文摘

药用植物在加蓬通常用于治疗多种疾病。这项研究的目的是确定有毒,抗菌,抗炎作用Antrocaryon klaineanum皮埃尔提取并描述其植物化学的化合物。青蛙的蝌蚪毒性评估(Phrynobatrachus非洲哈洛威尔)。微生物敏感性试验是由扩散方法,而最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)使用采用技术进行评估。抗炎活性测试通过蛋白质变性和膜稳定方法。色谱法和分子网络技术被用来描述化合物。杀伤力的测试表明,致死浓度(LC₅₀)增加从110.03±1.25,15.86±2.21μg / mL后24和96小时的曝光。在蝌蚪暴露于7.81μg / mL提取,第一个死亡率(12.5%)观察到的第五天。相对成熟的红细胞减少暴露于观察植物提取物。抗菌活性表明,正义与发展党F₂正义与发展党F₃F,正义与发展党₄分数(从水-乙醇粗提物)给其他提取物相比最大的抗菌活性。water-acetone,水和水-乙醇提取物显示良好的抑制变性。溶血试验表明提取物表现出良好的抗炎活动。植物化学的描述揭示了四个主要的化合物,包括monogallate表儿茶素和hydroxy-ergostadian。分子网络显示五个主要集群。我们的研究表明,答:klaineanum皮埃尔可能是一个有前途的天然产品的隔离与潜在生物活性分子。

1。介绍

传统医学常常是唯一负担得起的和容易获取的保健在贫穷国家,尤其是最贫穷的病人。据世界卫生组织(世卫组织),超过80%的非洲人经常使用传统和草药治疗各种条件(1]。植物研究可能导致可接受的治疗反应和低成本的定价在社会经济环境中,证明科学功效结合理想文化的可接受性。传统医学的科学验证应该为植物学期刊的发展。

考虑到植物性药物科学兴趣,近年来生物活性分子的治疗维持价格包含在植物物种。这导致了自然起源的新分子的创建。尽管大量的研究已经进行了植物,结果仍然不够,因为只有少数的植物系统研究了生物活性化合物(2]。

许多研究人员感兴趣的生物活性化合物分离出植物对病原微生物的消除,因为微生物的耐药性已经开发出针对合成抗生素。加蓬,由于其地理位置,拥有丰富多样的植被。

虽然分散,许多研究已经进行答:klaineanum,这显示了传统医学的重视。Antrocaryon klaineanum皮埃尔(家庭:Anacardiaceae)是广为人知的几个名字包括在加蓬,根据民族(Angokong(方),Osongongo (Mpongwe);mungongu-bogu (Bapunu), mungongu-bogu (Banzabi));在喀麦隆的共同的名字叫Onzabili [3,4]。这是一个非常大的树在加蓬是很常见的。复合的叶子。花是黄白色。水果被夷为平地,五角,很努力,均匀形状的石头。树皮粉的使用对肝脏疾病(3),它还对肝脏疾病。根治疗腹部和肝脏疾病(5]。在喀麦隆,其树皮用于传统医学治疗伤口,衣原体,女性不育(6]。植物化学的研究隔离Antrocarins f ergostane类固醇的类型和antiplasmodial活动是由Douanla [7]。其他作品有显示答:klaineanum有抗氧化和消炎作用[8,9]。

然而,研究毒性和其他生物的属性答:klaineanum茎叫是有限的。现在的环境下目标不仅研究毒性,抗菌,消炎,也描述的植物化学的成分答:klaineanum。

2。材料和方法

2.1。化学物质、试剂和媒体

有机溶剂(高效液相色谱级)获得Himedia,印度。氯化钠(Suvchem),食盐(氯化钠);氯化钾(氯化钾);氯化钙(CaCl₂);琼脂(Biokar);葡萄糖(Accumix);美国和其他化学物质从σ。使用的所有化学药品均为分析纯。

2.2。准备样品

的干树皮答:klaineanum(凭证号:ak01 - 2017)收集在Oyem(加蓬北部),2017年6月,由亨利Bourobou教授在国家植物标本(植物)。收割树皮干,碾碎,用于拔牙。

水-乙醇(30/70,v / v), water-acetone (30/70, v / v)和水(100%)提取干粉的准备答:klaineanum。每个样本(25克)和250毫升的提取溶剂。水提取煮60分钟;水-乙醇和water-acetone提取浸渍24 h。所有提取过滤、浓缩和冻干。获得的提取物被储存在4°C,直到他们被用于各种测试。

