局部麻醉Chondrotoxicity：脂质体布比卡因少Chondrotoxic比标准布比卡因

抽象

目的。本研究的目的是确定是否（1）脂质体的布比卡因是chondrotoxic;（2）从标准布比卡因脂质体布比卡因不同的chondrotoxicity;和（3）chondrotoxic效果是依赖于时间的。材料和方法。我们获得72个10毫米关节软骨塞12从新鲜牛远侧股骨膝关节并将它们暴露于盐水，0.5％布比卡因，或者用于任一30或90分钟的脂质体的布比卡因。治疗后二十四小时，软骨细胞活力与使用荧光活/死法的测量。方差的ANOVA检验进行后跟一个的Holm-Sidak检验跨条件使成对比较。学生们t-检验比较方法。结果。与盐水对照组相比，暴露于脂质体布比卡因30分钟的细胞存活率(53.9%±21.5% vs 73.7±18.4%)要低。 ）和this remained significant at 90 minutes (49.1% ± 20.3% vs. 67.2% ± 25.6%, ）。90分钟后，脂质体布比卡因的软骨毒性作用小于布比卡因，存活率更高(49.1%±20.3% vs 21.4%±14.0%， ）。Chondrotoxicity was found to be time dependent within the bupivacaine group (percent viability at 30 min: 45.5 ± 18.2%, 90 min: 21.4 ± 14.0%, ）;然而，脂质体布比卡因并没有显示出明显的时间依赖性软骨毒性关系( ）。结论。布比卡因和脂质体布比卡因对软骨细胞都是有毒的。脂质体布比卡因的软骨毒性小于标准布比卡因，且不表现出时间依赖性毒性。

1.简介

关节内局部麻醉剂注射通常用于处理退行性关节疾病相关的疼痛，以及关节镜手术相关的疼痛。它们已被使用多年，并已被证明在门诊诊断和治疗目的有效。在围手术期使用关节内局麻药也被证明可以改善术后疼痛评分，减少阿片类药物的消耗和阿片类药物相关的不良事件，如呼吸抑制、镇静和便秘[1]。与关节内注射相关的并发症已经引起关注，特别是在涉及健康软骨的关节镜手术中。研究人员发现，布比卡因和其他局部麻醉药对软骨细胞有毒，体外和体内研究表明，即使是短暂的暴露也会导致软骨细胞代谢下降、细胞凋亡和坏死增加以及软骨的总体形态学降解[2- - - - - -8]。疼痛泵模型显示，持续暴露于局麻药输注后软骨整体坏死[9]。然而，chondrotoxicity的局部麻醉剂之间的程度与比其他[一些演示更chondrotoxicity变化5,9- - - - - -11]。

关节内注射局部麻醉药可以提供已知的止痛效果，因此，对软骨毒性较小的药物的研究仍在继续。2011年10月FDA批准了一种新的脂质体布比卡因配方。它由多泡脂质体组成，与标准布比卡因相比，缓慢释放布比卡因的时间更长。脂质体布比卡因的半衰期约为34小时[1] 2.7小时标准布比卡因比较。这使得手术后卧床或持续过程缓解疼痛。本研究的目的是确定是否（1）脂质体的布比卡因是chondrotoxic;（2）从标准布比卡因脂质体布比卡因不同的chondrotoxicity;和（3）chondrotoxic效果是依赖于时间的。我们的零假设是，脂质体布比卡因既不chondrotoxic也没有时间依赖性毒性。

