血管紧张素II的生理生化血管反应性参数和偏置激动剂TRV023的作用

抽象

自60年代初以来，利用离体主动脉环进行的血管反应性实验已被广泛用作生理和药理学研究的模型。在此，我们建议研究者在研究血管紧张素II的实验模型时应注意的几个参数。血管紧张素II是肾素-血管紧张素系统的活性肽之一，通过AT1和AT2受体发挥作用。一些研究试图通过血管反应性实验来了解血管紧张素II受体在血管水平上的作用。然而，由于大量的变化，只有少数反应性研究试图使用这种方法。因此，本研究的目的是通过血管反应程序，使血管紧张素II的实验方法标准化。为此，利用器官浴中的血管反应性技术，开发了基础张力、浓度间隔、单次浓度、曲线浓度反应和使用同一主动脉环的多个实验等变量。这是第一个标准化血管反应性方案的研究。此外，我们还证明了AT1R的TRV023偏配体在血管部位的作用。

1.介绍

肾素-血管紧张素系统（RAS）在维持心血管系统的稳态中起着关键作用[1个]。在古典RAS轴,肾脏的肾小球旁细胞释放肾素催化血管紧张肽原乳沟形成糖肽血管紧张素I .血管紧张素I转换为血管紧张素ⅱ的血管紧张素转换酶(ACE)删除两个终端肽血管紧张素I .血管紧张素ⅱ(Ang II)是主要的肽形成在这个古典RAS轴和结合血管紧张素1型受体(AT1R)和血管紧张素2型受体(AT2R) [2个]。

血管紧张素II与AT1R的结合可导致有害的影响，如血管收缩和血管平滑肌和内皮功能障碍的增殖。例如，血管紧张素Ⅱ到AT1R也妨碍内皮功能通过增加NAD（P）H氧化酶的活性和产生超氧阴离子[结合三]. 总的来说，这些过程有助于心血管疾病的发展。

AT1Rs是典型的G蛋白偶联受体，通过G蛋白依赖和独立的途径发挥其信号转导作用。AT1R偏向配体同时竞争性地拮抗Ang II刺激的G蛋白信号，同时刺激β抑制蛋白途径[4个]。该方法已被证明可阻断Ang II的有害作用，如血管收缩和心肌肥厚，同时增强对心肌收缩力的有益作用，并激活抗凋亡通路。尽管at1r偏向配体已经在临床试验中进行了测试，但其作用机制仅在心脏和肾脏组织中得到证实[5个–八]。在血管组织的直接影响从未被研究。

对于Ang II的血管反应性有很多不同的研究[9个–德意志北方银行]。多数在文献中找到的研究仅考察间接血管紧张素Ⅱ的作用AT1R [封锁下进行血管反应性曲线13个,14个]。然而，这些研究表明，他们的结果产生了很多变化。Lautner等人也强调了研究RAS中肽的血管反应性的重要性，他们描述了Ang 1-7使用血管紧张素-(1-7)标准方案的技术和缺陷[15个]。

由于血管紧张素II血管收缩方案的标准化难度较大，且现有的血管紧张素II血管收缩方案种类繁多，因此本研究的目的是利用时间、基线张力和血管紧张素浓度参数来标准化主动脉环血管紧张素II血管反应性的理想条件。此外，我们还测试了TRV023对主动脉环的影响，这是一种对AT1受体具有偏活性的肽。TRV023激活β-arrestin途径取代g蛋白，并在本研究中用于验证β抑制蛋白血管的影响在体外。

2.材料和方法

2.1。动物

12周龄雄性Wistar大鼠(鼠形阿尔昆)来自巴西埃斯皮里托中央动物研究所联邦大学。将大鼠分为5组，置于塑料笼中，温度控制（22-23°C），光暗循环12 ： 12-h，自由进食和饮水。总共使用了32只动物。所用的所有方案和手术程序均符合巴西动物实验学院的指导方针，并经圣埃斯皮里托联邦大学伦理委员会批准（CEUA-UFES，第011/2014号方案）。

2.2条。血管反应性实验

如先前所述进行血管反应性实验[16个–18岁]。大鼠过量服用硫喷妥钠(巴西圣保罗，Cristalia, 200 mg/kg, i.p.)后，处死处死，仔细解剖胸主动脉，清除脂肪和结缔组织。在反应性实验中，主动脉被分成2毫米长的圆柱形节段。为了研究血管紧张素II在平滑肌层的作用，所有的环都用针摩擦管腔机械地去除内皮细胞。

