效果指纹和治疗糖尿病药和抗氧化导致的识别紫荆花rufescensl

文摘

糖尿病是世界上主要的健康问题之一,和许多报告支持氧化应激的作用在1型和2型糖尿病的发病机制。本研究旨在评估的治疗糖尿病药和抗氧化活性紫荆花rufescens植物在苏丹的医学用于治疗糖尿病。也旨在识别分离和描述生物活性治疗糖尿病药和抗氧化化合物使用bioactivity-guided分馏其次是高性能薄层色谱法(效果)的自传,液体色谱-光谱分析和核磁共振(NMR)。两个潜在化合物被成功分离和识别可能提供新的领导更多的类似物药物发现。

1。介绍

近年来,对来自不同文化背景的民间医学的兴趣显著增加在工业化国家因为全世界很多处方药都起源于热带植物(1]。

糖尿病是一组疾病具有多种病因导致胰岛素分泌缺陷,胰岛素的行动,或两者兼而有之。胰岛素不足反过来导致慢性高血糖(血糖水平很高)和干扰在碳水化合物,脂肪和蛋白质的新陈代谢。(2)治疗糖尿病被认为是主要的全球性问题,和成功的治疗尚未被发现。传统药物可能提供有用的资源开发新药物治疗糖尿病及其并发症的3]。药用植物,主要是与抗氧化活性的药物的主要来源是氧化应激糖尿病并发症的治疗,因为他们没有或只有很少的副作用4]。几种植物提取物与血糖过低的属性和保护活动法案通过其积极影响血糖在糖尿病患者体内平衡或通过降低血压和改善肾和心血管功能5,6]。最常见的中药活性成分黄酮类化合物用于治疗糖尿病,丹宁酸、酚类、生物碱提高胰腺组织的性能通过增加胰岛素分泌或减少肠道吸收的葡萄糖(7]。这些化合物的存在意味着评估这些植物的抗糖尿病的属性的重要性(8]。

属于属的植物紫荆花已报告有强大的抗氧化、抗糖尿病的抗炎(9,10,11),和其他生物属性。(12,13]。这些植物的叶子和茎皮中使用不同phytopreparations降低血糖水平,他们也经常用于民间医药治疗传染病和几个实验研究已经证实他们的抗菌潜力(14,15,16,17,18]。

这种植物紫荆花rufescens林常用名Kharoub(家庭:豆科)已经使用传统上在苏丹,尼日利亚,塞内加尔各种pharmacotherapeutic目的。然而,到目前为止,还没有报道科学的验证既传统声称其生物活性。因此,它被认为值得确定其抗氧化和抗糖尿病的潜在和隔离和生物活性化合物的特点。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

所有化学药品和试剂均为分析纯质量。甲醇、氯仿、石油醚、乙腈、甲苯、醋酸乙酯、美国南达科他州和DMSO获得精细化工有限公司,印度孟买。来自英国科学夫人,甲酸,DPPH Sigma-Aldrich公司,美国和硅胶G₆₀F_254年从美国精细化工有限公司,孟买,印度,

2.2。设备

色谱分析进行了使用水域ACQUITY UPLC^(™)系统(美国马水域Corp .)。硅胶60 F254预镀效果盘子,10×10厘米,使用(默克公司、德国)。Camag Linomat-V器也使用(Camag、瑞士)。¹H - - -¹³理化性质光谱进行了500年力量是光谱仪(德国),运行速度为700 MHz (¹核磁共振)和125 MHz (¹³光谱级DMSO-d理化性质)₆。

2.3。色谱条件

分离了UPLC系统配备一个二进制溶剂输送系统、一个auto-sampler,列管理器和可调女士检测器(水域,曼彻斯特,英国)。授权下的系统操作软件(水域,美国)。数据采集进行了积极的模式。色谱法进行使用乙腈(一个v / v)和0.5%甲酸在水中(B)作为移动阶段整体毛细管为C₁₈列(ACQUITY UPLC^(右)本·C₁₈1.7μ米,2.1×100毫米),precolumn分流比1:5和10流量μ在环境温度L / min。