2.3。青蛙的蝌蚪水提取物(毒性Phrynobatrachus非洲哈洛威尔)

2.3.1。蝌蚪抽样

的决心Phrynobatrachus非洲哈洛韦尔的识别指南是由两栖动物非洲中部和南部的[10]。这个物种被抓获的蝌蚪在2021年6月在一条河附近的水域。在他们到达实验室,蝌蚪被放置在玻璃包含重组水盆地。研究蝌蚪选择有质量的2.00±1.00 g和在发展阶段对应的外观和进展的后肢芽。

2.3.2。致命和亚致死的测试

致命和亚致死的测试进行使用方法所描述的奥比昂et al。11]。

2.3.3。血液参数

后1、4、8、16天的曝光,蝌蚪是牺牲根据浓度(1.95;3.9;7.81μg / mL)的提取以收集所需的生物材料血液分析。蝌蚪是第一个麻醉和5μ我的血液通过心脏穿刺收集。诽谤是立即准备,其次是全新染色,然后一个光学显微镜下观察到的细胞(Motic数码显微镜)耦合的计算机使用Motic形象+ 2.0软件,最后照片。

(1)红细胞的相对比例。确定红细胞的相对比例,确定了500个细胞,分为三个亚组:成熟的红细胞,成红血球细胞,退化红细胞。成红血球细胞识别,根据描述由Szubartowska [12),圆形的形状,嗜碱性胞浆和突出的核,而退化红细胞被确定的皱纹和发育不良的外观。成熟红细胞的百分比,成红血球细胞,每500个计算细胞退化红细胞(总红细胞)/个人决定。

2.4。细菌病菌测试

细菌载体用于我们的研究包括六个参考菌株和四个临床菌株。

2.5。抗菌活性

扩散法是用于研究微生物的易感性。最低抑制浓度(麦克风)的原油提取和分数采用微量法测定在96孔酶标13]。杀菌抗菌药物被认为是那些MBC /麦克风1或2的比例和抑菌如果MBC /麦克风比4和16 (14]。

2.6。抗炎活动

2.6.1。Antiprotein变性试验

变性抑制原油提取和分数Antrocaryon klaineanum根据蛋白质变性进行抑制的方法中描述的参考Ngoua-Meye-Misso et al。15]。所使用的引用(双氯芬酸钠和扑热息痛)治疗在相同条件下原油提取。

2.6.2。膜稳定性测试

细胞膜稳定测试是评价人类红细胞(人力资源管理)溶血法。这种溶血引起了热一方面和蒸馏水(15]。

2.7。分离、鉴定和分子网络分析

闪光色谱是一种分离方法基于极性;在柱层析法的进程。由flash进行色谱分离Armen仪器现场液相色谱flash,根据梯度增加极性。32 g的干树皮water-alcohol提取提交flash在70 - 230目硅胶柱色谱法(400克),逐步由CH梯度洗脱₂Cl₂/甲醇混合物(100:0;98:2;95:5;90:10;80:20;0:100)。分数被收集并结合根据他们的薄层色谱(TLC)概要文件预镀硅胶60 F_254年盘子发达与正己烷/层与CH₂Cl₂/甲醇混合给组分数。主要生物活性的分数被选和分析通过高效液相色谱法结合质谱(HPLC / Q tof)。获得的化合物被确定比较的质谱的化合物在Reaxis DNP 2019注册库。

分子网络进行描述的Essono Mintsa et al。16]。

2.8。统计分析

数据被表示为平均值±标准偏差(SD)一式三份独立的实验和分析使用单向方差分析(方差分析)和学生的t以及使用Staplus构建软件。8.03 / Corev7.811 (x86_64)。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。水提取物的毒性Antrocaryon klaineanum皮埃尔

3.1.1。致命的测试

表中给出的分析的结果1表明,该信用证₅₀青蛙的蝌蚪暴露于水提取的答:klaineanum减少比例的日子。

这个信用证₅₀(APB)为110.03±1.25,63.55±4.02 (APB), 29.36±2.11 (APB), 15.86±2.21 (APB)μg / mL后24、48、72、和96小时的蝌蚪暴露。减少LC的价值₅₀导致越来越多的死亡率的进化。经过96小时的接触,没有蝌蚪在其他浓度范围为15.62,31.2,62.5,125,250,500,1000μg / mL当所有还活着在坦克只包含重组水和水提取物的最低浓度答:klaineanum。

