文摘

耐多药细菌引起了全球关注,无法对抗致命的传染病。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和铜绿假单胞菌是最常见的耐药细菌导致医院感染。本研究调查进行的协同抗菌作用的乙酸乙酯分数Vernonia amygdalinaDelile叶子(EAFVA)对临床分离株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和四环素铜绿假单胞菌。采用微量是用于建立最低抑制浓度(MIC)。一个棋盘试验进行的交互效应。溶菌作用,staphyloxanthin,聚集活性试验也被调查。EAFVA表现出与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性铜绿假单胞菌MIC值为125μ克/毫升。四环素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性铜绿假单胞菌MIC值为15.62和31.25μ分别g / mL。EAFVA之间的交互和四环素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和协同效应铜绿假单胞菌有部分抑制浓度指数(FICI) 0.375和0.31,分别。EAFVA和四环素诱导耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的变更和铜绿假单胞菌,导致细胞死亡。此外,EAFVA也抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的群体感应系统,铜绿假单胞菌。结果显示,EAFVA增强四环素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性铜绿假单胞菌。这种提取物还在测试细菌群体感应系统的管理。

1。介绍

抗生素耐药性的问题是全球知名。耐多药细菌使致命的传染性疾病无法治疗,引起全球关注1,2]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是目前最常见的耐药细菌,尤其是在医院(3]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐多种抗生素,包括β-lactams,获得其基因造成的,过表达射流泵和产生β内酰胺酶酶(4]。对于革兰氏阴性细菌,铜绿假单胞菌已经成为一个重要的问题是致命的细菌耐药性,由于其目标酶的变化5]。

几个步骤已经到位,对抗细菌的耐药性。因此,新的抗菌药物具有独特的目标和机制的迫切需要采取行动。昂贵和耗时的测试新分子在人类以确保他们是安全的和有效的治疗疾病没有培养电阻(6]。结合典型的抗生素和代理增强抗菌性能被建议作为一种可能的解决这些问题(7]。另一方面,它可能难以发现新的抗菌药物,化学物质用于临床,新的耐药机制将开发。结合两个或两个以上的抗菌素,增加他们对耐药感染的效率是一个独特的技术对抗阻力。

大量的植物性化合物已被确认为新型抗菌的重要来源。几项研究已经确定了化学成分,包括黄酮类化合物、脂肪酸、倍半萜烯内酯,和甾体皂苷8]。此外,植物性化合物还具有各种生物活性药理作用,如抗炎、抗疟疾、抗肿瘤,典型药物,抗氧化9- - - - - -12]。

的Vernonia amygdalinaDelile物种是菊科家庭的一员13),原产于西非。尽管如此,诉amygdalina叶提取物表现出一些药理作用,包括抗菌活性(14]。然而,这种植物提取物对四环素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性的影响铜绿假单胞菌是未知的。因此,本研究旨在考察的乙酸乙酯部分的协同效应诉amygdalina(EAFVA)提取和四环素在选定的临床分离株。此外,结合对膜细胞毒性因子的影响进行了研究[15]。

2。材料和方法

2.1。化学物质和媒体

英国四环素是来自Sigma-Aldrich磷酸缓冲盐(PBS),无水硫酸钠,和结晶紫从Sigma-Aldrich,英国,脑心浸液是来自嗨,正欲获得和琼脂,迪金森& Company,富兰克林湖,新泽西,美国。

2.2。菌株

临床分离株从MERO获得基金会(海洋教育和研究机构基金会在巴厘岛,印度尼西亚)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

2.3。制备乙酸乙酯的一部分Vernonia AmygdalinaDelile叶子

500克的诉amygdalinaDelile。回流的方法提取和1:10绝对乙醇脱水和粉叶五个小时。我们收集滤液,消失在一个较低的压力产生粘性提取,最后在水浴(干16,17]。使用液液萃取过程中,乙醇提取分离与乙酸乙酯(18,19]。

2.4。确定最低抑制浓度

为了确定麦克风,采用微量测试。细菌悬液的出现,随后添加到96孔酶标包含稀释2倍诉amygdalinaDelile。细菌悬液制备Mc和调整到0.5。Farland相当于浊度1×10⁸CFU /毫升,然后用生理盐水稀释生成1×10⁶CFU /毫升(20.]。乙酸乙酯部分(EAFVA)添加到树叶和培养24小时37°C (21]。以为麦克风是最低浓度的增长可能会停止(22]。

