香菇多糖对内皮细胞的影响活动,炎症反应,内质网应激和细胞凋亡在脓毒症

文摘

本研究的目的是探索香菇多糖在内质网应激的保护作用,炎症,并在脓毒症内皮细胞凋亡。首先,香菇多糖提取、纯化和分析。香菇多糖的浓度在0.04 - 4的范围μ米,没有明显的HUVECs对形态的影响。当浓度达到10米时,细胞明显萎缩和坏死。CCK-8细胞活性实验表明,当香菇多糖的浓度达到4μM细胞活动显著降低( ),剂量依赖性的方式。然后,细胞分为对照组(0μ香菇多糖),脓毒症组,脓毒症+ 1.2香菇多糖μM组,脓毒症+香菇多糖2μM组。酶联免疫吸附试验表明,香菇多糖能显著降低TNF的表达α,il - 1β,在脓毒症内皮细胞il - 6 ( )。此外,流式细胞术和TUNEL染色显示,与对照组相比,细胞的凋亡在脓毒症组显著增加( ),和香菇多糖可以抑制细胞凋亡( )。的机制研究、mRNA和蛋白表达在内皮细胞的内质网应激相关蛋白检测到实时荧光定量PCR (qPCR)和免疫印迹,分别。发现SIRT1的表达,上游脓毒症细胞内质网应激的因素显然是抑制( ),,GRP78的表达砍IRE1α,ATF6显著增加( ),然而,香菇多糖可以显著逆转上述变化的预处理( )。此外,香菇多糖也可以减少磷酸化p65蛋白的表达(NF -激活标志κb)和进气阀打开。结论。当发生脓毒症时,香菇多糖能保护内皮细胞从人炎症和脓毒症诱导细胞凋亡。因此,香菇多糖预计将是一个新的目标sepsis-induced内皮损伤的治疗。

1。介绍

脓毒症是一个复杂的全身炎症反应综合征(SIRS)。它是重要的死亡原因之一在重症监护室的病人。它可以影响心脏、肝脏、肾、肺等器官系统导致multiorgan功能紊乱综合症的发生(插件)1]。尽管生命维持系统技术不断优化随着科学技术的进步,脓毒症的预后,特别是感染性休克,仍然很贫穷。目前的治疗主要包括传染性病原体的广谱抗生素。然而,这种方法在很大程度上忽略了脓毒症的发展,这可能导致炎症损伤细胞和其他严重并发症。

当发生脓毒症时,细菌内毒素激活单核细胞产生促炎细胞因子和趋化因子,诱导内皮细胞促炎的过渡阶段,并能激活内皮细胞产生炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α)、白介素1β(il - 1β),caspase-3活动增加,从而促进细胞凋亡的发生,在内皮细胞坏死和其他反应(2]。此外,早反应细胞因子的释放会导致生产抗炎介质,如补偿抗炎反应综合征(汽车),可引起血管不稳定和微血管阻塞,最终导致器官功能障碍和衰竭(3]。在脓毒症的发生和发展,先生们和汽车相互平行4]。因此,有效的治疗应针对脓毒症的早期proinflammatory-anti-inflammatory阶段防止器官损伤引起的内皮细胞的激活。

当寻找抗炎药治疗败血症,温和的天然化合物引起了我们的注意。例如,达格玛等人研究了Sini汤的效果和机理,青龙汤,郑雪碧汤治疗败血症内皮细胞模型,发现上面的中药有抗炎、抗凋亡作用在脓毒症5]。众所周知,含天然化合物β葡聚糖可以用来改善人类健康。例如,香菇多糖含有1,3 -β葡聚糖是一种从香菇多糖提取的活性成分。各种研究表明,抗炎,抗菌,抗癌潜力的香菇多糖(6,7]。例如,通过体外实验,Nishitani等人证实,香菇多糖可以影响引发的表达和TNFR1肠道上皮细胞,从而发挥抗炎活动(8]。美津浓也报道了类似的发现,香菇多糖可以下调引发mRNA的表达TNF -α全身Caco-2-expressing白细胞(9]。然而,在脓毒症的研究中,很少有研究香菇多糖,例如,王等人建立了烧伤脓毒症的小鼠模型,发现香菇多糖多糖发挥保护性作用通过抑制炎症因子的表达(10]。因此,本研究拟建立的模型内皮细胞与脓毒症体外预处理的香菇多糖研究香菇多糖治疗是否对脓毒症内皮细胞有保护作用,探索其潜在机制。

2。材料和方法

2.1。提取的多糖

香菇多糖提取的水提取和酒精沉淀法(11]。得到滤液后,集中,醇化与95%乙醇一夜之间,和干离心后获得原油香菇多糖粉,其次是冻融分类、除蛋白,和原油香菇多糖的纯化,最后获得香菇多糖粉(12]。

