文摘

隔离的方法,免疫球蛋白M (IgM)在印度主要的鲤鱼Cirrhinus mrigal(mrigal)多克隆抗体血清生产是本研究中描述。纯化免疫球蛋白(IgM)分离的血清mrigal (Cirrhinus mrigal)牛血清白蛋白(BSA) cl亲和柱纯化方法,以及IgM被用来产生一个多克隆兔anti-mrigal IgM抗血清。IgM准备是受雇于mrigal血清免疫球蛋白的表征。减少mrigal IgM钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)是由两个亚基,兼容重型和轻型链。一个重链约90 kDa和轻链30 kDa的变种被发现。nonreduced IgM的主要形式有一个兆瓦的大约900 kDa,表明基于估计分子量四聚物的结构,相对蛋白质含量和anti-mrigal IgM抗血清的反应性。抗血清的特异性和反应性特征通过酶联immuno-sorbent测定(ELISA)和免疫印迹的方法。免疫球蛋白的结构和特征信息的鱼类在健康管理至关重要。这里描述的研究调查的可能性使用血清学技术评估与anti-mrigal IgM抗体的反应性抗血清。

1。介绍

鱼类免疫球蛋白与哺乳动物的免疫球蛋白共享各种特征;然而,一些差异存在;这些部分出现从共同祖先进化的过程,部分反映了鱼适应改变生活环境的影响。免疫球蛋白的鱼类免疫系统包含五种类型:IgM (1],IgD [2- - - - - -4],IgZ [5],IgT [6),本7]。主要的鱼类血清免疫球蛋白是四聚物的IgM-like分子(7)组成的八轻和八重链。硬骨鱼鱼IgM与哺乳动物IgM共享一些结构和功能特征;因此,我们理解各种硬骨鱼鱼的能力产生异构混合物的IgM聚合物,单体(2,8,9],halfmer子单元(10]。

Wllson et al。11)报道严重腹部浮肿梅加拉亚邦的鲤鱼。寄生虫病myxosporidiosis和混合感染saprolegniasis myxosporidiosis [12在IMC占据。大量出现的疾病的流行答:hydrophila已报告。(13非传染性疾病,如白内障,尾部畸形(脊柱前弯症),胆石病,出血的眼睛,气泡病也被报道IMC。细致的知识分子结构的血清IgM抗体重链和量化的反应在鲤科的一个经济在我国水产养殖的重要组成部分。这将是有利的为进一步免疫研究领域的水文化,从而其应用领域的免疫学和炎症。多数的鲫鱼的免疫球蛋白熊四聚物的结构。

本研究提出的方法处理和净化的印度大鲤鱼Cirrhinus mrigal anti-mrigal IgM抗血清免疫球蛋白及其反应性。抗血清的特异性和活性的酶联immuno-sorbent测定(ELISA)和免疫印迹的方法。

2。方法

2.1。隔离的鱼血清

五mrigal鱼重约500克,保持在25米(2]水泥水箱淡水渔场的渔业学院Mangaluru,腹腔内注射(ip)每1毫克牛血清白蛋白(BSA、默克、印度)在250年解散μl(磷酸缓冲盐(PBS, pH值7.4)用同等体积的弗氏完全佐剂乳化(FCA)。同样剂量的BSA用同等体积的弗氏不完全佐剂乳化(FIA)有15到22天后。两个mrigal鱼注射PBS (pH值7.4)仅是维护控制未接受免疫接种的血清的集合。在第30天,鱼与10 ppm苯坐卡因麻醉3分钟紧随其后的血液通过刺穿尾静脉,是允许在室温下凝块1 h和存储在一夜之间在4°C。血清使离心后收集在6000转10分钟和集中存储在−20°C为进一步使用2]。

2.2。净化的血清

净化的血清进行亲和柱层析法根据Gopalakrishnan et al。13),使用5毫升BSA-CL琼脂糖柱(印度班加罗尔Genei)。列平衡通过5列体积的PBS (pH值7.2)。两毫升的血清免疫鱼,与同等体积的混合PBS (pH值7.2),是透过一个0.45μm注射器过滤器(MDI、印度)并加载到列。血清获准与BSA 45分钟。飘散的血清蛋白洗了10列卷洗脱缓冲(0.1 M柠檬酸缓冲,pH值3.0)。大约10分数为0.55毫升每个收集和中和0.45毫升的0.5米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH11)。每个分数测定吸光度在280 nm spectrophotometrically。筛选了样本汇集和接受透析4°C对PBS使用低分子量(12 kDa切断)透析膜(σ,美国)。包含蔗糖的透析膜转移到一个托盘集中2毫升,和集中存储IgM−20°C为进一步使用。

