分析在体外成骨细胞培养在牙科未来骨再生支架的目的

文摘

组织工程的主要焦点之一是寻找立体的支架材料,组织再生的遵守自然的属性。确定材料生物相容性是一个基本的步骤,考虑它的使用。因此,本研究的目的是分析成骨细胞细胞粘附和生存能力在不同的材料来确定哪个是更适合未来的骨再生。立体的结构制作与羟磷灰石、胶原蛋白和多孔硅。牛骨作为材料控制。生物相容性是由播种主要成骨细胞在每一个立体的结构。细胞形态学评估通过共焦显微镜扫描电镜和活力。观察成骨细胞殖民所有评估材料的表面,他们并没有引起成骨细胞细胞毒性。分析四种不同的材料不同的成分和特色研究表明,粘性最好HA和活力胶原蛋白。总的来说,本次调查的结果显示这些材料可用于组合,在牙齿和骨再生支架用于医学领域。

1。介绍

骨再生越来越变成一个非常有前途的领域,resorbable生物材料与细胞相结合的使用(1]。组织工程是对开发替代性治疗自体或同种异体骨和软骨移植2- - - - - -4]。未来组织工程应用程序旨在减少治疗复杂性和减少医疗系统成本。在最优条件下,不同的细胞可以培养和播种在天然或合成resorbable生物材料作为支架,然后放置在地方再生是必要的。此外,生物活性蛋白质在矩阵系统信号细胞分化和生长(5]。

支架作为模板模仿细胞外基质(ECM)的功能,在细胞和分化成原生表型进行交互。然后脚手架必须符合下列条件:脚手架必须生物相容性,无毒,nonimmunogenic,容易精致,可生物降解。此外,它必须允许适当的细胞生存和信号。此外,细胞必须能够生长,细胞重建和重组6,7]。因此,最终支架性能主要取决于材料的性质,其处理和其他材料规格与互动。

支架的最重要的一个特征是一个相互联系的孔隙度,使血管化高营养和气体扩散,它允许废物处理(8- - - - - -10]。此外,一些研究人员指出400微米的孔隙大小应该是200 (7,11,12)和其他500微米的13]。非常小的毛孔阻塞的细胞,阻止细胞生长和骨基质矿化14]。

因此,一个合适的孔隙度可以提高机械保留支架与宿主的环境,实现的基于ECM不明通过形成蛋白质吸附层。这允许的响应细胞在生物材料方面接触,从而使新组织的形成(15]。Rustom et al。16)和Babaie报告(17]指出最优脚手架体系结构是通过制造材料的不同的孔隙大小(微观和宏观)。材料必须模仿松质骨密质,为正确引导骨生长在修复骨缺损。

要考虑的另一个方面是支架机械阻力负载和力量。脚手架必须提供的属性尽可能接近主人的自然环境,只有当新组织退化是正确形成(12]。目前,生物相容性材料的组合已经提出,为了获得更好的脚手架属性,导致足够的骨形成(18]。各种材料的选择,以及各种处理技术,提出了组织工程。它已经证明了羟基磷灰石和聚丙醇acid-coglycolic聚乳酸纤维增加骨形成数组(19]。同样,有人建议羟磷灰石与其他材料混合可能治疗用于肿瘤的治疗20.- - - - - -22]。其他的研究表明,羟磷灰石结合聚合物,如壳聚糖,透明质酸,用于药物运输和释放(23]。

同时,多孔硅似乎承诺在骨修复支架使用,因为这种材料已经被证明可以促进成骨细胞粘附和启动成熟过程24,25]。此外,解散生物活性玻璃似乎引起对成骨细胞周期基因控制的影响,导致骨矿化(26- - - - - -29日]。此外,硅似乎也提高了力学性能和生物活性的羟磷灰石(24,30.]。最近的研究描述相结合的有机和无机阶段创建混合材料;这种做法提供这些材料具有特殊属性,允许他们有多个功能和用于各种条件(31日]。