3.1.2。死亡率在亚致死的测试

图1介绍了在亚致死的死亡率记录测试蝌蚪暴露于提取的答:klaineanum17天。

结果显示第一个死亡率(12.5%)的蝌蚪在第五天为7.81μ植物提取物的g / mL。第九,十三天,死亡率增加了25%和37.5%,分别。该物种暴露于3.9μg / mL提取展出的第九天死亡率(12.5%);正月十四日,死亡率增加了25%。只有在第十天的死亡率(12.5%)蝌蚪暴露在控制(双氯芬酸钠)和植物提取物(1.95μg / mL)被观察到。

3.1.3。描述和红细胞的相对比例

成红血球细胞的特点是他们的圆形形状,嗜碱性的细胞质,细胞核比成熟的红细胞。除了这些细胞(图2),退化红细胞也观察到一些人。

图3介绍了血液中红细胞的相对比例确定的蝌蚪暴露于提取的答:klaineanum皮埃尔和双氯芬酸钠为16天。在图3(一个),一个相对成熟的红细胞减少暴露于植物提取物和双氯芬酸钠从第一个研究是观察到的16天。第一天,成熟红细胞的比例是72年,78年,84年,和84%,相应浓度的7.81,3.9,1.96和1.96μ克/毫升(分别为标准),而16天,这些红细胞减少60,68年,74年,69%。

退化的比例在血液中红细胞的蝌蚪暴露在7.81,3.9和1.96μ克/毫升(图3 (c))比较相似,在接触的第一天(4 - 5%),暴露于双氯芬酸钠(4%)。另一方面,这些从5提高到8%比例保持相对稳定,直到第四天第八天,然后爬从6到16日的14%。

成红血球细胞中观察到(图3 (b)),我们注意比例较低(2 4%)的第一天暴露在不同浓度的植物。从第四到16天的7.81μ克/毫升的植物提取物,4成红血球细胞增加12%显然是观察。此外,3.9μg / mL的植物提取物显示了一个相对增加成红血球细胞(4 6%)从第四到16天的研究。尽管低浓度的比例不发生重大的变化,指出成红血球细胞的比例,在变性倾向于增加红细胞浓度高,作为时间的函数。

3.2。抗菌活性的Antrocaryon klaineanum提取

敏感性测试的结果的提取答:klaineanum给下面的直径的抑制细菌菌株(表2)。三种提取物的筛选显示都有抗菌活性。水、水-乙醇和water-acetone提取物给最大的抗菌活性淋病奈瑟氏菌属与抑制直径大于19毫米。water-acetone提取显示显著的抗菌活性在大多数菌株除外大肠杆菌105182国际马铃薯中心,伤寒沙门氏菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,鲍曼不动杆菌,肠杆菌属aerogenes,沙门氏菌种虫害对水-乙醇提取物和敏感蜡样芽胞杆菌对水提取液化沼气13569 BHI敏感。

结果还表明,分数具有最大的比粗提取物的抗菌活性。这些分数是活跃的对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。正义与发展党F₂正义与发展党F₃F,正义与发展党₄分数给了最大的抗菌活性菌株。正义与发展党F₁分数是活跃在所有菌株除进行测试英诺克李斯特菌液化沼气135668嗨,铜绿假单胞菌,沙门氏菌血清。

麦克风和CMBs的结果列在表中3。中等收入国家(0.625毫克/毫升)的水-乙醇提取物(Ak凌晨)是最低的,是正义与发展党F的中等收入国家₂和Ak F₃分数。

表4显示粗提取物的抗菌作用和分数答:klaineanum。水提物具有杀菌效果大肠杆菌105182国际马铃薯中心,英诺克李斯特菌液化沼气135668嗨,粪肠球菌103907国际马铃薯中心,蜡样芽胞杆菌液化沼气13569嗨,伤寒沙门氏菌菌株,具有抑菌作用金黄色葡萄球菌写明ATCC 25293嗨。水-乙醇,water-acetone提取,正义与发展党F₂分数有杀菌操作在所有菌株进行了研究。正义与发展党F₁正义与发展党F₃F,正义与发展党₄分数表现出杀菌对多数细菌的影响。