2.3。表征纯化IgM

纯化IgM被nonreducing sds - page特点,简要10μl 4 x本地页面的示例缓冲区(10% SDS, 0.5 Tris-HCl, pH值6.8),甘油0.8毫升,0.01%溴酚蓝(W / V)添加到30μ纯化IgM的l。纯化IgM以及分子量标记(美国σ)和本地人类IgM(美国σ)加载到包含3%的丙烯酰胺和0.5%的琼脂糖凝胶进行电泳25马到染料前到达底部的凝胶与coomassie蓝色紧张(10%乙酸,40%甲醇、0.1% coomassie蓝色)8 h和使退色使脱色溶液(10%乙酸,40%甲醇)的分子量IgM估计。IgM的进一步描述是由10% sds - page Laemmli [14]。大约10μl 4 x的样品缓冲(10% SDS, 2 -β含巯基的乙醇。0.4毫升,0.5 tris-HCl, pH值6.8),甘油0.8毫升,0.01%溴酚蓝(W / V)添加到30μl的纯化IgM在100°C和煮5分钟。相比较而言,原油的血清免疫鱼准备以同样的方式。样品连同分子量标记(美国σ)被加载到4.5%叠加凝胶电泳和接受在分离胶10%到30 mA染料达到凝胶底部的前面。这种凝胶是沾coomassie蓝、重型和轻型链的分子量Ig测定(2]。

2.4。多克隆抗体的生产

多克隆免疫抗体ELISA方法用于mrigal抗体的检测。十周老瑞士白化小鼠免疫纯化mrigal IgM (50 (ip)μg在250年μl PBS)混合1:1的葬礼。类似第二剂量(ip)给出了FIA的纯化IgM(1: 1)第15天。27日当天,升压剂10μg纯化IgM在0.05毫升PBS是静脉注射。血液被撤回在第30天从尾部静脉使用皮下注射器和收集的血液被允许凝结在室温下1 h。后,血清血凝块通过离心法在6000 rpm一段10分钟,这是用作多克隆抗体。

2.5。酶联免疫吸附测定(ELISA)

间接ELISA分析特定BSA抗体活动执行immunoaffinity色谱分数pf汇集mrigal血清所描述的Towbin et al。15]。微量滴定板(Nunc、丹麦)涂在一夜之间有1% BSA在碳酸盐缓冲(15毫米Na2有限公司3,35毫米NaHCO3,pH值9.6)其次是(1)阻塞在PBS 5%脱脂奶粉0.1%渐变20 (PBS /渐变),(2)孵化与翻倍稀释(1:100:12400)纯化搞笑、免疫血清和未接受免疫接种的血清在PBS /渐变两组,(3)孵化与多克隆老鼠anti-mrigal IgM抗血清(1:1000在PBS /渐变),(4)孵化与辣根过氧化物酶共轭兔子anti-mouse Ig抗血清(印度班加罗尔Genei)(1: 1000在PBS /渐变),和(5)孵化与三甲H 10分钟2O2(印度班加罗尔Genei)在PBS /渐变(1:20)。反应停了1 m H2所以4和颜色开发是观察到490海里(OD490)测量与ELISA读者(美国Bio-Tek)。孵化项目都是在室温下1 h。之间的所有步骤(1)和(5)是由三个洗PBS /渐变。

2.6。西方墨点法

纯化mrigal IgM的可溶性样品缓冲减少的条件下。在10%聚丙烯酰胺凝胶分离后16),蛋白质转移到硝酸纤维素(14]。干燥后,硝基条被孵化与多克隆抗体稀释1:10000。反应被发现使用兔子anti-mouse用辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白抗体。

2.7。基于多克隆抗体(帕布)Immunodot Mrigal IgM的研究试验反应

一个immunodot试验是由点缀在硝化纤维(北卡罗来纳州)论文BSA切成2厘米2大小。纯化IgM积极控制和点缀在纸上气单胞菌属hydrophila细菌和弧菌虚线为消极的控制,和三个这样的点膜分别准备检测抗体的亲和纯化IgM样本,天然免疫和未接受免疫接种的血清。免费网站在硝化纤维膜被封锁在PBS 05%脱脂奶粉2小时,洗03次PBS (pH值7.4),其中一个膜被一夜之间1毫升的纯化IgM和浓度为0.1 mg / ml,与原油和其他免疫鱼血清稀释10倍与PBS(1毫升)。一夜之间第三膜治疗与未接受免疫接种的鱼血清稀释10倍PBS(1毫升)。与PBS渐变20洗涤后,兔子anti-mouse免疫球蛋白辣根过氧化物酶(印度班加罗尔精灵)3% BSA在PBS(1毫升,1:1000稀释)添加和孵化90分钟。与PBS渐变20三次洗涤后,1毫升的衬底(0.3毫克的4 chloro-1-naphthol 10μl乙醇,01μl 30%的H2O2,1毫升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.6))补充道,和清晰的紫色在硝化纤维纸上点发展被认为是积极的反应。

