文摘
结核分枝杆菌开发了广泛抵抗许多种抗结核菌药物用于治疗肺结核。胞内积累的不足积极半个允许选择性耐药突变的分枝杆菌的生存和相应的促进微生物耐药性的发展。新发现的化合物的作用机理和理化性质,促进细胞内积累,或与其他种抗结核菌的药物化合物协同作用,有可能减少和防止进一步的耐药性。为此,抗细菌的活动,在联合治疗的作用机制,合作研究的一系列多环胺衍生品。化合物的选择是基于根的存在与可能的抗细菌活性,将笨重的亲脂性的载体,促进细胞内积累,和此前表现出生物活性,可能支持抑制射流泵的活动。最抗了最低抑制浓度(MIC99年)9.6μ米对结核分枝杆菌H37Rv。基因毒性,抑制细胞色素公元前1呼吸系统复杂的被所有化合物的作用机制。抑制细胞壁的合成被认定为可能的作用机制为两个最活跃的化合物(14和15)。化合物5和6证明协同活动与已知Rv1258c射流泵衬底、壮观霉素,指出可能的射流泵抑制。本系列,侧链的性质,而不是多环载体的类型,似乎发挥决定作用的抗细菌活性和细胞毒性的化合物。相反,多环载体的性质,尤其是azapentacycloundecane笼,似乎促进协同活动。结果指出azapentacycloundecane载体结合的可能性,促进抗细菌活性的侧链发展双重作用的分子治疗结核分枝杆菌。
1。介绍
的进步发展抵抗各种化疗药物用于传染病的管理提出了全球公共卫生的一个严重的问题。结核病再度成为最有关传染病之一。臭名昭著的复杂的分枝杆菌细胞壁的结构和丰富的射流泵(EPs)结核分枝杆菌限制大量的胞内积累和抗细菌效果抗菌类成功地利用对标准的细菌(1- - - - - -4]。治疗和控制结核病疫情的进一步复杂化的发展耐多药(MDR)和广泛耐药结核病(XDR)病例不断增加。目前的抗结核治疗方案从而组成一个组合代理,随着耐药性的发展,各种一线人员,不仅降低病人疗效和可接受性,而且还需要增加治疗时间和毒性。
根据他们的行动的机制(恐鸟),可用种抗结核菌的药物可以大致分为3类:那些破坏细胞壁完整性(如异烟肼、乙胺丁醇、乙硫异烟胺和环丝氨酸,以及实验1,2-ethylenediamine, SQ109 [5]);那些限制能源可供细胞过程(例如,吡嗪酰胺和bedaquiline [6]);和化合物,抑制正常细胞功能通过抑制或破坏基本大分子的生物合成,代数余子式和代谢物(如利福霉素,氟喹诺酮类、氨基糖苷类和oxazolidinone类抗生素和para-aminosalicylic酸(7- - - - - -9])。这些抗细菌药物敏感性降低通常源于自发突变在分枝杆菌的基因组与选择性生存受次优的接触,或减少细胞内积累,活跃(半个10,11]。每股收益,特别是已被证明在不足中发挥作用积累分枝杆菌细胞内的药物(12]。根据特定的药物的作用机制是克服,电阻可能是特定于一个特定的分子或,更令人担忧的是,导致对各种药物的敏感性降低目标特定的细胞过程(如细胞壁合成)或过表达射流泵作为底物。
策略,提高抗细菌分枝杆菌细胞内化合物的积累可能会增加特定化合物的功效,但也会减少基因编码的电阻由于subinhibitory化疗曝光(13]。方法可以促进细胞内积累的化疗药物可能包括增加细胞壁通透性(14),便利化的被动运输的药物进入细胞,改变分子的化学结构减少倾向流出(15),以及直接外排泵抑制通过利用EP抑制剂(16]。
作为一个研究项目的一部分,旨在评估调制耐药性的可能性和增加活跃的根的积累结核分枝杆菌笼,一系列的多环化合物选择大学的西开普省医药学院的化合物库,用于评估抗细菌和射流泵抑制活动结核分枝杆菌。多环笼衍生品包括在这项研究证明,在别人,l型钙通道和N-methyl-D-Aspartate (NMDA)抑制特性17)和功能亲脂性的支架有可能提高选择的屏障通透性结构。随后的研究表明多环胺衍生品(特别是化合物的能力3,5,11,图1)调节抗疟药物的耐药性18- - - - - -20.]。标准化合物的选择包括在这项研究是与可能的抗细菌活性,因此根的存在,将笨重的亲脂性的载体,促进复合分枝杆菌细胞内的积累,以及生物效应可能促进耐药性逆转活动。拥有潜在的离子通道的抑制特性,这可能直接或间接地抑制射流泵功效[21,22),在化合物的选择是一个重要的因素。
在这里,我们报告的抗细菌活动的一系列选择的化合物和初步调查可能的恐鸟的活跃分子。我们还描述了一个可能的调制Rv1258c射流泵与壮观霉素活动的协同活动,一个已知的衬底的分枝杆菌Rv1258c射流泵(15]。
