没食子酸的影响和泰国烹饪精油的抗菌活性乳酸链球菌肽变形链球菌

文摘

变形链球菌是一个著名的口腔病原体通常与正常牙有关问题和威胁生命的感染。一个细菌素乳酸链球菌肽和植物的化合物包括没食子酸(GA)和泰国烹饪精油(EOs)据报道,活动对口腔病原体。然而,他们的协同互动变异链球菌没有被探索。本研究的目的主要是调查反变异链球菌属性和antibiofilm乳酸链球菌肽的形成、GA和五个EOs用肉汤采用的方法。此外,形态变化、杀灭率和抗菌合作是由扫描电子显微镜(SEM), time-kill试验,分别和棋盘法。结果表明,泰国柠檬叶(KLL)油、柠檬草(LG)油和GA显示强大的反变异链球菌活性和抑制生物膜的形成与细胞膜上的可能机制有针对性。此外,KLL油显示反- s。变形链球菌合作与GA、LG油和洗必泰与部分抑制浓度(FIC)索引≤0.5。有趣的是,GA显示高潜力增强反变异链球菌乳酸链球菌肽的活性降低的最小抑制浓度(麦克风)抑菌方式至少8倍。这些结果表明,GA和KLL石油可能作为辅助治疗以及乳酸链球菌肽和洗必泰来控制变异链球菌感染。

1。介绍

一个革兰氏阳性链球菌细菌变异链球菌,,是一个重要的口腔病原体可引起人类常见的龋齿和威胁生命的传染病,如感染性心内膜炎进入血液循环后(1]。为了防止牙齿问题和由此产生的并发症,整个人类寿命(口腔卫生是必要的2,3]。产生的毒性行列式变异链球菌是生龋齿的生物膜或牙科斑块的形成,而保护固着细菌的抗菌化合物。因此,潜在的策略应对变异链球菌生物膜发展的抑制和消灭浮游细胞(4]。虽然机械清洗是一种有效的方法去除生龋齿的物种和生物膜,抗菌药物的化学已经实益添加到许多口腔医疗产品类似的目的(5]。然而,长期使用化学药剂会导致牙齿变色和生理障碍微生物群(6,7]。此外,临床基本不值得内杀菌或抗菌药物治疗常见的口腔疾病由于耐多药细菌的增加,目前全球卫生问题之一(8]。因此,natural-derived化合物包括多肽细菌素、酚类化合物、草药EOs成为细菌控制代理的偏好,因为他们的安全观念和历史使用情况。

近年来,多肽细菌素,即乳酸链球菌肽,是有吸引力的新一代抗生素9]。乳酸链球菌肽安全乳酸菌产生的物种Lactococcus lactis有效地抑制食源性致病菌生长地生长细胞和孢子肉毒梭状芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌(10,11]。此外,这种细菌素不会改变食品的感官性质(12]。因此乳酸链球菌肽是美国食品和药物管理局批准在48个国家,成为广泛使用的天然防腐剂在各种食品行业10]。尽管乳酸链球菌肽不是视为共同anticaries代理,利用乳酸链球菌肽抑制口腔病原体的报道仍然是有限的(11]。为例子,乳酸链球菌肽已经证明对各种生龋齿的细菌包括变形和潜在影响non-mutans链球菌,乳酸菌sp。放线菌sp。13- - - - - -15]。Sangcharoen et al。16)报道,乳酸链球菌肽的抗菌活动可以增强弱抗坏血酸和柠檬酸等有机酸。

遗传算法是一种酚酸在几个常见植物(17,18]。具有品种的促进健康的好处,如抗氧化剂,抗炎,以及抗癌,抗菌效果(17,18]。先前的报道表明,遗传算法具有很强的抗菌活动可能取代合成抗菌药物对食品和生物医学产品。除此之外,它是记录有抗菌效力变异链球菌(19,20.]。因此,遗传算法成为一个有趣的代理用于调查增强乳酸链球菌肽的研究活动。除了使用弱有机酸,乳酸链球菌肽的抗菌功效可能加剧的植物EOs (21),这被认为是抗菌药物在传统医学(22]。著名的泰国美食精油从指根(Boesenbergia pandurate(Roxb)。Schltr),泰国柠檬(柑橘hystrix直流),圣罗勒(罗勒属tenuifloruml .),柠檬草(Cymbopogon citratus(直流)。Stapf。)已报告含有抗菌性特别是对医学上重要的微生物(23- - - - - -26]。然而,研究关于抗菌这些EOs和乳酸链球菌肽之间的合作变异链球菌是稀缺的。因此,本研究的目的主要是确定反变异链球菌乳酸链球菌肽和antibiofilm活动,GA和泰国烹饪EOs 5。杀率和细菌细胞形态也进行了调查抗菌特点和可能的机制,分别。此外,这些化合物对之间的协同互动变异链球菌研究基于一个棋盘采用试验建立FIC指数。