2.5。棋盘试验

在x设在96孔板的两倍脑心浸液(BHI)添加到EAFVA。在y设在,创建一种抗生素稀释前一个的两倍。之后,每个被悬挂的细菌的浓度约1×10⁶CFU /毫升,混合是在37°C的环境一天。计算部分抑制浓度指数(FICI)允许我们调查EAFVA之间的交互和抗生素。FICI计算公式如下:

这个研究发现EAFVA和抗生素是如何影响测试细菌(23]。FICI计算收益率协同FICI小于0.5时。另一方面,这是添加剂如果FICI值在0.5到1的范围,冷漠如果FICI值是1到4,或敌对的如果FICI值是大于424]。

2.6。损失260 nm吸收材料

适度的修改,防紫外线材料完成的释放,如前所报道。隔夜的文化研究在生理盐水清洗和resuspended细菌。达成的最后数大约5×10⁷CFU /毫升,各种物质的浓度接种细胞在125μ15.62 g / mL EAFVA,μ克/毫升的四环素,组合(15.62μg / mL EAFVA + 3.9μg / mL四环素)。

控制细胞治疗。每个样本在37°C孵化24小时,与生理盐水稀释(1:100)和0.2过滤μ孔隙大小膜。分光光度计测量紫外可见260纳米光学密度。这次考试是三次(25]。

2.7。溶菌作用的活动

培养细菌悬浮液是一天晚上老BHI媒体。通过这种方法检测溶菌的活动被报道。125年μ31.25 g / mL EAFVA,μ(7.8 g / mL四环素和组合μg / mL EAFVA + 7.8μg / mL四环素)被添加到细胞。最终的细胞浓度5×10⁷CFU /毫升,而控制细胞没有处理测试浓度作为一个消极的控制。然后,他们孵化和测量吸光度在OD 620海里,显示吸光度下降。计算屈服值的百分比是吸光度与620 nm的OD 24小时。没有错误的测试进行了三次(25]。

2.8。Staphyloxanthin化验

EAFVA停止生产能力的金黄色色素和staphyloxanthin被研究了。细菌培养在乳糖新生隔夜汤(磅)中。然后细菌悬液稀释的比例是1:100新磅媒体,其中已经包含EAFVA和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。这是在37°C孵化24小时。EAFVA和消极的控制没有治疗离心机15分钟10.000转/分的速度(26]。

2.9。大量的活性测定

包含24毫米CaCl琼脂板₂准备大量的琼脂板(M8)含0.1%酪蛋白氨基酸,葡萄糖0.5%,EAFVA。20毫升的现成的M8媒体投入每个培养皿中。在室温下静置,直到媒体凝固前使用的一致性。1毫升细菌悬液培养在一夜之间被然后旋转6000转3分钟。再次,细胞颗粒旋转下来而悬浮在PBS 1毫升、丢弃上层清液。这种清洗技术进行了两次。此外,细菌被安置在M8介质的中心和孵化在室温下10分钟(27]。

2.10。植物化学的成分分析与LC-HRMS EAFVA

EAFVA植物化学的分析使用TSQ Exactive(热)(LSIH,意大利Brawijaya)的流速梯度的方式40 L / min用海波西尔金aQ 50列1毫米的1.9 m;分析时间为70分钟。流动相的流速表中可以看到1。的化合物发现分析结果进行了分析使用mzCloud软件(15,28]。

2.11。数据分析

给出的数据与均值标准差(SD)和分析使用SPSS v。22个软件。所有测试都重复一式三份。

3所示。结果

3.1。最低抑制浓度(MIC)

如表所示2,EAFVA抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌与125年的MIC值μ克/毫升。积极的控制抑制四环素耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌MIC值为15.62和31.25μ分别g / mL。这个结果表明EAFVA有温和的抗菌效应对选定的临床分离株(见表3)。

3.2。棋盘试验

棋盘试验被用来确定EAFVA和四环素影响测试细菌。如表所示4,EAFVA(15.62的结合μ和四环素(3.9 g / mL)μ0.375 g / mL)产生了部分抑制浓度指数(FICI)协同作用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。另一方面,EAFVA增强四环素的抗菌活性与选定的临床分离株具有协同效应。发现EAFVA四环素的浓度降低,抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。相比之下,EAFVA(7.8的协同效应的组合μ与四环素(7.8 g / mL)μg / mL)铜绿假单胞菌计算是0.31。这表明EAFVA可以减少的浓度铜绿假单胞菌(请参见图16倍1isobologram结果)。