3.3。抗炎活性Antrocaryon klaineanum提取

结果体外抗炎活性的提取物答:klaineanum皮埃尔在图进行了总结4。

在每一列中,分配的值不同的字母字母(一个,b,c)表明显著不同的收益率( )。

这项研究表明,水(IC₅₀= 80.20±9.65μg / mL),水-乙醇(IC₅₀= 110.27±10.02μg / mL), water-acetone提取(IC₅₀= 86.22±9.22μg / mL)相比没有任何明显的区别标准(IC₅₀= 97.20±2.37μg / mL)。低渗的溶液引起的溶血试验表明,三种提取研究提出好活动与IC₅₀从62.26±5.82,72.85±8.00μ克/毫升。对于燥热引起溶血,所有提取物表现出很好的antihemolytic活动集成电路₅₀年代从70.59±5.35,75.25±8.56μ克/毫升。这些结果没有显著差异与标准(双氯芬酸钠)。

3.4。色谱分析和分子网络MS / MSAntrocaryon klaineanum皮埃尔粗提物

结果在图5现在一组色谱和质谱的粗提物答:klaineanum。电喷雾质谱质量的研究显示4主要山峰米/z[M + H]⁺= 301.144;质米/z[M + H]⁺= 353.245;质米/z[M + H]⁺= 417.202;电喷雾质谱,米/z[M + H]⁺C = 413.265对应各自的分子公式₁₈H_20.O₄C₂₄H₃₂O₂C₂₇H₂₈O₄C₂₆H₃₆O₄。dereplication后多数化合物数据库(Reaxis和字典的自然产品),化合物3(电喷雾质谱质量米/z[M + H]⁺= 353.245)对应于monogallate类型表儿茶素化合物4(电喷雾质谱质量米/z[M + H]⁺= 413.256)对应于7α-Hydroxy-4, 24 (28) -ergostadien-3-one(表5)。其他化合物在文献中没有显示匹配。

粗提物的分子网络的结果答:klaineanum显示,根据结构相似化合物分组(图和五个主要集群出现6):A组提出了12个节点有非常接近的分子质量,B组包括6节点,两个物体的(米/z298.145和298.146)与Methoxyformonetin相对应。集群C(4个节点),D(3)节点E(3)节点集合的化合物不被我们可用的数据库。

4所示。讨论

这项工作的目的是研究毒性;建立抗菌和抗炎活动,和描述的植物化学答:klaineanum提取物。植物提取物接触蛙蝌蚪的结果显示低毒性药品相比(双氯芬酸钠)。研究还表明,毒性是进步的。这个结果证实与奥比昂et al。11],作者规定剂量的死亡率相关的接触更增加使用青蛙蝌蚪随时间延长。细胞涂片上观察到相当密切对应的描述豹蛙约旦(20.]。

观察血液参数显示,暴露的蝌蚪的提取答:klaineanum引起轻度贫血。观察到的影响是减少数量的成熟红细胞在血液中红细胞的减少长度和红细胞的舍入。一些研究提出了类似的结果,执行实验血液学的影响蟾蜍以regularis(21]。这些作者推测,这些影响可能是与等离子体体积的增加;减少血铜浓度,扮演着一个重要的角色在红细胞生成;抑制血红蛋白合成;和缺铁22]。红细胞的基本功能是确保组织氧的供应,进行,由于血红蛋白。因为这个主要作用归因于血红蛋白,贫血的诊断才成立时减少血红蛋白浓度低于正常的下限。

研究表明,随着时间的推移,在成红血球细胞的比例略有增加,退化红细胞是显而易见的。年轻红细胞(成红血球细胞)的出现反映了红细胞人口的一个更新的过程。同时,退化红细胞血红细胞溶菌作用的特征。在这种情况下,我们可以在存在再生类型hyperhemolysis所致贫血的红细胞导致红血球生成的刺激。