2。材料和方法

2.1。测试材料

五个EOs包括手指根油(FR。40017 - 2019年),圣罗勒油(HB。40024 - 2019年),泰国柠檬油(KL。40020 - 2019年),泰国柠檬叶油(KLL。40011 - 2019年),和柠檬草油(LG、很多。40003 - 2019年)请提供Thai-China风味和芳香剂工业公司,有限的。GA(纯度98.8%)购买从EMD微孔(书、瑞士)。洗必泰digluconate 20% (w / v),乳酸链球菌肽l . lactis(1030000 IU / g),饱和烷烃标准(C7-C40)从Sigma-Aldrich购买(美国密苏里州)。其他化学物质和溶剂均为分析纯,获得当地分销商。

2.2。EOs分析条件

五个EOs的组成进行了分析使用气相色谱/质谱(GC / ms - 6890 n,安捷伦,美国)配备HP-5毛细管柱(30米,0.25毫米;J&W科学、福尔松的,CA)。氦作为载气以恒定流量的1毫升/分钟。烤箱温度最初50°C 3分钟,然后增加到200°C的速度10°C /分钟3分钟。最后,烤箱温度增加到260°C的速度15°C /分钟20分钟。喷油器温度为250°C。样例注射用1:10 0的分流比。组分的保留指数(RI)测定参照饱和烷烃(C7-C40)。此外,识别组件被碎片匹配的计算机评估模式与威利7 n光谱库。

2.3。菌株和文化条件

变异链球菌写明ATCC 25175年从美国购买类型文化收藏。三个临床变异链球菌TLJ1-1、TLJ1-2 TLJ1-3,缺乏collagen-binding adhesin cnm编码的基因(27),请得到协会的支持。口腔微生物学系教授博士Jinthana Lapirattanakul,牙科学院,Mahidol大学,泰国曼谷。这个项目是Mahidol大学的伦理委员会批准(MU-DT / PY-IRB2021 / PY022)。菌株保存在脑心浸液的混合物(BHI;美国Difco)肉汤和20% w / v甘油在-80°C到使用。在实验中,变异链球菌分别生长在BHI琼脂37°C 48 h。积极发展文化的孤立的细菌菌落琼脂板被转移到试管BHI肉汤和孵化24小时37°C。培养液的浊度调整spectrophotometrically在600 nm获得光学密度(OD) 0.2(大约10⁶-10年⁷CFU /毫升)使用前的实验。

2.4。抗菌感受性测试

中等收入国家的测试化合物由汤采用方法(28]。测试准备的化合物溶解在渐变的BHI介质80 (0.04% v / v)和绝对乙醇(0.03% v / v)。然后,测试化合物的串行两倍稀释BHI肉汤拌在一个1:1比例(v / v)在96 -无菌的微量滴定板来获取最终的浓度0.006 - -0.80% EOs v / v, 0.06 - -8.00毫克/毫升GA,乳酸链球菌肽31.25 -4000国际单位/毫升,0.008 - -1.00毫克/毫升洗必泰。20μL准备剂的添加到BHI汤补充测试化合物获得100μL最终体积在每个。微量滴定板被孵化的37°C在有氧条件下24小时。正面和负面的控制在每一个测试集。消极的控制包括测试样本而不是生物,和一个积极的控制包括生物而不是测试样本。洗必泰作为参考控制。80 v / v渐变的混合0.04%和0.03% v / v绝对乙醇BHI介质也测试控制溶剂的影响。麦克风被定义为没有细菌生长的最低浓度由肉眼决定。增长端点井包含测试样本与观察到的增长控制井。