尽管有这些发现,理想的骨再生支架没有被发现。因此,这项工作的目的是分析成骨细胞在四个不同的附件和可行性材料:牛骨(控制),羟磷灰石(HA),多孔硅,和胶原蛋白以确定骨再生支架制作候选人。

2。材料和方法

2.1。羟磷灰石合成

羟磷灰石合成是由湿技术。三颈瓶,900毫升0.33四水硝酸钙(Ca(没有₃)₂h·4₂O)放置了1500毫升0.12磷酸氢二铵(NH₄)₂HPO₄)在1.0毫升/分钟。调整pH值至12日氢氧化铵(NH 75毫升₄哦)补充道。随后,加热的解决方案是在90°C,搅拌1小时,在室温下培养10天。获得的沉淀与蒸馏水洗几次中和pH值,干在250°C 1 h,然后在1000°C教廷3 h。

牛骨收购如下:牛股骨样品从当地市场购买。骨头是移除组织进行了清理和消毒,有机物质和微生物。热水用于骨髓提取。百分之二氢氧化钠是用来去除脂肪和蛋白质和1%防腐解决方案(次氯酸钠)防止微生物的生长。随后,骨头是用水冲洗去除的痕迹清洗和消毒的解决方案。当时受到热处理在1000°C 3 h移除所有有机材料(32]。

2.2。x射线衍射(XRD)

XRD进行HA和牛骨样本。X射线衍射图上得到PANalytical X 'Pert PRO MPD(荷兰)设备使用以下参数:测量范围在2°、90°(2之间θ0.02°),距大小(2θ),每步时间0.4 S, CuKα1辐射λ= 1.5406,LynxEye探测器。结晶相定性识别存在于样品是由对比剖面测量的反射衍射概要报告的反思国际衍射数据中心(ICDD)(粉末衍射文件)使用search-match软件(32]。

2.3。多孔硅的合成

多孔硅是由电解使用高频用乙醇稀释(高频:C₂H₅哦)(默克公司)浓度(1:2)和细胞为此特别设计(图1)。

2.4。胶原蛋白的合成

牛腱的尾巴被选为I型胶原蛋白的提取使用0.05米的醋酸和连续搅拌在4°C 72 h。获得解决方案随后通过无菌纱布过滤和离心3000 rpm在4°C 2 h。最后,I型胶原蛋白的解决方案是冻干,提取和储存在4°C后续三维矩阵结构。

2.5。成骨细胞隔离和细胞培养

膝关节骨小梁的主要造骨细胞从组织获得来自关节置换手术,病人知情同意签署后。San Ignacio医院行手术(整形外科学系Pontificia Javeriana大学在波哥大,哥伦比亚)和研究伦理委员会批准Pontificia大学002年Javeriana法案2009。

成骨细胞是孤立的,以下的方法报道Ducheyne和邱33]。首先,从皮质骨小梁骨分离。骨小梁被切成一块一块约1 - 2毫米。骨头碎片处理2毫克/毫升胶原酶II型(300 U / mg)两个小时在摇晃水浴37°C。外植体用无菌盐水洗(PBS, pH值7.0)删除从骨髓造血细胞和贴壁细胞。培养瓶碎片被放置在25厘米,杜尔贝科的修改鹰介质:营养混合物F-12 (DMEM / F12;Gibco,生活技术)补充10%的胎儿克隆我(HyClone热费希尔科学),100 U /毫升青霉素,100µg / ml链霉素(Gibco,生活技术)和1.25µ克/毫升二性霉素b (Gibco,生活技术)和37°C和5%孵化有限公司₂。媒介改变了每周两次直到细胞达到融合。七天后,细胞迁移的组织是可视化。获得的细胞通过rt - pcr对骨钙素(OCN),骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP),和骨涎蛋白(BSP)基因的表达。