3.3。损失260 nm吸收材料

有泄漏的细胞(核酸组件)在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(图2),铜绿假单胞菌(图3)EAFVA-treated上层清液。泄漏仅在细胞EAFVA和抗生素治疗显示,与未经处理的吸光度在260 nm -控制没有治疗。然而,在EAFVA和四环素抗生素、核酸之间的泄漏或释放在260 nm耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和增加铜绿假单胞菌。

3.4。溶菌作用的活动

基于溶菌作用的结果测试,结晶紫的百分比值吸收与四环素治疗抗生素浓度为15.62μg / mL -控制显示几乎类似的值(数字4和5)。然而,比消极的控制和单一治疗EAFVA +四环素,测试EAFVA治疗有较高比例的结晶紫的吸收。更好的结果所示的组合EAFVA耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和四环素抗生素铜绿假单胞菌同样,显示了更好的结果对这两个的组合测试微生物。

3.5。Staphyloxanthin化验

staphyloxanthin测试表明,可以看到它的生产和观察,出现了金黄色的颜色的形成。不同浓度的样品处理EAFVA,有降低生产staphyloxanthin(图6)。在图6 (e),这是一种超小型电子管与消极的控制细胞,可以看到金黄色的颜色。金黄色的颜色形成的超小型电子管测试浓度最低,为15.625μ克/毫升(图6 (d))。相比之下,EAFVA测试浓度是125μ克/毫升(图6(一)),不显示超小型电子管的金黄色的颜色的形成,同样与其他浓度的治疗。staphyloxanthin测试结果显示,生产可能会看到检查由于它金黄色的颜色。在不同剂量,staphyloxanthin生产减少细胞内颗粒隔绝EAFVA-treated样品(图6)。超小型电子管的消极控制(图6 (e)可以注意到),一个金黄色的色调。在测试浓度最低的15.625μ克/毫升(图6 (d)),形成一个金黄色的颜色在超小型电子管。相比之下,125年的治疗与EAFVA浓度μ克/毫升(图6(一))都没有显示的形成一个金黄色的颜色与其他浓度超小型电子管和治疗(见图6)。

3.6。大量的活性测定

基于分群的结果能动性,有细菌细胞生长在培养皿的中心。在中包含EAFVA,几乎没有增长包含细菌细胞的中间媒介。

3.7。植物化学的成分分析与LC-HRMS EAFVA

LC-HRMS EAFVA显示15成分的植物化学的分析(表5)。

4所示。讨论

最低有效浓度的一种抗菌化合物可以阻止细菌生长在一定条件下和一定的时间(29日]。结果表明,在125年的浓度μg / mL EAFVA,有抗菌活性,明显能够停止增长的两个测试(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和细菌铜绿假单胞菌)。基于其生物活性,EAFVA酚分子,尤其是黄酮类化合物组。由于这组化合物,可以有抗菌活性。类黄酮是一类低分子量多酚的化学物质(30.]。在另一个调查、植物提取物含有丰富的黄酮类化合物和纯黄酮进行抑制病原菌的生长。几种机制已报告,如造成细胞复合物与额外的附着力和发展微生物抑制(31日]。对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和EAFVA非常有效铜绿假单胞菌(25]。

结合两种抗菌素被描述为一个潜在的技术来避免抗菌素耐药性的问题(AMR)。棋盘试验测试来评估产生的交互,即提取和商业之间的协同交互抗生素(32]。在该测试中,FICI决心证明EAFVA之间的交互测试样本和四环素抗生素。因此,在组合,麦克风EAFVA和四环素的下降。

除此之外,它显示了一个协同效应,没有对立EAFVA和四环素之间。四环素的作品将细菌核糖体,与30年代亚基16 s核糖体结合的目标。四环素阻碍翻译sterically干扰RNA转移在伸长(33]。如果结合EAFVA,显示含有类黄酮成分如毛地黄黄酮、槲皮素、芹菜甙元,和其他物质,它有一个更重大的影响比四环素。四环素抗生素和EAFVA实现协同合作,通过增加联合治疗的有效性。在该机制中,有可能EAFVA四环素有不同的场景,现场行动的目标是不同的。次生代谢物在EAFVA提取、类黄酮等,具有一种机制,可以影响细胞膜的渗透性。每当有破坏细胞膜的渗透性,它允许四环素进入细胞,并最终占领它的工作地点。以前的研究报告协同效应在乳酸链球菌肽和肉桂醛。相比之下,乳酸链球菌肽仅温和的抗菌活性。在组合管理时,它提供了更好的抗菌活性,结合被认为是成功的(34]。