建立最低杀菌浓度(MBC), 20μL(每个培养基从井没有明显增长,到80年μL无菌的BHI汤96 -孔板。在37°C孵化后24 h, MBC决心的产生没有细菌生长的最低浓度由肉眼观察到。每个样本一式三份测试在不同的实验。

EOs的增强效应、GA和洗必泰尼生素的抗菌活性也汤采用评估的方法。乳酸链球菌肽的麦克风和MBC值测定结合0.5×麦克风测试的化合物(或0.4% v / v的EOs EOs的MIC值高于0.8%时v / v)。

2.5。Antibiofilm形成分析

测试化合物在生物膜形成的影响被确定为描述Wongsariya et al。29日与修改)。准备测试化合物混合BHI汤补充1% w / v蔗糖用两倍稀释法获得的最终浓度0.006 - -0.80%为每个EO v / v, 0.06 - -8.00毫克/毫升GA,乳酸链球菌肽31.25 -4000国际单位/毫升,0.008 - -1.00毫克/毫升洗必泰。20μL准备剂的添加到每个。孵化后 37°C 24 h,媒介吸气;生物膜是然后用100洗两次μL(无菌生理盐水(0.9% w / v氯化钠)。附着生物膜固定绝对乙醇(100μL) 15分钟,沾0.1% w / v结晶紫,持续15分钟。洗后样品与200年μL(三次蒸馏水,染料绑定到生物膜被增加100可溶性μL二甲亚砜。提取的染料测定微量滴定板的读者(Varioskan勒克斯,热费希尔科学)在590 nm的吸光度。

实验进行了一式三份和生物膜抑制的百分比计算 在哪里被定义为未经处理的细胞的平均吸光度,然后呢被定义为的平均吸光度细胞治疗。生物膜的抑制曲线是由策划的抑制百分比浓度。

2.6。Time-Kill化验

测试化合物的杀菌活性测定的time-kill分析古et al。30.与修改)。细菌悬液(240μL,大约10⁶CFU /毫升)添加到BHI肉汤(960μL)包含测试样本1,2,4×麦克风。孵化后37°C,示例(20μL)收集在不同的时间间隔(0、2、4、8、12、24 h)和连续稀释10倍准备无菌生理盐水。此后,20μ每个稀释的L是放在BHI琼脂板在37°C和孵化24 - 48 h。细菌数进行可行性和记录CFU /毫升的数量。在每个试验中,一个细菌生长控制包括,由80 v / v渐变0.04%和0.03%乙醇v / v绝对没有的测试样品。洗必泰也被用作防腐剂的引用。所有的实验进行了一式三份和实验结果表示为平均值±标准偏差(SD)。Time-kill曲线被策划建立日志₁₀与时间CFU /毫升。杀菌活动被定义为≥3日志₁₀倍减少幸存者的数量在每个时间点与最初的培养液。

2.7。扫描电镜

的准备培养液变异链球菌写明ATCC 25175年孵化的测试化合物浓度4×麦克风。细菌生长控制进行的80 v / v渐变0.04%和0.03%乙醇v / v绝对没有测试样品和细菌处理洗必泰4×麦克风的浓度作为参考化合物。孵化后37°C 12 h,细菌细胞收集在3000转离心10分钟。然后,样品固定在2.5%戊二醛的w / v 0.1米磷酸缓冲溶液(pH值7.2)晚上和你找找0.1 w / v四氧化锇1%磷酸缓冲溶液1 - 2 h。细胞通过一个过滤器盘(孔隙大小1.2微米)和使用串行浓度的乙醇脱水(30、50、70、95和100% v / v)。临界点干燥后,涂层与金溅射,样本检查使用扫描电子显微镜(JSM-IT500HR InTouchScope™, JEOL,东京,日本)。

2.8。棋盘采用微量分析

抗菌测试化合物之间的合作,可以确定麦克风值,进一步研究了棋盘采用微量测定由Botelho[如前所述31日与修改)。20μ我准备接种体的变异链球菌被添加到混合两个测试化合物的浓度,在一系列0.0625 4×麦克风。实验进行了一式三份。FIC指数被定义为最低浓度没有明显增长的测试化合物的组合测试的生物。FIC指数的两倍和三倍的组合计算使用公式(2)和(3),分别。