2.2。多糖含量测定

总糖和还原糖含量是衡量phenol-sulfuric酸法和3分别5-dinitrosalicylic酸比色法。多糖含量(%)=总糖含量(%)−还原糖含量(%)13]。

2.3。多糖纯度识别和成分分析

香菇多糖(3毫克)溶解在去离子水1毫升,纯度是由高性能液相色谱(美国安捷伦高效液相色谱,1260型)与SHODEX sb - 806总部列(8.0毫米×300毫米)和RID-10A视差折射计。此外,气相色谱法(GC、日本岛津公司、日本)使用毛细管柱DB-1(0.25毫米×30米)和FID检测器检测香菇多糖的组成部分。

2.4。细胞培养

主要人类脐静脉内皮细胞分离出人类脐静脉(通过传代形成细胞后10小时内交货。本研究经医院伦理委员会的批准,和志愿者提供的脐带是签署知情同意。脐静脉灌注和M199 (M199 /玫瑰/ PS)含有0.02玫瑰和100毫米penicillin-streptomycin,和内皮细胞得到消化。HUVECs包含0.02玫瑰在M199培养基培养,20%胎牛血清,100毫米双抗体,10μg / mL表皮细胞生长补充(美国BD生物科学ecg)和15个国际单位/毫升肝素(巴克斯特,奥地利)。段落之间HUVECs细胞4 - 7被用于后续的实验。人类单核细胞系THP-1购买从写明ATCC rpmi - 1640年培养基培养(美国)和(美国Sigma-Aldrich)含10%胎牛血清,0.02毫米玫瑰,100毫米双抗体在37°C公司为5%₂。

2.5。观察形态学变化HUVECs处理香菇多糖

HUVECs细胞被播种在24-well细胞培养板和培养60 - 80% confluency和香菇多糖在治疗浓度的0,0.04,0.4,0.8,1.2,2,4,10μm . 24 h后细胞形态观察与光学显微镜(德国徕卡CRT6000)。

2.6。细胞生存能力分析

细胞计数kit-8 (CCK-8、Donjindo、日本)方法被用来评估HUVECs的核扩散活动。具体来说,细胞第一次播种96孔细胞培养板的密度1×10⁴细胞/好,第二天,细胞治疗0,0.04,0.4,0.8,1.2,2,4,10μ香菇多糖为24小时。在治疗后,10μL CCK-8溶剂的添加到1小时的细胞培养基,细胞生存能力是评估通过测量吸光度的细胞在450海里,并使用以下公式表达的细胞生存能力:对细胞生存能力= OD值/平均OD值控制细胞×100%。

2.7。制备条件培养液(CdM) HUVECs刺激和香菇多糖治疗

被播种到24-well THP-1细胞细胞培养板的密度1×10⁶细胞/;10 h后的文化,增加了10 ng / mL脂多糖;和细胞培养在原始文化环境为另一个4 h。随后,细胞悬液离心机在5分钟1000克、获得CdM是储存在−80°C到使用。这个方法获得TNF -α通过对单核细胞与脂多糖研究和证实,和广泛使用的方法14]。刺激,HUVECs接种到T25细胞培养瓶(美国康宁公司),接受1.2,2μ香菇多糖为24小时。治疗后,这些细胞被洗了3毫升M199 /玫瑰/ PS然后刺激5毫升CdM 24 h。

2.8。分析和免疫印迹蛋白质表达的变化

细胞蛋白提取使用里帕裂解缓冲(Biyuntian,北京)。BCA™蛋白检测设备(豆类、日本)是用来测量总蛋白浓度与蛋白质通过比较标准。一个20μg蛋白样品被添加到准备sds - page凝胶电泳分离。分离后,蛋白质被转移到PVDF膜。抗体阻断后,主要包括CCAAT enhancer-binding蛋白质(切)(英国Abcam ab10444) glucose-regulating蛋白78 (GRP78)(英国Abcam ab21685) inositol-requiring酶1α(IRE1α)(英国Abcam ab37117),激活转录因子6 (ATF6)(65880,细胞信号技术,英国),SIRT1(8469,细胞信号技术,英国),NF -κB磷酸化p65 (ab97726 Abcam,英国),p65 (ab16502 Abcam,英国),诱导一氧化氮合酶(间接宾语)(EPR16635 Abcam,英国),蛋白质和内部参考β美国肌动蛋白(ab8277 Abcam)一夜之间添加和孵化。第二天,主要的抗体了,和一个HRP-conjugated添加二级抗体是在室温下进行孵化。洗后,图像与发射极耦合逻辑开发发光液(Biyuntian,中国)。