2.6。在体外成骨细胞的生物相容性评价在不同的材料上

主要的人类成骨细胞播种12-well板块在50000个细胞的细胞密度/好哈,硅,牛骨,和胶原蛋白生物相容性矩阵进行评估。为此,制造多孔矩阵与环氧乙烷消毒和1×10⁶成骨细胞被播种在每个材料。细胞在DMEM补充的边后卫和200年的10%μg / ml青霉素和链霉素为7天,其次是扫描电子显微镜(SEM)和荧光共焦扫描生物相容性评价。

2.7。扫描电子显微镜(SEM)

一周后,文化矩阵与细胞被固定为3%戊二醛的缓冲溶液,紧随其后的是脱水与乙醇浓度增加(50岁,60岁,70年,80年,90年和100%),和干临界点黄金涂层。形态学是评估使用SEM JEOL模型房子- 6490 LV高真空模式下运行的特点,配备传感器允许散射电子成像。

2.8。荧光共焦扫描评估

细胞生存能力评估矩阵(n= 4)通过荧光显微镜使用现场/死工具包(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。这个工具包是活细胞的歧视,通过无处不在的酯酶活动的存在,这是由酶转化nonfluorescent钙黄绿素为强烈荧光钙黄绿素。阴离子染料钙黄绿素保留在活细胞内,产生一种强烈的绿色荧光(激发在495 nm,排放在515海里)。此外,如果质膜完整性丧失,然后ethidium homodimer-1 (EthD-1)进入细胞。亮红色荧光的增加是死细胞中观察到(激发与发射495 nm 635海里)造成EthD-1核酸绑定。染色进行3 d矩阵播种没有额外的程序和减少切片机。

3所示。结果

3.1。细化的支架

羟磷灰石样品的x射线diffractgrams见图2。就是得到结晶度好,强大而狭窄的山峰。为每个diffractgram定性分析是基于反射对应确定的化合物从数据库PDF-2国际中心的衍射数据(ICDD)。牛骨样本,羟磷灰石(00-024-0033),磷酸水合物(00-018-0303)、碳酸钙(01-086-2341),磷酸氢钙氧化物(01-089-6495)被确定。合成HA样本含有羟磷灰石(00-024-0033)和磷灰石(01-072-7532)(图2(一个))。

脚手架准备从四个不同的根据建立材料合成方法,获取三维结构对不同疏和纹理数据3(一个)- - - - - -3 (d))。粒子不同平滑粗糙、不对称分布,从长,圆的,和软不规则多面体颗粒形式。微孔率的大小不等,从0.1μ米约5μm。球状颗粒与不同的材质和大小观察羟磷灰石通过湿降水(图3 (b))。微观孔隙多面,不同的大小在1和3之间μ米,类似于观察牛多孔骨(图3(一个))。多孔硅呈现微小气孔排列在一个复杂的结构(数据3 (c)和3 (d))。胶原,纤维,交织在一起的长,平行纤维网络(图未显示)。

3.2。在体外成骨细胞的生物相容性评价在不同的材料上

3.2.1之上。扫描电子显微镜(SEM)

SEM图像的结果显示,成骨细胞功能的细胞连接和交互与其他细胞(数字4(一)- - - - - -4 (d))。经过七天的文化中,牛骨成骨细胞的支架有一个健康的外观与丝状伪足扩展到其他细胞和ECM(图4(一))。与控制(牛骨),成骨细胞播种在HA支架后七天在文化并没有透露尽可能多的与支架的交互与控制;即少长丝状伪足观察(图4 (c))。进一步,观察细胞的相互作用矩阵为二氧化硅多孔支架。细胞并建立它们之间的交互通过扩展丝状伪足(图4 (d))。