2。结果与讨论
研究化合物选择分为三类基于多环笼支架的性质。图1显示了oxapentacycloundecane类(化合物1,2,4,8),azapentacycloundecane类(化合物3,5,6,7和金刚烷类化合物9到16)。合成的化合物1- - - - - -15(图1)是由我们组之前的出版物,详细描述如表示1。复合16购买从Sigma-Aldrich®。
2.1。抗细菌的活动
最低抑制浓度(MIC99年(表)的化合物1)测定在营养和营养物汤采用方法利用一个媒体类型结核分枝杆菌H37Rv记者应变表达绿色荧光蛋白(29日- - - - - -31日]。化合物3、5、7、11、14,15显示抗细菌活性与麦克风99年值从9.6μ82.2 MµM(表1);这些被选中作进一步分析,确定可能的恐鸟。
有趣的是,在麦克风的决心,化合物5显示活动GAST-Fe基本培养基,包括甘油,丙氨酸,盐、铁、Tween80,但不是标准麦德布鲁克7 h9 albumin-dextrose-catalase (ADC)的媒介。这种差异可能指向绑定的复合白蛋白(22恐鸟),过氧化氢酶的干扰,或恐鸟,影响芽孢杆菌的能力使用甘油作为主要碳源(32]。相比之下,化合物的活动7和14在标准7 h9-adc更明显,而化合物3、11,15显示类似的媒体类型的效能。
一个有趣的观察与化合物的结构与观察到的抗细菌活性的差异麦克风的结构类似的化合物1,一个oxapentacycloundecane苄胺衍生物,azapentacycloundecane苄胺衍生物,化合物5。结果指向抗细菌活性与叔胺的存在和/或多环aza-cage自由羟基。化合物11,14,15含金刚烷一半显示更好的活动相比,oxa - aza-PCU-based化合物。这些也是唯一3化合物包含1,3-diamine链接器与1,2-diamine存在于化合物3,6,和7。因此,这个活动可以增加是由于金刚烷的存在或1,3-diamine链接器。类似的活动(图2)的化合物2(oxa-PCU)和10(金刚烷衍生物),然而,建议增加活动可能与1,3-diamine链接器而不是金刚烷的存在的一部分。
2.2。细胞毒性分析
细胞毒性的化合物是评估使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞线(表1)。标记细胞毒性化合物之间观察到的差异3和11是值得注意的。金刚烷的一部分可能导致细胞毒性增加,但是,可以推导出类似的集成电路50值的化合物2和10看来,这个分子特性不能单独负责增加了复合细胞毒性观察11。propane-1 3-diamine链接器,然而,似乎有助于细胞毒性化合物11,14,15所有展示更高的细胞毒性,即使大多数化合物含有类似ethane-1相比,2-diamine一半。1,3-diamine链接器不幸似乎也扮演一个角色在抗细菌活性化合物展示整体MIC值最低。
2.3。初步的作用机制的决心
探索潜在的恐鸟化合物,许多生物活性记者化验被利用。评估可能的化合物对呼吸的影响,比较测定MIC值相应的野生型化合物结核分枝杆菌H37Rv与细胞色素(i)双相障碍氧化酶突变(∆不足上的消息∆KO)和(2)上的消息KO/ qcrBA317T应变确定可能QcrB抑制(33,34]。QcrB抑制剂有望表现出增强的力量(∆低麦克风)上的消息KO∆但很少活动上的消息KO/ qcrBA317T应变携带额外Ala317Thr点突变在QcrB [35]。观察无显著改变麦克风的任何化合物对突变株,强烈建议所有可能的目标QcrB [34,36]。
接下来,一个实时荧光检测(37)是用于调查细胞壁破坏作为一个潜在的作用机制。对分枝杆菌阿拉伯半乳聚糖化合物与抑制性影响,霉菌酸,脂肪酸合成已被证明导致的upregulationiniBAC操纵子(38]。然而,这种操纵子是不被其他细胞壁压力调节,例如,过氧化氢,热量,酸性条件下,或抗生素不直接抑制细胞壁的合成(如氨基糖甙类、氟喹诺酮类原料药或利福平)(38]。化合物14和15是PiniB -勒克斯积极和显示早期(第一天)和持续发光信号,类似于发光配置文件以前观察乙胺丁醇(37]。图2提供了一个示例的生物荧光观察后期和间接细胞壁破坏(复合11(复合),早期细胞壁损害15),积极控制SQ109(也证明早期的细胞壁破坏)。比较background-corrected RLU数据提出了热地图,从白色(最低),橙色(最大)的函数最大RLU发光控制记录。