研究了不同溶剂系统为了获得合适的洗脱TLC板。甲苯:乙酸乙酯:甲酸(5:4:1,v / v / v)最终被选为特定的溶剂。

2.4。植物材料

科尔多凡省北部的工厂收集和验证标本的药用和芳香植物研究所(MAPRI),和一个凭证标本是沉积的生药学,喀土穆大学医药学院。

2.5。植物提取物的制备

风干叶粉(1公斤)详尽的使用500毫升石油醚索氏提取器。提取然后集中使用一个旋转蒸发器压力降低。剩下的马克是干,使用500毫升氯仿提取,然后通过500毫升甲醇。氯仿和甲醇提取物都集中在减少压力下使用旋转蒸发器。

2.6。分离提取的活跃

甲醇提取(活性提取物)分离乙酸乙酯、氯仿、正丁醇(每250毫升)暂停后按顺序在水里。

2.7。抗氧化试验

2.7.1。DPPH自由基清除实验:

DPPH自由基清除决心根据品牌et al .,与一些修改(标准方法19]。在96孔板,测试提取物溶解在DMSO和被允许与300反应μM ethanolic解决方案2,2-di (4-tert-octylphenyl) 1-picryl-hydrazyl稳定自由基(DPPH)半个小时37°C。孵化后,吸光度测量在517 nm的空白DPPH在DMSO分光光度计使用多平台的读者。没食子酸丙酯作为标准药物浓度为0.5毫米。所有测试一式三份,自由基清除活性百分比(% RSA)通过DMSO-treated样本决心相比对照组使用以下公式: RSA是自由基清除活性百分比,一个_c的吸光度控制和一个_t的吸光度测试提取在517海里。

获得的数据进行统计分析,提出了均值±标准差的意思。

2.7.2。生物自显影法方法

提取是在薄层色谱硅胶上运行G₆₀F_254年使用特定的溶剂系统板。盘子被风干,可视化是由喷涂板与DPPH 95%甲醇/乙醇(0.001 g)。

2.8。抗糖尿病的活动

2.8.1发布。体外试验用TLC Bioautographic方法(α-Amylase抑制剂)

植物提取物的体外抗糖尿病的活动的分析确定了根据Washim汗et al .,标准方法(20.]。乙酸乙酯部分(活跃的一部分)被发现在TLC板和发展使用甲苯:乙酸乙酯:甲酸(5:4:1 v / v / v)为流动相。溶剂迁移后,薄层色谱板干,浸入先前准备的酶解(α淀粉酶(200单元)溶解在缓冲溶液(pH值7.15)和保持在4ºC)。潜伏在一个潮湿的在室温下干燥器是首先进行30分钟之间的主要反应酶和酶抑制剂,紧随其后的是酶底物反应的另一个15分钟,然后风干,最后蘸碘溶液的可视化。

2.8.2。植物提取物的体内试验

植物提取物的体内抗糖尿病的活动的分析也确定Washim汗et al。20.]。糖尿病是由管理链脲霉素诱导的大鼠(柠檬酸缓冲PH值5.5)的剂量腹腔内60毫克/公斤。三天后,测定的血糖水平。动物的血糖水平在300毫克/ 100毫升的血液。测试在正常和链脲霉素提取糖尿病大鼠的影响,动物禁食12小时,然后是管理的提取剂1克/公斤腹腔内。两个小时后,这些动物麻醉乙醚和血液通过心脏穿刺收集。血糖水平是衡量使用葡萄糖提供Reflotron仪器和工具(罗氏诊断)。

2.9。定性分析的活跃的一部分

2.9.1。质分析

质分析用同样的方法其次是Washim汗et al。21]。示例解决方案(5毫克/毫升)透过0.2µM聚四氟乙烯膜过滤和注入UPLC-MS色谱仪。分离是通过逐步梯度从5%到100% B 20分钟。喷雾器气体的流量设置为500 L / h,锥气体将50 L / h,和源温度固定在100ºC。毛管电压和锥电压设置为3.0,40 KV,分别。碰撞,氩受雇于一个5.3х10的压力⁻⁵托。准确的质量和成分的前体离子和碎片离子质量计算使用猞猁V 4.1软件纳入乐器。数据来自UPLC-MS处理质量猞猁美国V4.1(水域),进一步用于代谢组学分析不同的样品。分离代谢物在不同样本初步确认根据m /z配给和文学。