将部分胸主动脉置入Krebs-Henseleit溶液(mM: NaCl 118, KCl 4.7, NaHCO)的脏器浴中_三23日,CaCl_2个2 h_2个O 2.5，千赫_2个阿宝_4个1.2,MgSO_4个7小时_2个O 1.2，葡萄糖11和EDTA 0.01)在37°C的温度下，95% O气体_2个和5%的一氧化碳_2个(ph7.4)，并保持基线张力恒定(1 g、2 g或3 g)。使用连接到采集系统(MP100, BIOPAC system, Inc.， Santa Barbara, CA, U.S.A)并连接到计算机的等轴力传感器(TSD125C, CA, U.S.A)记录等轴张力。所有主动脉环暴露两次至75mm KCl (30min)，以检查血管的功能完整性和最大张力。乙酰胆碱不能引起比先前收缩10%以上的苯肾上腺素(Phe)松弛，从而导致去内皮。应用KCl时，如果主动脉环收缩至少2 g，则确认肌层完整性。

2.3。累积浓度-效应曲线(CCEC)对血管紧张素的影响

为了研究CCEC对血管紧张素II的最佳间隔时间，主动脉环暴露于Ang II (1nM至10mm)，每次浓度应用间隔时间分别为15、30、60和120秒。

2.4。NonnCumulative浓度效应曲线（NCCEC）血管紧张素II

对Ang II进行主动脉收缩时，在分离的主动脉环中使用单一浓度的激动剂。经过一段平衡期后，每个主动脉环暴露于单一浓度的Ang II (1 nM至10 mM)。最大收缩被认为是当达到一个平台，张力开始回到基线。

2.5。确定最佳静息张力

为了研究最适静息张力来进行Ang II血管反应性实验，在静息张力为1 g、2 g或3 g的情况下，将主动脉环平衡45 min。然后将主动脉环暴露于Ang II的CCEC。

2.6。重复CCEC与NCCEC对血管紧张素II的评价

研究的可能性,使用相同的主动脉血管反应性组织两次实验,后添加了受体激动剂的浓度和获得的效果,组织多次冲洗,直到回到基线,让另一个60分钟平衡期,直到执行另一个实验中(CCEC或NCCEC)。

3.免疫印迹

用血管紧张素II或TRV023刺激主动脉环10分钟，然后在RIPA缓冲液(50mm Tris (ph7.4)， 0.5% Nonidet P-40, 0.2%脱氧胆酸钠，100mm NaCl, 1mm EGTA, 1mm苯基甲基磺酰氟，1μg/ml aprotinin, 1 mm sodium orthovanadate, and 1 mm NaF). Insoluble tissues were removed by centrifugation at 3,000×g and 4°C for 10 min. Samples were loaded onto polyacrylamide gels (15%) and subjected to SDS-PAGE. After electrophoresis, proteins were electrotransferred to nitrocellulose membranes (BioRad Biosciences, USA). The membrane was then incubated in a blocking buffer (5% BSA, 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, and 0.1% Tween 20) for 2 h at room temperature and then incubated overnight at 4°C with rabbit anti-MLC and anti-p-MLC antibodies. Binding of the primary antibody was detected with the use of specific peroxidase-conjugated secondary antibodies, and enhanced chemiluminescence reagents (Amersham Biosciences, NJ, USA) were used to visualize using the ChemiDoc™ XRS Imaging Systems and Software (Bio-Rad, Biosciences, USA). The band intensities of the blots were analysed using Scion Image software (Scion Corporation).