金刚烷的存在和胺链接器在SQ109官能团(39),它是决定使用SQ109作为控制复合PiniB -勒克斯化验。SQ109还演示了早期的发光,但信号只是持续大约5天(37),而在当前的研究中,持续观察信号的化合物14和15在14天的试验。化合物3,7,11与延迟有关生物荧光的生产。这表明,细胞壁内稳态的影响可能推迟或复合的二次影响polypharmacologic活动。这些数据表明,化合物14和15直接目标细胞壁生物合成,虽然精确的目标仍然是未知的。
最后,我们研究是否使用P化合物的基因毒性recA -勒克斯生物荧光记者(37]。RecA分枝杆菌DNA损伤反应的关键调节器和接触后引起化合物直接基因毒性(即。,改变或破坏核酸)或抑制DNA代谢(复制和/或修复)。将细菌荧光素酶luxCABE磁带的转录控制下recA启动子导致增加生物发光后启动子感应响应DNA损伤(37]。没有化合物评价这项研究产生积极的发光信号在整个试验期间,消除DNA损伤潜在的恐鸟。
2.4。合作评估
它最初假定从本系列化合物可能作为分枝杆菌外排泵抑制剂(epi)。EPI作为初始屏幕,以确定可能的活动,合作进行了化验使用已知的Rv1258c射流泵衬底、壮观霉素,作为一个锚复合。壮观霉素是一种aminocyclitol抗生素与一个独特的结合位点在30年代细菌核糖体亚基它提供选择性的毒性和副作用。不幸的是,主要是由于广泛的细菌射流泵(特别是Rv1258c流出结核分枝杆菌)、壮观霉素缺乏显著的抗菌活性(15,40,41]。奇霉素的活动大幅增加条件下,射流泵的活动受到抑制(42屏幕)使它成为有用的代理可能使用合作分析射流泵抑制活动。所有化合物除了化合物14和15,排除由于固有的抗细菌活性,筛选与壮观霉素使用棋盘试验合作。为此,连续稀释的测试化合物和壮观霉素被添加到一个结核分枝杆菌文化7 h9媒体y- - -x设在一个96孔板。细菌生长测定和数据分析所描述(43]。化合物5和6与壮观霉素显示合作的证据,但没有观察到显著改变麦克风与其他化合物。抑制细菌生长的化合物1,5,6结合壮观霉素图所示3。奇霉素的浓度作为麦克风的一小部分(即。,2 = 2×麦克风,1 =麦克风,麦克风0.5 =一半等)给出x设在,加上各种分数的麦克风测试化合物由图例的颜色表示。细菌抑制衡量spectinomycin-only井在不同倍数的壮观霉素麦克风被描述为图上的暗红色(上)的传说。如果壮观霉素结合测试化合物起增效剂作用,抑制细菌的比例仍然很高尽管壮观霉素浓度降低。因此,复合1(A)提供的目的与结构相似的化合物5没有证据显示合作,但细菌抑制在低浓度的壮观霉素结合化合物5(B)和6(C)协同活动。
(一)
(b)
(c)
这两个化合物5和6aza-cage衍生品。再次,活动之间的差异结构类似的化合物1和5(图1)是显著的。类似被认为与这两个化合物的抗细菌活性,叔氮和自由羟基aza-cage可能参与观察的协同活动。化合物3和7相反,似乎增加壮观霉素浓度更高的麦克风(数据没有显示)。这个观察可能指向减少吸收的壮观霉素,但需要进一步调查确定的机制可能的对抗。
3所示。结论
在这项研究中,我们探索了可能的抗细菌活性,作用机理和协同活动的一系列多环胺衍生品。化合物选择基于pharmacophoric根的存在和可能的抗细菌活性,前所述电阻逆转活动,以及结构特性和生物活性的存在会增加积极的积累和半个coadministered种抗结核菌的药物结核分枝杆菌。最活跃的化合物(15)展示了一个麦克风99年9.6μ米对结核分枝杆菌H37Rv并将作为提高选择性的抗细菌活性先导化合物。
抑制的公元前1呼吸系统复杂的与农业部和DNA的功能以及基因毒性系列被排除在外。细胞壁破坏,然而,被确认为可能的作用机制的化合物。特别是,化合物14和15被证明导致早期和持续的细胞壁破坏类似乙胺丁醇的时尚。化合物3,7,11显示推迟细胞壁破坏这可能表明细胞壁应力作为干扰其他细胞的次生效应系统或延迟影响细胞壁的完整性。
化合物5和6显示和壮观霉素协同活动的证据,因此可能的外排泵(特别是Rv1258c)抑制。