2.9.2。高性能薄层色谱分离法的分析

效果分析使用Washim汗等人的方法(20.),5μl的活性部分的解决方案是分别应用到6毫米宽频带的效果板使用Camag Linomat-V自动化TLC涂布与氮流提供一个交付150 nL / s的速度从注射器。盘子是Camag双胞胎通过一个玻璃罐与选定的溶剂系统presaturated 40分钟。板是发达国家水平在Camag水平发展中室在室温下(10×10厘米)。板在不同波长扫描如254 nm、354 nm和454 nm。在100ºC加热板后5分钟,衍生的色谱用茴香醛5%硫酸甲醇。扫描是在565 nm Camag薄层色谱扫描仪三世使用Wincats1.2.3软件。

2.10。隔离和活性化合物的结构说明

隔离一些积极治疗糖尿病药和抗氧化剂的原则是通过制备薄层色谱法(PTLC)和孤立的化合物的结构测定是通过核磁共振。化学位移值表示δ(ppm)使用单位(TMS)作为内标,和耦合常数(J用赫兹(Hz)表示。标准脉冲序列被用于创造舒适,HMQC, HMBC谱(2 d实验)。

3所示。结果与讨论

尽管胰岛素治疗和口服降糖药物是治疗糖尿病的第一行,他们有一些副作用,不能明显改变糖尿病并发症的课程(22];因此,药用植物一直声称提供糖尿病治疗的另一个来源。许多报道支持氧化应激的作用在1型和2型糖尿病的发病机制。Bioactivity-guided分馏导致不同化合物的分离和鉴定与抗糖尿病的抗氧化活性,其中大多数是酚类化合物,尤其是黄酮类化合物。类黄酮的抗氧化特性是第一个的作用机制研究,特别是关于他们对心血管疾病的保护作用[23]。黄酮类化合物已被证明是非常有效的拾荒者的大多数类型的氧化分子,包括单线态氧和各种自由基可能参与一些疾病(24]。的抗氧化作用机制包括抑制活性氧的形成,通过螯合微量元素参与生产自由基,清除活性物种,移植或保护自然抗氧化防御系统25]。类黄酮的抗氧化活性在治疗糖尿病的有益作用,尤其是许多报道支持氧化应激的作用在1型和2型糖尿病的发病机制。在目前的研究中,我们选择植物的抗氧化和抗糖尿病的活动进行了第一次。

3.1。植物提取物的DPPH自由基清除实验

DPPH自由基清除能力测量的试验表明,提取物表现出非常大的变化在他们的能力抑制DPPH。总结如表1,最高的自由基作用中和methanolic提取获得的。它显示强大的抗氧化活性(89%),几乎相似的效果标准没食子酸丙酯(92%)。

3.2。抗糖尿病的植物提取物的测定

三种不同的提取紫荆花rufescens、石油醚、氯仿和甲醇提取物、接种一剂1克/公斤的腹腔内为正常禁食大鼠和在同一剂量streptozotocin-treated老鼠。甲醇提取明显降低血糖水平在正常禁食大鼠和streptozotocin-treated老鼠27±3.1%和16.9±1.7%,分别在两个小时后管理、氯仿和石油醚提取物对血糖水平的影响不显著(表2)。

3.3。分馏的甲醇提取物和活动评估

结果表明,甲醇提取物的抗氧化和抗糖尿病的活动最好相比其他提取。因此,甲醇提取由分液漏斗分离使用不同的溶剂。量化的分数接受了不同的测试活动,隔离和确定活性化合物。

四个分数的抗氧化活性是化验用DPPH自由基清除实验。表3总结的结果表明,乙酸乙酯部分有强力的抗氧化活性(90%)。

然后进行TLC bioautographic方法检测抗氧化化合物和α淀粉酶酶抑制剂反映抗糖尿病的活动。

有效的乙酸乙酯部分被发现在TLC板和开发使用选定的溶剂。通过喷涂板与DPPH 95%甲醇/乙醇(0.001克),亮黄色或奶油点显示在一个紫色的背景下,这表明化合物与抗氧化活性(图的存在1)。