2.材料和方法

我们收集了12只刚屠宰的牛膝关节的关节软骨。在当地屠宰场进行安乐死的肉牛一般年龄在18个月左右。牛软骨是一种公认的体外软骨模型，在以前的局麻药研究中使用过[3.,4,6]。我们从每个膝关节远端股骨关节面采集6个关节栓(每个髁3个)共72个核，使用燕麦收获机系统(Arthrex, Naples, FL)获得10mm核。塞子被保存在组织培养液中(杜尔贝可改良的Eagle培养基/F12、10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和1%菌带)，在采集后4小时内，将其暴露于实验处理中。这些插头被随机分成6组，每组12个芯。然后各组分别浸泡在生理盐水、1.3%未稀释脂质体布比卡因(Exparel®，Pacira Pharmaceuticals, Parsippany, NJ, USA)或0.5%布比卡因中。选择脂质体布比卡因的浓度是因为这是商业可用的浓度。标准配方布比卡因0.5%是临床常用浓度。另外，为了比较，其他研究使用该浓度研究布比卡因的软骨毒性[2- - - - - -4,7,9- - - - - -12]。三组插头(n = 12 each) were submerged for 30 minutes, and three groups of plugs were submerged for 90 minutes (Figure1）。

插头，然后用生理盐水冲洗它们转移到新的组织培养媒体面前。24小时后，我们使用振动切片机（振动切片机，圣路易斯，MO，USA），以获得一个100 μ米厚的切片从每个关节插头的中间的三分之一和垂直于关节面取向。每个切片，然后用5染色 μ（;分子探针，Eugene，OR CMFDA）和1.5 5-氯甲基二乙酸酯的M个 μ在室温下避光30分钟。二醋酸氯甲基荧光素是一种可在市场上买到的绿色荧光染料，它可以自由地通过细胞膜，在那里被酶转化为不渗透的分子。然而，碘化丙钠是不渗透膜的，当与核酸结合时，它会发出红色荧光，通常用于识别不能活的细胞。然后用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤染色切片。图像使用Zeis Axio观察者z1 -倒置LSM 710 NLO激光扫描共聚焦显微镜，水浸X63 C计划apochromat (NA 1.2)目的。图像为1.661×1.661μm、为1024×1024像素，采样深度为16位。不同的激光器被用来激发每种染料。用488 nm激光激活5-CMFDA, 561 nm激光激活碘化丙。图像是通过目测荧光峰信号。使用公共域Java图像处理程序(ImageJ;(美国国立卫生研究院，贝塞斯达医学博士)。为了计算软骨细胞的数量，其他人已经量化了每个软骨细胞和软骨细胞核的大小[13]。我们用在激光共聚焦显微镜标准大小的珠子，以确定无论是活的或死的软骨细胞或软骨细胞细胞核的粒度。我们然后利用直方图分析和颗粒大小的标准偏差，以确定每个共焦图像对软骨细胞的数量，或者绿为活细胞或红色为死细胞（图2）。

方差的ANOVA检验进行后跟一个的Holm-Sidak测试，以跨越条件成对比较来比较软骨细胞生存力对不同治疗组的平均值。在组内，学生t- 测试被用来比较平均生存能力。结果以活软骨细胞（活力百分比）的百分比。

3.结果

与生理盐水对照相比，暴露于脂质体布比卡因30分钟的塞子存活率(73.7±18.4% vs 53.9%±21.5%， ）。与生理盐水相比，在90min时，脂质体布比卡因继续显示活软骨细胞的减少(49.1%±20.3% vs 67.2%±25.6%， )（表1）。布比卡因的标准制剂显示显著chondrotoxicity在用生理盐水相比所有时间点（表1）。

在90分钟内，脂质体布比卡因的软骨毒性明显低于布比卡因(49.1%±20.3% vs 21.4%±14.0%， ）。然而，在30分钟的时间点，与标准的布比卡因相比，脂质体布比卡因在软骨细胞存活率方面没有显著差异(53.9%±21.5% vs 45.5%±18.1%， ）。与生理盐水相比，标准配方布比卡因在所有时间点均表现出显著的软骨毒性(表)1）。

Chondrotoxicity被认为是随时间变化的布比卡因，但布比卡因脂质体没有达到统计学意义（图3.）。Liposomal bupivacaine percent viability was not different between 30 minutes and 90 minutes (53.9% ± 21.5% vs. 49.1% ± 20.3%, ）。Bupivacaine chondroxicity was greater after 90 minutes than after 30 minutes (21.4% ± 14.0% vs. 45.5% ± 18.1%, ）。