azapentacycloundecane笼似乎发挥作用的抗营养不良媒体的活动以及协调与壮观霉素的能力是显而易见的从结构相似的化合物之间的巨大差异1和5在各自的化验。aza-cage在抗细菌的作用,因此协同活动需要进一步探索。尽管本系列化合物的不充分显示在单一药物选择性毒性在体外分析,选择从这个系列化合物的能力作为chemosensitizers,联合治疗可以减少所需的麦克风。从这个初步研究结果有助于我们理解结构的活动关系,可能的协同活动,本系列和毒性的化合物,并将与正在进行的合作一起使用化验通知修改。额外的工作探索抗细菌活性的结构活性关系(与细胞毒性),重要的是,调查有关可能的阻力反转活动在我们实验室正在进行中。
4所示。材料和方法
4.1。最低抑制浓度测定
所有化验进行III级生物安全认证工具。结核分枝杆菌pMSp12:绿色荧光蛋白(29日,44)是成长为一个光学密度(OD) 0.6 - -0.7,和化验进行使用GAST-Fe媒体(45,46)或7 h9媒体补充白蛋白葡萄糖10%过氧化氢酶(ADC) [45,46]。10毫米股票的解决方案的测试化合物在DMSO连续稀释2倍,和盘子被建立如前所述[47]。利福平2 xmic被用作控制最低增长。相对荧光测量和用于计算麦克风之前报道(22,48]。
4.2。细胞毒性分析
减少3 - 4,5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT)在活细胞的存在是用来评估细胞生存能力49]。20毫克/毫升股票解决方案测试化合物的10% DMSO在完全培养基连续稀释10倍稀释获得6浓度。细胞暴露于各自的测试化合物44小时后MTT添加在37°C和细胞培养4小时。板块在540海里使用分光光度计分析井含有未经处理的细胞和生长介质仅用于确定100%生存生存和0%,分别。吐根碱作为积极的控制和检测进行了一式三份。细胞生存能力不是妥协在DMSO溶液的浓度最高的细胞暴露(数据未显示)。集成电路50值获得完整的剂量反应曲线,使用非线性剂量反应曲线拟合分析通过GraphPad v棱镜。4软件。
4.3。呼吸记者分析
结核分枝杆菌H37RvΔcydKO和结核分枝杆菌H37RvΔcydKO / QcrBA317T [34,35)是利用如上所述确定的最低抑制浓度(部分4.1)。
4.4。勒克斯化验
修改生物荧光(勒克斯)记者分析被用来研究细胞壁的破坏作用和基因毒性机制(37]。10毫升文化有关结核分枝杆菌H37Rv应变(PiniB-LUX确定细胞壁破坏或PrecA-LUX确定DNA损伤)是发展到一个光密度(OD600年)的±0.4。应变文化被稀释1:10前接种试验。双重的连续稀释的测试化合物和分析控制药物在平底96 -微量滴定板。相应的稀释结核分枝杆菌记者文化是添加到每个最终成交量为100μl /。SQ109和左氧氟沙星作为积极的和消极的控制,分别在PiniB勒克斯化验,而左氧氟沙星和乙胺丁醇被利用为积极的和消极的控制,分别在PrecA勒克斯化验。
原始发光数据(相对发光单元)是使用一个SpecraMax i3x板读者(分子设备公司,1311年新奥尔良开车,桑尼维尔加州94089)。数据修正背景发光使用Softmax®Pro 6软件(版本6.5.1序列号。1278552768867612530)、分子设备公司,1311年新奥尔良开车,94089年加州森尼维尔市。数据转换为2-colour二维热地图使用Microsoft®Excel®Mac 2011版本14.6.5(160527),最新更新14.6.5安装。
4.5。经分析化验
可能的药物相互作用的各种测试化合物和壮观霉素研究利用稍微修改标准的二维(2 d)棋盘试验(42]。连续稀释药物沿x设在和y分别设在96 -的微量滴定板,在起始浓度100倍最终浓度。如前所述(执行的化验是42),结果报告为一个百分比增长抑制在不同药物浓度组合。
数据可用性
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的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢南非国家研究基金会提供金融支持这个项目(批准号117887)。SLS收到了来自南非的资金研究联席计划部门的科技和南非国家研究基金会(NRF)(奖。UID 86539)。这个项目也支持通过战略健康创新伙伴关系(船)单位的南非医学研究理事会基金收到南非科学创新。内容是完全的责任作者,并不一定代表NRF的官方观点。