FIC指数的值是解释如下:FIC指数≤0.5;协同效应,0.5 < FIC指数< 4.0;冷漠和FIC指数> 4.0;敌对的效果。

2.9。统计分析

time-kill试验,统计分析使用SPSS(26.0版本,SPSS Inc .)、芝加哥,美国)。执行一个方差分析(方差分析),并使用图基之间的显著差异意味着测定的诚实显著差异测试或Dunnett T3检验的显著性水平 。

3所示。结果与讨论

3.1。EOs的化学成分

十大作文五EOs的GC / MS分析了系统被发表在表1。萜烯和萜类化合物的主要成分中发现FR(Δ-3-careen, 24.4%),吉隆坡(L-limonene, 25.1%),和KLL(香茅,73.3%)油,而内酯(γ-dodecalactone 33.1%)主要是LG油中发现的。酚类化合物(3-allyl-6-methoxyphenol 29.7%)是一个主要在HB复合油。

3.2。抗菌感受性

表2显示了麦克风和MBC值五EOs, GA,乳酸链球菌肽变异链球菌写明ATCC 25175和三个临床分离株。发现LG油显示最高的效力在EOs MIC值最低的0.1% v / v,紧随其后的是KLL石油(0.8% v / v),而FR, HB, KL油显示低效力与麦克风和MBC值高于0.8% v / v。因此,只有有效的EOs包括KLL和LG选择对三个临床分离株调查他们的活动。LG的结果显示类似的功效与三个临床菌株。KLL显示更高的易感性临床菌株如图所示的低麦克风和MBC值相比与反对变异链球菌写明ATCC 25175。

的酚类化合物,GA显示类似的麦克风和MBC值4毫克/毫升标准和临床分离株。如表所示2,乳酸链球菌肽未能抑制的增长变异链球菌写明ATCC 25175名临床孤立的浓度低于4000国际单位/毫升,但乳酸链球菌肽能抑制一个临床分离的麦克风和MBC值2000和8000国际单位/毫升,分别。这个结果是不一致的与以前的报告,乳酸链球菌肽的抗菌活性变异链球菌飞往洛杉机的联合航空159班机应变与MIC值的范围625 - 1250国际单位/毫升(15]。它可以指出,不同抗菌功效的天然化合物可能取决于类型的化合物,作用机理和应变测试的微生物(33]。因此,不同的菌株可能解释这一现象。

引用代理,洗必泰展示类似的麦克风和MBC值对所有测试细菌浓度低于0.0156毫克/毫升。这些结果表明类似的或更高的所有测试化合物的功效比对临床分离株标准菌株。因此,变异链球菌写明ATCC 25175只用于进一步的研究。80 v / v渐变的混合0.04%和0.03% v / v绝对乙醇BHI介质产生可见的细菌生长类似于积极控制浊度对所有测试菌株。这个结果暗示渐变测试80和绝对乙醇浓度对细菌生长没有抑制作用。此外,这个结果是符合负控制time-kill试验和SEM研究的结果。

3.3。Antibiofilm化验

antibiofilm形成测试化合物中演示了图的属性1。结果表明,LG石油antibiofilm活动最高超过86.44%抑制治疗时的浓度范围0.1 - -0.8% v / v。对于KLL石油、生物膜的形成变异链球菌在浓度抑制模式和显示> 73.32%的最大抑制治疗后0.8% v / v。研究这发现是类似于Wongsariya et al。29日]的antibiofilm形成功效KLL石油大于90%抑制治疗后麦克风。

另一方面,尽管HB、FR和KL油无法确定麦克风的浓度范围0.006 - -0.8% v / v,这些油可以抑制生物膜的形成在同一浓度范围小于50%(图1(一))。这一结果表明,生物膜抑制EOs不得与他们的抗菌活性。EOs是一个复杂的混合物的组成不同的化合物;然而,萜烯代表最大的成分以及其他non-terpene化合物(34]。同样,LG油的主要的萜烯和萜类化合物成分是橙花醛二甲缩醛、柠檬醛、柠檬醛(Z)约为51%,而KLL石油主要由香茅大约73%(表1)。记录,monoterpene-based油能够导致生物膜细胞的膜完整性的丧失;因此目标网站的EOs似乎细胞膜(35]。此外,细菌细胞受损细胞膜经常无法连接,形成生物膜的结构36]。因此,KLL和LG油含萜烯作为主要成分可能会减少生物膜的形成,这些机制(37]。如数据所示1 (b)和1 (c),乳酸链球菌肽浓度测试不能抑制生物膜的形成变异链球菌,而GA 8毫克/毫升浓度的干扰抑制生物膜的形成为88.98%。此外,洗必泰≥0.0156毫克/毫升的浓度可以防止生物膜的形成大于85.75%(图1 (d))。

