抑制作用。结果表明,EGQK机制作为降糖添加剂由于糖苷酶的抑制作用。

4所示。讨论

β葡聚糖存在于大麦、燕麦和小麦。它是可食用的,定义为一个膳食纤维。很少有报道β葡聚糖净化尽管的内容β葡聚糖在qingke相对高的谷类作物(27]。在现在的研究中,纯化,酶的产量β葡聚糖是2.28%。此外,废渣提取和纯化过程中一般不含有毒、有害物质,因此可以重用。纯化的物理化学性质β葡聚糖也追究可能感兴趣的食品和饮料的应用程序。

麦片β葡聚糖是一种线性葡萄糖聚合物含有低聚糖所形成的联系β-D-glucopyranosyl单位。它主要是联系在一起的β-(1⟶4)和分离β- (1⟶3)(28]。在这项研究中,通过使用¹³C NMR谱,它表明EGQK拥有β-D-glucan主要用β-(1⟶4)联系,偶尔β-(1⟶3)联系。的分子量β葡聚糖对其粘度有关。EGQK相对温和的运动粘度比较高粘度的高分子β葡聚糖之前报道(16]。粘性属性扩展应用到饮料。

Hull-less大麦(qingke)包含一个高的内容β葡聚糖在所有谷物品种(29日,30.),平均含量为5.25%,正常含量从4%到8%不等(31日]。和内容的范围β在其他大麦和燕麦葡聚糖2% -6.6%,-10%和2.5%,分别是整体低于qingkeβ葡聚糖(32]。一个名为“藏清25号的新品种“包含8.62%的β葡聚糖(33,34]。此外,qingke含有更多的麸皮和短裤β葡聚糖含量减少(超过7%)比面粉(2 ~ 3%)和优惠(0.8 ~ 3%)(35]。这表明,β葡聚糖可以作为功能性食品添加剂的加工和利用麸皮的副产品,这表明qingke的综合使用。然而,没有太多深入研究的特点β葡聚糖在qingke丰富。β葡聚糖有多个生理功能(36,37)包括抗癌(38),清理肠道(39,40),调节血糖(41),降低胆固醇(42),伤口愈合43),和提高免疫力44]。qingke的主要生理活性成分,研究β葡聚糖只是专注于减少胆固醇的研究(42)和血糖(41目前。在现在的研究中,这是第一次探索qingke的直接抑制作用β葡聚糖消化酶。的抑制作用β葡聚糖对α葡糖苷酶,α淀粉酶、转化酶和脂肪酶。

在亚洲,大部分的饮食主要是淀粉,而代谢涉及酶法水解α葡糖苷酶(45),α淀粉酶(46]。这两种酶的抑制47)有利于降低血糖含量(48,49),预防和治疗餐后高血糖(50,51,缓解高胰岛素血(52,53]。转化酶是一种双糖酶水解蔗糖作为衬底。通过抑制蔗糖的吸收在活的有机体内,干预降低血糖的作用,不能刺激胰腺的胰岛素分泌。我们的研究结果表明,EGQK对这些酶有轻微的抑制作用,特别是在α葡糖苷酶。此外,EGQK在蔗糖酶的抑制作用是由阿卡波糖相似。尽管EGQK的抑制作用α淀粉酶弱得多,它也呈现剂量依赖性的方式。这些结果可以在一定程度上支持qingke的辅助降糖功能β葡聚糖在活的有机体内。

Qingkeβ葡聚糖可以减少实验动物的血液中胆固醇含量,研究报道通等人在2015年(42]。它证实了qingkeβ葡聚糖有hypocholesterolemic对仓鼠喂食了hypercholesterolemic饮食中胆固醇代谢的影响。和qingkeβ葡聚糖提出更多的抑制活性3-hydroxy-3-methyl glutaryl-coenzyme(β)还原酶相比,燕麦β葡聚糖。因此,EGQK对脂肪酶的抑制作用在体外在这项研究中。然而,它表明EGQK没有抑制脂肪酶活性和剂量依赖性的方式。它推测脂肪酶的抑制可能是由于酶解和降低粘度。但EGQK的粘度可能参与干预对脂肪的吸收,胆固醇和脂肪在体内消化道(54]。

在这项研究中,β葡聚糖从qingke通过纤维素柱层析法分离得到三个分数。在收集的主要部分由琼脂糖凝胶柱层析法,EGQK 201 kDa的分子量。核磁共振光谱表明初步结构表征β——(1⟶4)主链和β-(1⟶3)侧链。与此同时,EGQK表现出一定的抑制活性α葡糖苷酶,α淀粉酶、转化酶和没有直接抑制脂肪酶活性。初步研究表明,EGQK纯化的酶β葡聚糖有可能自然辅助降糖功能医学或食品添加剂。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

古时,曰吴和惠芳谢了同样的工作。

确认

这项研究是财务支持的京品牌Chizhengtang药业有限公司,有限公司,研究“降糖hull-less大麦的函数β葡聚糖”。

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