3.1。统计分析

The values are expressed as mean ± SEM. Contractile responses are expressed as % of contraction induced by 75 mM KCl in the same aortic ring. The Gaussian distribution of the variables was previously analyzed using the D’Agostino–Pearson omnibus normality test. Fitting concentration-response curves were constructed and analyzed using nonlinear regression analysis. Statistical comparisons between the different groups were performed by one- or two-way analysis of variance (ANOVA), followed by Bonferroni’s post hoc test. Differences between means with a value of被认为是统计学显著（统计软件：棱镜7.0，格拉夫派得软件公司）。

四。结果

4.1。CCEC改变血管紧张素II浓度之间的间隔时间

我们首先评估CCEC中血管紧张素II浓度之间的最佳间隔时间。每种血管紧张素II浓度之间间隔15、30、60和120秒。数字1个总结了各时间间隔对主动脉环收缩反应的影响。浓度-反应曲线的两个主要药效学参数显示，与其他时间间隔相比，60秒间隔有增强的收缩反应。每60秒使用一次，Rmax最高(15秒，44±5%;30秒，38±3%;60秒，54±3%;120秒，3±1%，图1个)以及最高灵敏度(pEC)₅₀: 15秒，5.6±0.2 M;30秒，5.8±0.1米;60秒，6.6±0.1米;120秒,没有;间隔120秒时，未观察到对Ang II的响应性。

4.2。NCCEC对CCEC对Ang II

比较了CCEC和NCCEC协议的最大响应。数字2个shows no difference in the maximal response between these two methods (CCEC, 56 ± 3% vs NCCEC, 60.0 ± 3% of KCl contraction). However, higher contraction was developed in the NCCEC protocol at smaller concentrations (at 10^-8M: CCEC, 0±3% vs NCCEC, 21±8%;10点^-7M: CCEC 12±2% vs NCCEC 39±6%， ）。

4.3。重复血管反应性实验的效果

我们也评估执行可行第二CCEC或使用相同的主动脉环（CCEC II和NCCEC II）的第二NCCEC至血管紧张素Ⅱ的可能性。因为无收缩是在CCEC我观察到120秒的时间间隔内（图1个)、CCEC II在此期间未执行。数据3(一个)–3 (c)总结Ang在CCEC I和CCEC II中诱导主动脉环收缩的结果。与CCEC i相比，CCEC II的主动脉环对Ang的最大收缩反应降低[R_最大(15 sec, −51%; 30 seconds, −57%; 60 seconds, −74%). Figure3（d）显示NCCEC I和II的结果。与CCEC协议相比，NCCEC协议的损伤似乎更低。NCCEC I组与NCCEC II组相比，最大收缩反应仅下降17%。最后，为了证明这种反应模式是Ang II特有的，血管反应也在肾上腺素能的作用下进行α1-激动剂苯肾上腺素，结果显示CCEC II与CCEC I无损伤(图3 (e)）。

4.4。静息张力的影响。

我们还测试了静息张力对Ang II血管反应的影响。数字4(一)比较不同的静息张力。在2g时的反应([R_最大: 69.7±4%;压电陶瓷₅₀: 6.92±0.13-logM)主动脉环静息张力与1g相比确实改变了对Ang的敏感性和最大反应(p < 0.05)。[R_最大：64.9 ± 5%；pEC₅₀：6.45 ± 0.07−logM）和3 g([R_最大: 64.8±4%;压电陶瓷₅₀: 6.86 ± 0.08−logM).

To prove that this response is specific to Ang II, CCEC to phenylephrine was also performed at resting tension of 1 g, 2 g, and 3 g, and difference was not observed in the maximal response or in the sensitivity to phenylephrine using different resting tensions (Figure图4（b））。这些数据表明，静止张力显著有助于血管响应性血管紧张素Ⅱ。

4.5条。AT1的作用β抑制蛋白，偏置信号

接下来，我们测试了是否激活β通过AT1R抑制蛋白会导致血管收缩。无论CCEC（图5(一个))和NCCEC协议(图5(一个)）并没有表现出显著收缩TRV023。这些数据表明血管紧张素Ⅱ诱导的血管收缩是G蛋白依赖性的，并且β-独立逮捕。

进一步开发β-arrestin独立通路在Ang ii诱导的血管收缩、肌球蛋白轻链磷酸化(MLC)也进行了分析图6个显示只有血管紧张素Ⅱ，但不TRV023，诱导P-MLC磷酸化在主动脉环。

5.讨论

在此，我们研究了血管反应性实验中的几个参数。我们观察到，60秒是血管紧张素II各浓度之间的最佳间隔时间。我们还观察到2g是最好的静息张力，而执行2条血管反应性曲线是不可行的。最后，我们观察到，用NCCEC浓度血管紧张素II构建曲线也是可能的，且不干扰Rmax或pEC₅₀。