3.4。EOs的增强效应、GA和洗必泰尼生素的抗菌活性

提高活动的测试化合物的抗菌活性乳酸链球菌肽如表所示3。发现添加KLL石油0.4% v / v或GA在2毫克/毫升导致戏剧性的减少乳酸链球菌肽的麦克风。添加KLL石油能够减少乳酸链球菌肽的麦克风> 4000国际单位/毫升⩽31.25国际单位/毫升(至少125倍),而GA的显示能力减少乳酸链球菌肽的麦克风500国际单位/毫升)(至少8倍。此外,GA的浓度2毫克/毫升演示能力减少乳酸链球菌肽的MBC至少4倍。众所周知,乳酸链球菌肽是稳定在酸性介质(38),而遗传算法是一种弱酸pKa值为4.0(羧酸)。因此,该协同抗菌活性变异链球菌可以解释为降低pH值的解决方案导致乳酸链球菌肽溶解度的增加。此外,它可能是类似于抗坏血酸,乳酸链球菌肽的抗菌活性增强绑定在乳酸链球菌肽分子稳定其结构(16,39]。然而,添加其他EOs和洗必泰sub-MIC v / v值0.4%,0.0078毫克/毫升,分别展示了没有加强对乳酸链球菌肽的抗菌活性的影响。这些结果暗示的强化能力EOs和洗必泰尼生素的抗菌活性变异链球菌可能不是只有他们的抗菌活性有关。尽管KLL油显示更高的能力减少乳酸链球菌肽的MIC值大于GA,只有GA显示减少乳酸链球菌肽的MBC值的能力。因此,乳酸链球菌肽和GA的组合被选中来进一步确定杀死率和观察形态学变化。

3.5。Time-Kill化验

测试化合物的抑菌和杀菌效果变异链球菌如图2。KLL石油杀死的能力变异链球菌在时间的方式。治疗KLL石油浓度的1、2和4×麦克风可以减少细菌生存的数量大于3日志₁₀CFU /毫升在12 h和诱导在24 h(图完整的细菌细胞死亡2(一个))。石油对LG的杀菌活性变异链球菌在浓度和时间依赖模式。治疗与LG石油浓度的2和4×中等收入国家施加最杀菌活动(≥3日志₁₀倍减少)在24 h,但LG在麦克风的浓度只有抑制生存的数量变异链球菌不断24 h(图2 (b))。尽管GA显示浓度的抑菌效果4×麦克风通过阻止细菌生长24 h,它未能抑制细胞生长在浓度为1或2×麦克风(图2 (c))。这一结果与研究是在协议康等。40),遗传算法能够预防牙周细菌的生长抑菌特性。

因为在每个时间点的样品稀释用生理盐水和转移到一个新的BHI琼脂板,可能发生的生存适应性隔离的一个动态的方式time-kill试验(41,42]。因此,麦克风和MBC值从静态视图获得的肉汤采用微量分析可能不同意的time-kill测定抑菌剂(28]。在洗必泰,杀菌效果与≥3日志₁₀倍减少观察治疗后在4×24 h麦克风,而抑菌效果与< 2日志₁₀倍减少检测治疗后1或2×麦克风(图2 (d))。

尽管植物衍生的化合物的能力,加强细菌素的抗菌性质报道尤其是对食源性致病菌包括单核细胞增多性李斯特氏菌和沙门氏菌sp。43),GA和乳酸链球菌肽口服病原体的抗菌合作研究使用time-kill分析如图2 (e)。治疗的结合GA和乳酸链球菌肽sub-MIC价值能够抑制细菌生长24 h,而单独使用遗传算法或乳酸链球菌肽治疗未能抑制细菌生长。这一结果表明,GA可以加强抑菌方式乳酸链球菌肽的抗菌活性。