此外,探讨抗糖尿病的活动,活跃的薄层色谱板被发现分数,筛选了,蘸碘溶液。α淀粉酶抑制剂的薄层色谱板的外观yellowish-greyish深棕色的职位背景(图2)。

3.4。隔离和活性化合物的结构测定(1)和(2)

从治疗糖尿病药和抗氧化剂测试结果(数据1和2),很明显,化合物1和2对氧化应激具有抗糖尿病的活动在他们的活动。对于这些活性化合物的分离,乙酸乙酯部分受到制备薄层色谱法(PTLC)使用甲苯:乙酸乙酯:甲酸(5:4:1,v / v / v)为流动相。

孤立的化合物的结构测定¹H - - -¹³理化性质的光谱。¹化合物1的核磁共振谱(表4)表示的存在两个单线态芳香质子,质子和每个集成为一个质子δ6.44和δ分别为6.77和被分配到6和H-8。其他芳香质子地区分配ring-B质子,和两个双重信号δ7.77和δ6.90被分配到6′和H-5′,分别。1 h - nmr谱还表示一组信号的存在之间不等δ5.2和-5.27 h -归因于“,2”,和H-3”鼠李糖糖。此外,多重态出现在质子信号δ3.11 - -3.97,分配给其余的鼠李糖糖,H-4”和H-5”。葡萄糖糖质子,h -‴, 2‴, H-3‴, H-4”, H-5‴,货币供应量‴,出现在δ介于3.11和4.69。

¹³理化性质谱(表4)表示十个季碳包括一个羰基的存在δ178.21分配给c - 4。c - 4的在前场的转变表明了在c - 5羟基的存在(26]。四个含氧芳香碳δ166.0,162.88,150.00,和144.00被分配到即c - 5, c - 4′,分别和c - 3′。剩下的其他五季碳原子δ159.06,158.08,134.70,120.73,和105.99是分配给C-9, c - 2,颈,颈- 1′,和C-10分别。¹³理化性质谱实验也表明存在一组信号之间不等δ70.01和71.79为糖质子被分配。¹h - nmr、¹³、光谱的化合物1在完全赞同报道芦丁(结构如图3)[27]。

¹核磁共振光谱复合2(表5)表明,光谱不同于之前的确认化合物,在两个信号的存在δ8.01和δ6.90将2′和H-3′分别。

¹³理化性质谱(表5显示一个含氧芳香碳的存在在ring-Bδ160.41碳。两个等效信号δ130.96和131.00是由c - 2′, 3′供给,分别。两个等效信号表示的存在显然ring-B中只有一个羟基的存在。因此,复合2被确认为kaempferol-3-O-rutinoside¹h - nmr、¹³理化性质谱是在完全赞同kaempferol-3-O-rutinoside报道(结构如图4)[27]。

3.5。标准化和高性能薄层色谱分离法指纹分析

有效的乙酸乙酯部分开发的高性能薄层色谱(分离法板使用甲苯:乙酸乙酯:甲酸(5:4:1,v / v / v)为流动相(图5),其次是薄层色谱扫描在254和366海里。效果色谱(2 d和3 d色谱)显示不同的化合物的存在R_f值介于0.11和0.90(数字6和7)。结果表明存在的类黄酮芦丁出现在R_f0.11,与标准相比,可以作为生物标志物用于标准化和质量控制。一般来说,手指印可用于检查掺杂物。因此,它可以用于评估不同的市场制定草药药物剂型。

3.6。质鉴定植物成份的乙酸乙酯部分

UPLC - MS分析结果在超过13预测化合物的识别,和大多数酚类化合物,尤其是黄酮类化合物(表6和数字8和9)。

4所示。结论

在我们目前的研究中,两个有前途的抗糖尿病的产生,即芦丁和kaempferol-3-O-rutinoside,成功地分离和特征紫荆花rufescens第一次。这些结果可以被视为未来的研究的起点。毒理学研究可能进一步计划开发它的形式管理糖尿病的新药。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢生药学的部门,学院制药、苏丹喀土穆大学资助这项研究。

引用

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