为了确定EAFVA和四环素之间的协同作用机制,本研究还集中在蛋白质膜细胞的泄漏和变更。众所周知,在波长260 nm,细菌浮在表面的测量,以吸光度的吸收和吸收增加;这表明细菌细胞的发生泄漏或损失的核酸物质(35]。EAFVA之间的组合和四环素也进行了研究。与一个单一的治疗相比,EAFVA和抗生素的联合都表明吸光度的增加在波长260纳米。结果证实使用溶菌作用的活动。EAFVA和四环素耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和改变铜绿假单胞菌通过增加结晶紫膜细胞吸收。根据先前的研究,它已被证明在之前报道,治疗微生物感染的天然产物结合合成抗生素混合可以提高治疗和预防微生物耐药性(36]。结合桉树camaldulensis精油与多粘菌素B显示抗生素对难治性的协同效应不动杆菌burmanni隔离(37]。另一项研究显示antiacne功效结合两个精油与维甲酸(38]。

此外,α山竹果和lawsone甲基醚也增强氨苄青霉素对几种病原体包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌效果通过扰乱膜细胞通透性(39]。在另一项研究中,精油提取c·欧被用来抑制病原体大肠杆菌DH5a和铜绿假单胞菌PAOI。这项研究的结果是类似于那些获得使用抗生素粘菌素(40]。

克服抗菌素耐药性的另一个策略是用电阻恢复代理检测antivirulence化合物。它允许使用现有的药物不会引起强烈的选择压力,加速抗殖民地成长(41]。作为一种毒性因子,金黄色葡萄球菌,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,可以产生staphyloxanthin色素(42]。staphyloxanthin色素区分殖民地的金黄色葡萄球菌从其他葡萄球菌和革兰氏阳性细菌。C30黄金keratinoid嵌入在一个独特的是一系列的代谢反应膜在这种病原体称为staphyloxanthin [43]。另一项研究显示减少staphyloxanthin色素合成L-ascorbyl 2, 6-dipalmitate治疗更严重的存活率在全血分析灵敏度测试对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细胞(44,45]。

许多类型的细菌在实验室显示群集,多个单元的运动与鞭毛在固体表面(46]。生物膜生产、殖民的植物内部和外部表面,和致病性或保护行动相伴的植物细菌可以显著影响生物群体的能力(47]。

黄酮类化合物的抗菌效应越来越被认可。在传统医学,天然植物提取物在体外检测抗菌活性(48]。例如,黄酮类化合物有抗菌作用的分离及其结构研究之前,例如,芹黄素(49,50),槲皮素(51,52),和其他国家的总和。先前的研究的组件,如芹黄素,槲皮素,毛地黄黄酮,apigetrin, curom芳香树脂,和其他人,按照植物化学的成分分析的结果与LC-HRMS EAFVA在这项研究中。在78μg / mL,毛地黄黄酮成分与抗菌行动有关Trueperella化脓性链球菌(53]。

5。结论

的抗菌作用与四环素EFVA临床分离株(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌)揭示了抗菌机制和活动的协同效应。

缩写

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌:	耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
EAFVA:	乙酸乙酯部分Vernonia amygdalinaDelile叶子
PBS:	磷酸缓冲盐
嗨:	脑心浸液
MERO:	海洋教育和研究机构
麦克风:	最低抑制浓度
CFU / mL:	集落形成单位每毫升
FICI:	部分抑制浓度指数
膜集成电路:	部分抑制浓度
OD:	光密度
磅:	乳糖误事。

数据可用性

本研究中使用的数据集可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

概念是由U.H.和科学博士;方法是由A.W.S.提供;软件提供的神经网络。验证是由T。H和自动焊接;正式的分析是由神经网络。调查是由U.H.;资源提供科学博士;数据管理是由神经网络。最初的草案是由科学博士做准备、神经网络和A.W.S.;T。H and U.H. reviewed and edited the manuscript; visualization was done by A.W.S.; supervision was done by U.H.; project administration was done by D.S.; and funding acquisition was done by U.H. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

确认

这项研究由世界一流大学研究拨款意大利来华朝贡先后(作品13301号/ UN.5.1。R / PPM / 2021, 06年2021年9月)。