2.9。RNA的提取和测量mRNA表达的实时定量PCR (qPCR)

细胞总RNA提取试剂盒(美国表达载体)方法,和细胞RNA浓度测量spectrophotometrically。反转录成互补脱氧核糖核酸(豆类、日本)根据指令,执行和qPCR是由SYBR绿色(豆类、日本)方法。相关的实验数据进行了分析Ct值方法(2^−△△Ct相对定量比较分析方法),β肌动蛋白基因作为参考。目标引物序列如下表所示1。

2.10。检测细胞因子

酶联免疫吸附试验(ELISA、Baosai、中国)是用来确定炎症因素包括肿瘤坏死因子的水平α(肿瘤坏死因子-α)、白介素1β(il - 1β)和il - 6。

2.11。流式细胞术和TUNEL染色法检测细胞凋亡

膜联蛋白V (FITC) / propidium碘(PI)法检测细胞凋亡。细胞凋亡检测设备购买从北京Baosai生物技术有限公司有限公司具体来说,细胞被播种密度1×10⁵细胞/在6-well板块文化。治疗后,细胞被洗两次prechilled PBS和离心机和resuspended绑定缓冲。然后,5μL的膜联蛋白V-FITC解决方案添加和轻轻混合,之后,样本在黑暗中孵化15分钟。然后,5μLπ的解决办法是补充道。流式细胞术检测细胞凋亡(美国贝克曼)。TUNEL染色,根据TUNEL细胞治疗的指示(Biyuntian,中国),激光共聚焦显微镜下观察,每个字段是随机选择高倍显微镜下(×400)计算凋亡细胞的数量和总数量的细胞。

2.12。统计分析

统计分析了使用IBM SPSS统计21(美国)软件。所有结果都是用均值±标准差表示。T以及用于比较两组,单变量方差分析被用于多个组之间的比较。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。纯度测定和香菇多糖的成分分析

通过高效液相色谱法分析了香菇多糖和显示一个狭窄对称的峰的相对分子量约7037 Da,见图1。

香菇多糖的多糖含量为43.71%,用苯酚-硫酸和3,确定5-dinitrosalicylic酸比色方法。气相色谱分析表明,它是由各种单糖包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖,和它的摩尔比为9.28:3.57:1.92:1.03,分别如图2。

3.2。香菇多糖对HUVECs活动的影响

香菇多糖在最后添加到培养基的浓度0(对照组),0.04,0.4,0.8,1.2,2,4,10μM,细胞培养24小时。细胞的形态学变化,光学显微镜下观察。如图3与对照组相比,香菇多糖治疗组的形态浓度为0.04,0.4,0.8,1.2,2,4μ米没有显著变化,而细胞10μM组织萎缩、退化和细胞死亡的状态。

3.3。香菇多糖的浓度影响HUVECs活动

CCK-8试验是用来检测活动的变化HUVECs对待不同的香菇多糖浓度。如图4时,与对照组相比,香菇多糖的浓度为0.04,0.4,0.8,1.2,2μ米,在细胞生存能力没有显著差异( )。然而,当香菇多糖的浓度达到4μM细胞的生存能力明显低于对照组( ),这是进一步降低( )香菇多糖的浓度时10μm .因此,在后续的实验中,1.2和2μ香菇多糖是用来治疗细胞。

3.4。香菇多糖减少内质网应激反应与脓毒症HUVECs

探讨香菇多糖在脓毒症内皮细胞的保护作用是否与内质网压力,我们检查了mRNA和蛋白表达水平的内质网应激相关因素使用qPCR和免疫印迹方法,分别。qPCR结果(图5(一个)显示,与对照组相比,砍的表达,GRP78, IRE1α,ATF6脓毒症细胞显著增加( )。然而,当这些细胞被使用1.2和2μ香菇多糖,这些因素的表达水平显著降低( )。免疫印迹结果(图5 (b))符合qPCR结果( )。SIRT1减少内质网应激是一个关键的媒介。在这项研究中,信使rna(图5 (c)(图)和蛋白质5 (d))表达水平的SIRT1因此还测量了。结果表明,SIRT1的表达内皮细胞抑制( )在脓毒症。然而,当HUVECs使用1.2和2μ香菇多糖,SIRT1的抑制效应表达式被推翻( )。上述结果表明,香菇多糖可以抑制内质网应激反应,移植SIRT1表达HUVECs体外脓毒症模型。