总提取物的抗菌活性和分数的树皮中提取的答:klaineanum在本研究证明。结果表明,每个样品测试有抑制作用的大多数菌株的生长测试。提交给我们的研究中,所有的细菌淋病奈瑟氏菌属显示更多的提取检测灵敏度。正义与发展党F₁正义与发展党F₂F,正义与发展党₃分数被证明是更积极的在一些细菌相比其他提取。这些禁忌可能是由于分离方法进行了净化的植物分数不同的色谱方法(14]。Ethnopharmacological研究已经表明的树皮答:klaineanum用于治疗伤寒和其他liver-related疾病(8]。本研究证明了传统的使用答:klaineanum对抗某些感染的细菌来源。细菌的敏感性蜡样芽胞杆菌液化沼气13569嗨,志贺氏杆菌dysenteria5451国际马铃薯中心,淋病奈瑟氏菌属提取可以直接对的治疗特性的进一步研究答:klaineanum对淋病、腹泻和其他类型的感染。在某种程度上,这种敏感性可能是由于能力的植物提取物复杂的细胞外和可溶性蛋白质与氨基酸导致失活和/或功能丧失。

抗炎活性答:klaineanum是由蛋白质变性测试和评估膜稳定。蛋白质变性是一个过程的蛋白质失去三级和二级结构由应用程序的外部压力或化合物,如强酸、碱,或热,大多数蛋白质变性时失去他们的生物功能(23]。蛋白质变性是炎症的证据确凿的原因19]。结果在抑制蛋白质变性表明之间没有显著差异的植物提取物和引用(双氯芬酸钠)。类似的结果,表现出良好的抑制活性蛋白质变性的药用植物中发现了几项研究[15,24]。

稳定血红细胞膜的作为一个方法来研究体外抗炎活动因为红血球膜类似于溶酶体膜。这种方法证实的抗炎活性答:klaineanum提取物。结果表明,在不同浓度的提取,红血球膜防止裂解和热诱导的低渗的解决方案。研究表明,某些植物的家庭答:klaineanum行为层面的许多机制如抗炎活动的监管。NF -的激活κ在炎症反应中发挥着关键作用。这些提取物被证实能够减少炎症介质水平的生产如cyclooxygenase-2或TNF -α(25]。我们工作的结果证实的传统使用答:klaineanum在传统医学用于治疗各种疾病(8]。

色谱和光谱答:klaineanum表明,几个主要化合物的字典不属于天然产品和其他数据库咨询除了化合物与质量米/z[M + H]⁺等于417.190和353.245。这些化合物的属于多酚(Epi)儿茶素- (Epi)儿茶素monogallate类型(19和ergostane-type类固醇的家庭7]。多酚具有至少一个苯环的存在,至少有一个羟基与其他功能。他们最为人所知的抗氧化效果。多酚影响膜透性,从而诱导细胞内成分的释放到外部环境。此外,他们还干扰抑制NADH氧化呼吸链,核酸和蛋白质的合成,和某些酶的活性26]。

此外,我们还使用粗提物进行分析分子网络(MN)方法由国民生产总值网站(https://gnps.ucsd.edu)[27]。所有获得HRESIMS / MS谱通过MZmine2预处理软件后,基于功能的分子网络工作流(28]。探索峰地区网络节点的相对贡献表明化合物集群基于结构相似性。集群的存在的分子网络的粗提物答:klaineanum展览一些化合物,可以更好的学习。

5。结论

这项工作能评估毒性、生物(抗菌和抗炎)活动,水的化学特征提取的树皮答:klaineanum。从这项研究中,植物提取物接触蛙蝌蚪相比表现出低毒性药物(双氯芬酸钠)。一些提取物表现出杀菌效果。然而,这种敏感性存在剂量依赖的相关性,根据细菌和提取不同。此外,提取具有良好的抗菌性能显示特殊抗炎活动,双氯芬酸钠相比明显很高。植物化学的特征提取的化合物如monogallate透露类型多酚和ergostane-type类固醇。本研究证明某些用途的传统医学。

缩写

正义与发展党:	Antrocaryon klaineanum
CM:	%校正死亡率
DNP:	字典的天然产品
EP:	胚胎阶段
高效液相色谱法:	高效液相色谱法
IPHAMETRA:	德研究所Pharmacopee医学院学习Traditionennelle
M2:	%治疗人群的死亡率
M1:	%控制人口的死亡率
MBC:	最低bactericial浓度
麦克风:	最低抑制浓度
女士:	质谱计
注册:	回归的外部鳃
Rt:	保留时间
薄层色谱:	薄层色谱法。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者非常感谢壳牌加蓬的金融支持设备USTM生物化学研究实验室(SG / CIS /长效磺胺/ SA / SA格兰特没有77)。