3所示。结果

鱼血清得到与牛血清白蛋白(BSA),免疫后获得的血清被亲和柱层析法纯化方法筛选了分数和以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在减少和nonreducing条件(数据1和2)。减少条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示,免疫球蛋白含有重型和轻型链分子量为90和30 kDa,分别nonreducing条件下凝胶3%显示单个蛋白质的分子量900 kDa。该方法进一步用于生产多克隆抗体anti-mrigal小鼠血清,因此,多克隆抗体mrigal抗血清。用ELISA的敏感性和效价测定。抗体效价是1:12400。在纯化mrigal IgM抗体的敏感性是重要而与原油mrigal抗血清,未接受免疫接种的负控制血清没有反应。在点免疫污点分析同时,mrigal多克隆抗体反应显著的纯mrigal IgM相比原油mrigal抗血清,和未接受免疫接种的消极控制血清没有反应。同样,在免疫印迹分析mrigal IgM,观察两个独特的乐队显示重和轻链,分子量90 kDa重链和轻链30 kD,对纯mrigal IgM反应明显,原油mrigal抗血清,和未接受免疫接种的消极控制血清没有反应(数字3- - - - - -5)。


图1
sds - page(本地)不减少条件下(3%)。巷1纯化IgM。人类IgM巷2。巷3分子标记。

图2
SDS页面减少条件下。巷1:分子标记。巷2:纯化IgM。巷3:原油mrigal血清。

图3
免疫印迹分析。巷1:分子标记。巷2:亲和纯化mrigal IgM。

图4
帕布建立ELISA反应研究。

图5
Immunodot化验。1。免疫球蛋白IgM。2。血清。3。Unimmunize。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们试图净化免疫球蛋白的mrigal BSA-linked亲和纯化单个步骤的列,这是适合获得足够数量的免疫球蛋白(Ig);此外,同一列被发现是有用的净化不止一次没有降低抗体的结合能力适应协议和净化技术,建立免疫和免疫球蛋白(Ig)平均收益率为1.25毫克/毫升的血清。搞笑水平在不同鱼类免疫后不同的范围内0.25 - -23.5毫克/毫升(11]。

免疫点测试清楚地显示的特定反应affinity-purified IgM抗体和原油与BSA的抗血清。在NC膜处理affinity-purified IgM(图5)和膜处理原油免疫血清,BSA斑点明显染色表明原油抗血清和纯化IgM特定的免疫反应性。膜处理未接受免疫接种的mrigal血清不发展与BSA的紫色的蓝点。纯化的积极控制导IgM还开发了紫色的颜色在所有的化验。消极的控制(答:hydrophila和弧菌sp。菌苗)没有任何颜色的反应。

在目前的研究中,只有一种IgM-like分子亲和纯化筛选了。在早期的研究Cirrhinus mrigal(mrigal),Catla Catla(Catla),Lobeo rohita(伦敦)nonreducing sds - page,不同人群的搞笑分子如四聚物的和二聚的ano-monomeric已报告形式,但我们观察到一群蛋白质nonreducing sds - page表明蛋白质是纯的,在其原生形式筛选了。的分子量c . mrigalIgM nonreducing sds - page 900 kDa,类似于分子量IgM的鱼类如大菱(835 kDa非洲鲶鱼840 kDa鳕鱼851 kDa)。

sds - page分析显示两个明确乐队的多肽分子量90和30 kDa视为纯化IgM的重型和轻型链分子,分别。血清免疫原油也显示相应的重型和轻型链带。重型和轻型链的分子量可以比较与其他种类的鱼喜欢罗非鱼(90和30 kDa),鳕鱼(811和27.5 kDa), Trematomus bernacchii(83.5和27.5 kDa),大比目鱼(78 27 kDa),和鲤鱼(70和25 kDa) (16]。

本文描述的尝试和策略用来获取特定的多克隆抗体对mrigal开发策略来获得特定的多克隆抗血清抗体mrigal抗血清,并开发一个敏感、快速、和具体ELISA雇佣在疾病管理的常规筛查。在目前的研究中,BSA抗体抗原选择提高mrigal因为抗体纯化的亲和力列的可访问性。BSA作为免疫原已经阐明抗体在不同鱼类的生产许多调查人员(16- - - - - -18]。

筛选了分数的抗血清的免疫球蛋白进行分析之后发现极其免疫血清的免疫原性评估的滴定。ELISA发达被证明是非常敏感的效价1:12400。与纯mrigal IgM抗体反应更强烈而不是原油mrigal血清ELISA, immmunodot和免疫印迹结果已确认13,19]。

数据可用性

用来支持研究的数据都包含在本文。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

生物技术,研究部分由部门政府印度,新德里。