4。讨论

我们研究的主要结果是确定脂质体布比卡因是否具有软骨毒性，是否比标准配方布比卡因具有更强的软骨毒性，以及软骨毒性是否具有时间依赖性。我们发现脂质体布比卡因实际上以时间依赖的方式具有软骨毒性，拒绝了我们的原假设。此外，在90分钟时，脂质体布比卡因的软骨毒性小于布比卡因。

术后盂肱部软骨松解的报道引起了对局麻药潜在软骨毒性的关注[14,15]。先前的体外研究表明布比卡因和利多卡因可能具有软骨毒性。最近引入了一种新的脂质体布比卡因配方，但是关于关节内脂质体布比卡因的安全性的数据却很少。Shaw等人在接触脂质体布比卡因、布比卡因和罗哌卡因之前，在培养基中收集牛膝关节软骨并分离软骨细胞[16]。他们的研究结果表明，1小时暴露于脂质体布比卡因后，软骨细胞存活率与对照。罗哌卡因和布比卡因相比布比卡因脂质体具有较高的软骨细胞活力。在他们的研究中，软骨细胞的存活率要大得多这是最有可能是由于较高的基线细胞活力。他们只用第一通道软骨细胞，这表明始于一个更健康，更均匀的人口研究。在我们的研究比较，我们暴露关节插头，而不是软骨细胞介质局部麻醉这可能是比较有代表性的体内暴露。相比之下，我们的研究与对照组相比显示了脂质体布比卡因组中减少软骨细胞的活力。此外，Shaw等人。只在一个时间点报告的结果;因此，依赖于时间的毒性无法评估。

Sridaran等人研究了人软骨细胞对脂质体布比卡因的暴露[17]。他们从接受踝关节融合的成人患者中获取了大范围正常的关节软骨，并将其暴露于冻干的乙醇复苏的布比卡因、不同剂型的布比卡因、脂质体载体DepoFoam (Pacira)和脂质体布比卡因。同样，他们发现与脂质体制剂相比，布比卡因降低了存活率。他们注意到6小时内脂质体布比卡因的时间依赖性毒性。

我们与先前公布的文献表明脂质体布比卡因同意研究也是chondrotoxic，但在量化脂质体布比卡因如何毒性是软骨细胞这项研究的辅助工具。以往的研究表明，所有的局麻药是chondrotoxic在一定程度上[2,5,7,14]。然而，在局部麻醉剂之间chondrotoxicity程度的显著变化，因此研究一种新制剂在确定chondrotoxicity的程度和进一步的理解是毒性的依赖于时间的性质是有价值的。

脂质体布比卡因，然而，被证明是超过90分钟后，在标准布比卡因制剂毒性较低。Liposomal bupivacaine may have less chondrotoxicity due to a lower peak concentration (1 : 6), a longer time to peak concentration (1 : 12), and a longer half-life than standard bupivacaine (36 : 3.5) [1]。具有在关节的时间更长的时间的布比卡因浓度较低的潜在好处，以延长缓解疼痛，必须用软骨细胞毒性的风险称重。这些数据表明脂质体布比卡因可以是用于关节内注射较布比卡因更好的选择，提供疼痛缓解的时间比较长随时间更少chondrotoxicity。

我们的研究表明，标准配方布比卡因对关节软骨的影响随着暴露时间的延长而持续。在90分钟比30分钟时，布比卡因的软骨毒性更强。这与先前发表的研究结果一致，这些研究证实了局部麻醉药(包括利多卡因、布比卡因、罗哌卡因和类固醇)的时间依赖性软骨毒性[6,10,12]。有趣的是，脂质体布比卡因在90和30分钟的软骨毒性没有显著差异。脂质体制剂可能通过其药代动力学差异提供一种时间依赖性的保护。