3.6。扫描电镜

扫描电镜的图像变异链球菌写明ATCC 25175如图3。SEM照片显示KLL和LG油浓度的4×麦克风诱导改变在细胞形态。控制细胞的存在80 v / v渐变0.04%和0.03% v / v绝对乙醇显示具有平滑的椭圆形细胞表面(图3(一个))。相比之下,细胞治疗KLL石油或LG石油在4×麦克风显示不规则椭圆形细胞表面上的凹度(数字3 (b)和3 (c)箭头)。按照先前的吉马良斯的研究等。44),大肠杆菌香茅醇处理了与粗糙表面不规则的细胞大小。因此,反变异链球菌KLL活动和LG油可以由萜烯组分主要是由于与其他化合物的贡献。

此外,治疗引起的GA在4×麦克风未分离的球形细胞与涂层材料(图3 (d)箭头)。除了降低环境pH值,遗传算法也可以作为螯合剂的二价离子,因此对细胞膜造成破坏性的影响(45]。这个解释支持形态扫描电镜的结果。治疗后都可以看到类似的结果变异链球菌细胞与盖拉语对提取物,富含GA含量(46]。细菌细胞也显示不规则细胞壁结构和显示更少的细胞链(46]。此外,GA的抗菌机制是影响生物膜的组成和结构,抑制葡糖基转移酶活性和直接抑制细菌的生长18,47,48]。当变异链球菌与洗必泰治疗,观察细胞表面穿孔(图3 (e)箭头)。

如数据所示3 (f)和3 (g),细胞处理乳酸链球菌肽(1000 IU)或GA(0.5×麦克风)仅显示出类似的形状和细胞膜的控制,这与time-kill化验的结果是相一致的。虽然乳酸链球菌肽是扮演着一个重要的角色在造孔细菌膜(49),受损细胞膜不能观察到与乳酸链球菌肽治疗后1000 IU。然而,与乳酸链球菌肽和GA处理后,细胞显示一个小未分离的椭圆形细胞矩阵(图的存在3 (h))。遗传算法的增强效果的抗菌活性乳酸链球菌肽可能是类似于协同效应的柠檬酸,乳酸链球菌肽的组合和柠檬酸可以控制的发展金黄色葡萄球菌和l . monocytogenes通过诱导胞质成分包括离子的释放,DNA和RNA (50]。

3.7。棋盘采用微量分析

测试化合物之间的相互作用主要是使用棋盘试验研究。除了降低乳酸链球菌肽的麦克风,KLL油一起LG油、GA、洗必泰证明了协同效应变异链球菌FIC指数低于0.37,如表所示4。然而,添加剂的相互作用被发现的三重组合KLL石油、LG油和洗必泰。这一结果并不令人惊讶,因为LG加上洗必泰表现出冷漠效应FIC指数为0.56。尽管遗传算法可以减少乳酸链球菌肽的麦克风变异链球菌石油或洗必泰与LG, GA的组合显示,冷漠与FIC指数大于2的效果。但是,没有敌对的效果观察这些化合物之一。因为EOs是植物性产品包含一个复杂的混合物质,在每个组成部分的交互可能导致添加剂、协同和拮抗效果(22]。因此,行动与每个成分相关联的模式应该进一步调查。

4所示。结论

GA和两个泰国烹饪EOs包括KLL和LG精油表现出强大的抑制效果变异链球菌和生物膜的形成。细胞膜损伤导致细菌细胞形态的改变是可能的作用机理。尽管疲软的乳酸链球菌肽的抗菌活性变异链球菌明显,GA显示能力提高反变异链球菌活动的乳酸链球菌肽抑菌MIC值减少字符的8倍。此外,KLL油结合LG油、GA和洗必泰揭示了协同抗菌作用。因此,这些结果可能有价值的信息,GA, KLL可能会利用作为一种辅助治疗与乳酸链球菌肽或洗必泰来克服变异链球菌相关的感染。

数据可用性

作者声明,所有数据支持这项研究的结果提供了在本文结果与讨论部分。在当前的研究中使用的数据集是可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

Thai-China香料和香水工业有限公司是感激地承认支持五个EOs。Assoc。口腔微生物学系教授博士Jinthana Lapirattanakul,牙科学院,曼谷,泰国Mahidol大学衷心承认提供三个临床分离株。这项研究是由蒙国王的理工学院Ladkrabang研究基金(批准号2562 - 0216001)。

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