起初，我们根据药物的每个应用程序和观察到之间的时间即血管紧张素Ⅱ作用是理想的与每个血管紧张素Ⅱ应用之间大约60秒在大鼠主动脉环使用的累积浓度 - 反应曲线对血管紧张素Ⅱ表明血管收缩。Shorter times (15 or 30 s) were unable to induce whole contraction, as indicated by lower potency expressed by pD2 and lower[R_最大。另一方面，即使在Ang II浓度较低的情况下，每次Ang II应用之间持续时间较长的曲线也不表现出收缩。这可能是由于AT1R的脱敏作用，表明血管收缩到血管紧张素II更依赖于Ang II浓度之间的时间，而不是Ang II浓度的应用。

接下来，我们发现，非累积血管紧张素Ⅱ曲线在低浓度比累积曲线发展更收缩力。我们还表明在我们的研究中，无论是否进行单浓度或累积浓度反应实验，对血管紧张素的血管反应是在第二个实验中较低，但这种损害在单一浓度要低得多相比，浓度响应证明单一浓度可能是最指示时，有必要在同一环执行两个曲线。林德等。表明，在CCEC II此钝化的效果的发生是由于在主动脉环血管紧张素Ⅱ诱导的tachyphylactic收缩反应[德意志北方银行]。

已由我们的研究小组出版[19个,20个]以及其他[21岁–24个] AT1R的心血管系统的机械敏感特性。在这项研究中，我们发现，离体主动脉环的牵张改变了血管对Ang的反应性。与1g的基底张力相比，2g的基底张力具有更高的EC50和Rmax。2010年，Liu等[25个表明机械拉伸增强Ang ii诱导的平滑肌细胞增殖在体外. 2014年，Tang等人。[26个]表明通过膜拉伸AT1R信令的变构调节。它们由血管紧张素Ⅱ表明ERK1 / 2的不同的激活取决于细胞提交的拉伸，这表明对血管紧张素Ⅱ更高敏感，因为较高的初始细胞伸展。在2016年，Abraham等人。[27个]发现，缺乏AT1受体的小鼠无法响应心脏体积，这表明，AT1受体信号通路在心脏的机械传导的重大变化产生弗兰克 - 斯塔林力。但是，我们是第一个在功能上血管系统，显示AT1R机械性能。这可以是在疾病状况例如高血压或行程中的RAS阻断剂可具有的作用，即使没有在血管紧张素Ⅱ[浓度显著增加的重要性28个,29个]。

除了血管反应方案对AngⅡ的标准化外，我们还旨在研究AT1R（TRV023）的有偏配体诱导血管收缩的作用，类似AngⅡ。我们和其他人已经研究过它对肾脏的影响[7个和心脏系统[5个–八]。然而，这是第一次研究显示在血管的直接影响。我们已经发现，虽然TRV023还结合AT1R，它并没有引起MLC2的血管收缩，也不磷酸化，这表明血管紧张素Ⅱ的血管收缩作用是G蛋白介导的。我们没有观察到TRV023的直接vasodilatatory影响，但我们使用免费内皮主动脉和容器不预收缩。未来的研究应在内皮细胞的存在，并在预收缩血管来解决这些问题，执行这些操作。TRV027（和TRV023）是AT1R的“偏置”配体，选择性地拮抗血管紧张肽Ⅱ的负面影响，同时保持AT1R刺激的潜在procontractility影响。后在细胞和啮齿类动物模型中一些积极的结果，研究人员开始，其目的是确定安全性，有效性和TRV027的最佳浓度，以推进未来研究的BLAST-AHF（急性心力衰竭血管紧张素受体研究的偏配体）。然而，621例患者后，这一阶段IIB剂量范围研究后没有改善临床状态的30天随访[八,三十]。在这里，我们证明了AT1R的血管收缩效应是依赖于g蛋白的，更重要的是TRV没有血管收缩效应。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从相应的作者处获得。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

Marcos Andre Soares Leal和Thanisia de Almeida对这项研究也有贡献。

致谢

这项工作是由次Fundacao德Ampearo一个Pesquisa支持做圣埃斯皮里图州（FAPES，0602/2015），Conselho国立西恩西亚ËTECNOLOGIA（的CNPq，479160 / 2011-2），以及金边大学获得圣克鲁斯（UESC）（批准号：。00220.1100.1866）。ECV通过从一个的CNPq格兰特（博尔萨PQ-1D，303001 / 2015-1）的支持。

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