罗哌卡因是另一种长效局部麻醉与活动的持续时间类似布比卡因[18]。关于罗哌卡因软骨毒性的文献有很多，一些研究显示在人类软骨细胞中孵育30分钟后没有软骨毒性[7]或12小时[5]。其他研究表明，当浓度较高时，其软骨毒性为0.75% [19]。Shaw比较了rovicapaine和脂质体布比卡因，发现脂质体组的软骨细胞存活率更高[16]。

这项研究有几个局限性。我们的研究是在体外进行的，观察结果不一定能直接应用于体内;因此，所有的结果都需要临床证实。我们的研究使用的是牛的软骨而不是人的软骨，因此本研究得出的结论可能适用于人类，也可能不适用。然而，之前关于这个课题的许多研究都是在牛软骨上进行的[3.,4,6,14]。

我们使用了每种实验药剂的一个浓度和只有两个时间点，因此我们的发现可能很难应用于体内条件，考虑到潜在的稀释效应在关节。我们没有直接评估含脂质体布比卡因的实验溶液中游离布比卡因的浓度。由于脂质体在体内和体外的溶出取决于pH值、体积和血管密度等多种因素，布比卡因的扩散无法控制。因此，我们尝试在体外模拟体内环境，研究布比卡因的自发扩散。较长的孵化时间是理想的;然而，本研究的体外性质存在固有的局限性。软骨是从活的动物身上取出来的，因此细胞变得更加脆弱，对任何实验试剂都更加敏感。我们怀疑，由于在体外模型中软骨细胞的自然降解，我们将在更长时间间隔内获得混杂数据。90分钟的时间点也是基于之前发表的多时间点潜伏期研究[6,10]。一个潜在的未来研究可能是检查更长的时间点和这些相同的配方对软骨的影响。

脂质体组中使用的基于脂质的贮库（DepoFoam）由具有非同心的多个脂质层[多囊脂质体的20.]。这种结构被认为可以增加稳定性和延长药物释放时间。而不使用药物隔离的脂质库本可以作为适当的控制，但无法用于测试。然而，库的基本结构阻止库与软骨膜相互作用或进入细胞。因此，在尝试匹配体内环境时，盐水被认为是一种合适的替代控制介质。

与先前公布的研究相比，但是，我们相信，我们的研究有几个优势。首先，我们的研究中所使用的关节软骨骨软骨核心。已经有之前的研究寻找具有完整软骨基质与分离的软骨细胞的值，作为关节表面充当天然屏障的药物，因此是一种更可靠的模型。其次，我们采用了类似于在以前的研究中使用的协议，这更增加了我们的研究方法的有效性，也有利于我们与以前的研究结果进行比较。虽然附加的麻醉剂可能已经与脂质体布比卡因比较，通过比较只有标准制定布比卡因有用的，我们已经能够识别只对脂质体制剂基础的差异。

5.结论

与其他麻醉药类似，脂质体布比卡因对软骨细胞有毒性;然而，与标准布比卡因相比，它的软骨毒性较小，并且在毒性时间依赖性较小的情况下，用于关节内镇痛可能更安全。暴露时间及其影响的临床相关性尚不清楚，有必要对特定剂量和时间依赖效应进行进一步研究。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的活力百分比数据请直接从相应的作者。

泄露

作者在洛玛林达大学的骨科进行了这项研究。

利益冲突

(1)作者个人利益声明:(i) Nirav Amin，医学博士，曾担任Pacira Pharmaceuticals的发言人、顾问和顾问委员会成员，并获得了Pacira Pharmaceuticals的研究资金。医学博士Nirav Amin拥有Pacira Pharmaceuticals的股票和股份。(2)其他所有作者均声明无潜在利益冲突。

致谢

成像是在医学先进的成像和显微核心的罗马琳达大学的支持NSF的（批准号：MRI-DBI 0923559）（SM威尔逊）和医学罗马琳达大学医学院进行。我们要感谢莫妮卡鲁瓦尔卡瓦她与软骨细胞成像帮助。

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