3.2.2。评价细胞生存能力

荧光显微镜的结果表明成骨细胞生存能力的四个支架后七天的文化(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。尽管没有死细胞信号,根据材料种子细胞的数量减少。最多数量的观察细胞的胶原蛋白支架(图5(一个)牛骨(图)5 (c)HA(图),5 (b))。脚手架观察到的细胞数量最少的是硅支架(图5 (d))。

4所示。讨论

有吸引力的替代骨移植已通过生物材料发展的最新进展(34]。许多方面发生骨再生的应该考虑通过实现组织工程技术,其中细胞与支架或矩阵(35- - - - - -37]。此外,脚手架必须具备一定的结构特点,使新的组织代细胞生长和发展专业的环境。

在这项研究中,支架准备了四种不同的材料进行评估在体外成骨细胞细胞依附和生存能力。分析了成骨细胞的主要文化来确定这些材料可以提供合适的微环境。材料选择的标准是基于人类骨骼特征(1)相似,就像控制牛骨;(2)结构组成部分有机羟磷灰石等阶段;(3)有机相的结构组成部分,即:胶原蛋白;(4)最后,材料与多孔硅等机械强度高的特点。

羟磷灰石一直是最常用的生物陶瓷在牙科重建和骨组织再生由于其生物相容性,osteoconductivity,和缺乏细胞毒性9,33]。然而,HA机械强度和降解能力较低(38,39]。然而,其表面形貌像骨头和因为它是骨的有机成分,与其他材料混合在一起的时候是很有用的。这种联系可能会增加生物活性和生物相容性。此外,其他材料可以提高羟磷灰石的缺点,比如机械强度。

Romanelli等人开发了一个nanofibrous凝胶支架钛纳米颗粒和纳米晶体被添加到模拟骨组织,实现成骨细胞分化[40]。在这项研究中,我们使用羟磷灰石牛羟磷灰石形态特征非常相似,如图2和3(32]。生存能力和细胞形态学结果表明这种材料可以用战略来调节细胞间的相互作用,得到好的结果在临床应用。

重要的是要注意,HA孔隙度会增加当结合材料、凝胶等供应HA离子改善细胞生存能力但反过来降低其结晶度和晶粒尺寸41]。即使获得合成HA没有控制孔隙度,在目前的研究中,孔的大小1和3之间的不同μ得到了m,这属于牛骨微孔率作为控制的尺寸范围(范围从0.1µ米约5µ米)。它被确认,成骨细胞与彼此互动和坚持表面,延长他们的丝状伪足。这表明HA可以为细胞提供一个合适的微环境的发展。此外,该技术可以提高允许孔隙大小控制,支持营养运输和毒素处理(35,42]。

另一个相关方面考虑支架生物降解能力。几项研究表明使用HA混合物用不同的材料来改善他们的缓慢降解。其中,Kasuya等人使用磷酸盐水泥的混合物凝胶/公顷实现改善机械性能,降解性和骨形成6]。与兔子的一项研究,Kurashina等人表明磷酸三钙(TCP)启用了HA的混合速度退化(43]。最近的出版物报道与CaCO HA复合₃球体可注射骨修复使用,快速降解性能和新骨生成(44]。

最近的研究评估了生物降解性和力学性能的羟基磷灰石/壳聚糖/磁铁支架,显示更高的混合和提高成核中的羟磷灰石内容网站。这使得矿物并列增加了壳聚糖和磁铁矿,因此增加机械强度。另一方面,生物降解性增加,HA含量减少,由于减少了成核站点覆盖表面,从而增加材料的孔隙度。总的来说,观察表面退化和孔隙的形成之间的相关性(45]。

相反,胶原蛋白具有生物降解特性,是一个不错的选择。胶原蛋白I型被认为是一种很有前途的支架材料,因为它是最普遍的ECM成分(46,47]。该纤维结构蛋白支持张力、压力和扭转(48]。牛尾腱胶原蛋白的获得可能是胶原蛋白I型,贡献与必要的细胞微环境维护和组织形成(27,49]。然而,鉴于其纤维特性,扩散性能和细胞迁移的可能性可能会改变35]。