3.5。香菇多糖抑制炎性细胞因子在脓毒症内皮细胞的生产

探讨香菇多糖对内皮细胞的保护机制,我们量化HUVECs细胞的炎性细胞因子释放。ELISA结果(图6(一)- - - - - -6 (c))表明,与对照组相比,清洁发展机制的激活效应较强的分泌TNF -α,il - 1β和炎性细胞因子il - 6 ( )。然而,预处理与1.2和2μM香菇多糖细胞显著抑制炎性细胞因子的分泌( )。此外,我们发现脓毒症状态可以增加炎症因子的表达上游中介p65-phosphorylated伊诺蛋白质,蛋白质和下游目标和香菇多糖预处理可以扭转这种改变(图6 (d))。

3.6。香菇多糖抑制内皮细胞凋亡败血症

研究香菇多糖对细胞凋亡的影响,膜联蛋白V-FITC / PI双染色法和TUNEL染色检测内皮细胞的凋亡在对照组,脓毒症组,脓毒症+ 1.2放大器μM组,脓毒症+ LNA 2μM组。图7(一)显示,与对照组相比,脓毒症组的凋亡率显著增加( ),这是1.2和2时显著降低μ香菇多糖的管理( )。图7 (b)表明,TUNEL结果与流式细胞术结果一致( )。这些结果表明,香菇多糖可以保护细胞免受sepsis-induced凋亡损伤。

4所示。讨论

内皮细胞激活和功能障碍是脓毒症的一个重要特性,可以在脓毒症的发展起着关键的作用。在这项研究中,脓毒症的HUVECs模型建立了体外研究香菇多糖的抑制作用在脓毒症引起的内皮细胞损伤。我们发现,低浓度的香菇多糖对HUVECs没有明显的毒性作用。然而,当香菇多糖的浓度超过2μM细胞生存能力显著降低,香菇多糖是剂量依赖性的细胞毒性。我们发现当HUVECs使用1.2和2μM香菇多糖然后刺激与脓毒症CdM,香菇多糖显著降低TNF -等炎症因子的表达α,il - 1β,il - 6在败血症,从而减少炎症反应。此外,我们发现治疗某种程度的香菇多糖可以抑制细胞的内质网应激;具体来说,我们发现ER的表达减少与压力相关的因素,包括切,GRP78, IRE1α,ATF6。的抑制作用可能是由于监管的香菇多糖SIRT1的表情。内质网应激是导致凋亡反应。这项研究还发现,香菇多糖可以抑制脓毒症细胞的凋亡反应,降低炎症因子上游监管中介p65蛋白的磷酸化(NF -κ伊诺B激活标记),下游目标。

脓毒症是一种促炎和抗炎共存的复杂的先生们。内质网应激中起着重要的作用。一些研究发现内质网应激是参与脓毒症的发生和发展15]。内质网应激可以诱导释放促炎因子通过激活下游信号通路的炎症反应16),和级联激活炎症进一步加剧程序性细胞死亡和组织损伤。香菇多糖是一种生物反应修饰符,减少氧化损伤的影响。目前,没有明显不良反应报道在人类摄入的香菇多糖(17]。先前的研究已经发现,香菇多糖能提高小鼠的免疫防御系统通过调节炎性细胞因子和趋化因子18]。此外,据报道,香菇多糖可以调节免疫应答通过改变肠道微生物群落的结构和组成(18]。张等人证明,香菇多糖可以保护心肌细胞,抑制细胞凋亡,减少低氧诱导细胞损伤主要通过调节microRNA-22 / SIRT1在新生大鼠心肌细胞(19]。然而,没有研究报道香菇多糖的作用和机制在脓毒症内皮细胞。

内质网应激信号通路密切相关的细胞炎症,和下游信号通路激活内质网压力会强烈刺激促炎细胞因子的生产(20.]。内质网应激的重要监管机构、切、GRP78, IRE1α,和ATF6都扮演一个角色在调节细胞凋亡(21]。因此,我们建立了一个模型,败血症内皮细胞体外测试内质网应激相关蛋白的表达的干预下香菇多糖,并表明,香菇多糖能降低内质网应激反应通过抑制内质网应激相关蛋白的表达如排骨、GRP78, IRE1α,ATF6。此外,作为下游内质网应激反应,炎症反应是一个重要的细胞反应过程。我们的研究发现,香菇多糖能显著降低炎症因素包括TNF -的生产α,il - 1β,和il - 6的分泌,从而减少炎症反应。此外,细胞凋亡是细胞的结果引起的脓毒症之一。在这项研究中,流式细胞术和TUNEL染色法也用于检测细胞凋亡,这是发现,香菇多糖可以显著抑制细胞凋亡,减少相关蛋白的表达。

因此,我们相信,香菇多糖能保护内皮细胞,减少损害发生脓毒症时的身体,和香菇多糖有望成为新的目标治疗内皮损伤引起的脓毒症。

数据可用性

使用的数据来支持该研究可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持的科技资金的怀安(没有。HAS2013008)。

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