赢得了et al。50)设计了一个支架,介绍了胶原蛋白的结构支持。这部小说包含蛋白质的混合osteocalcin-fibronectin融合蛋白与胶原蛋白纤维网络。他们证明了这种混合材料可以作为潜在的骨和骨再生支架(50]。当前文学报告显示胶原支架制造和羟磷灰石(Col /公顷),双梯度的羟磷灰石内容成立,模仿正常骨结构。其结构是建立在集成层,它允许形成均匀的和相互联系的毛孔。这些条件可以增加细胞增殖和成骨分化51]。在目前的研究中,观察到的胶原蛋白被证明是一个矩阵使成骨细胞的生存能力。事实上,它是支架与在这方面最好的结果。

多孔硅的结果显示成骨细胞粘附(图4 (d))。对于这个材料,粗糙的表面是由酸攻击(图1),这可能对细胞粘附提供了有利的地形。它已经表明,表面纹理是生物活性的关键属性。基于我们的证据,成骨细胞并坚持表面(图4 (d))。根据D 'Elia et al .,材料生物活性允许细胞粘附,影响植体的稳定性和寿命或允许组织再生(52]。一般来说,细胞连接是由特定的分子,通常在特定的结合位点整合蛋白。表面附着受到细胞外环境,nanodimensioned聚合在一起,动员整合素受体细胞质蛋白质微地形特征复杂,被称为焦点联系(53]。在粘附基质,细胞开始探索它的环境和使用纳米尺度迁移过程如丝状伪足和板状伪足(54]。

成骨细胞粘附在材料表面是一个长期现象,涉及一系列生物分子之间的交互诱导信号转导和细胞反应。成骨细胞在材料表面的反应是形象化的一系列不同的与时间相关的现象:蛋白质吸附在材料表面,紧随其后的是一个序列的快速短期事件构成附件阶段和随后的附着力阶段,其次是扩散、迁移和分化表型(图4)[55]。

成骨细胞粘附基质是通过粘附分子介导的。cell-matrix粘连机械连接的内部肌动蛋白丝和矩阵,导致局部粘连的形成,焦斑,或者焦接触。这种焦接触顽强的粘附结构,仍然附着在下层,即使有力的细胞分离(图4)[56]。

总的来说,所有材料化验提供了不同的属性,需要进一步优化实现衬底模仿自然环境。最好的材料提供一个兼容的表面细胞粘附是牛骨,其次是哈,多孔硅,胶原蛋白。相比之下,文化的一个星期后,胶原蛋白持续最可行的细胞的数量。

5。结论

在这项研究中,成骨细胞细胞形态学、粘性和可行性进行评估是一个可能的生物相容性指标。我们观察到良好的细胞之间的细胞反应播种到准备的脚手架。根据底物,观察不同的反应。粘合度是最好的HA和胶原蛋白的可行性。这些材料已经广泛报道,选择3 d支架发展(57- - - - - -60]。这项研究代表了一个初步分析,需要进一步评估改善支架的特点。最优条件应能使细胞相互作用,分化,生物降解,激活信号分子促进组织再生。

骨组织工程仍然持有许多挑战。支架材料是达到最终目标的关键特点:细胞识别、组织具体的承诺,修复、再生。因此,特殊利益的关注使用的组合材料提供互惠互利。这种交互将解决一个材料的缺点补充其他材料的优势,导致理想准备未来支架建立在组织再生。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢Vice-Rectory研究Pontificia大学Javeriana金融支持(项目6387年和3263年)。此外,他们表达他们的感谢牙科学院牙科研究中心和后勤支持科学的学校。

补充材料

包括图形抽象,题为“SEM显微图的结构和CFM(共焦荧光显微镜)的图像细胞生存能力,在不同的支架经过7天的成骨细胞的细胞文化”。(补充材料)

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