抗菌活性的香豆素类和咔唑生物碱的根源黄anisata

文摘

黄anisata是一种寄生的传统药用植物用于治疗感染,过敏(沸腾、癣、湿疹),扁形虫感染,流感,腹部绞痛,便秘。植物化学的筛选试验的二氯甲烷/甲醇(1:1)根提取物显示黄酮类化合物的存在,植物甾醇,香豆素类、酚类、生物碱、单宁、萜类化合物和自由还原糖和皂甙的缺失。硅胶柱色谱分离的二氯甲烷/甲醇(1:1)提取咔唑生物碱衍生物的heptazoline (1)和三个香豆素类(2- - - - - -4),包括已知香豆素imperatorin (3)和chalepin (4)。阐明了结构的化合物光谱技术(红外光谱、¹H核磁共振,¹³C NMR和部门- 135)。原油中提取和分离的化合物的抗菌活性用琼脂扩散法对菌株的筛选金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,芽孢杆菌substilis。抗菌测试的结果显示的导数heptaphylline (1)和imperatorin (3)表现出对类似的抗菌活性金黄色葡萄球菌和b . substilis(分别为14岁和13毫米的抑制)的环丙沙星(抑制区15毫米)的浓度为20µ克/毫升。Chalepin (4)透露更多的抗菌活性b . substilis(16毫米抑制区)相比,环丙沙星(15毫米)。

1。介绍

药用植物已被用于治疗各种疾病,自古以来,仍然发挥重要作用的发展中国家基本卫生需求(1]。大多数人在农村和城市地区的发展中国家依赖于治疗传染病的药用植物。黄anisata(Willd)钩。f . Benth交货(图1),被本地名称“olmaa 'ii”在埃塞俄比亚(Afan奥罗莫语语言),属于家庭芸香料,广泛用于各种非洲部分地区的细菌和真菌感染的治疗皮肤包括沸腾、癣、口腔鹅口疮和湿疹2,和疟疾3]。我们在此提出一个全面的植物化学成分分析和抗菌根提取的评价黄anisata。

2。实验部分

2.1。一般

在硅胶柱色谱分离进行了60(70 - 230年的网格大小,默克公司)。薄层色谱硅胶60 f - 254, 0.25毫米厚层铝表检测斑点。样本应用于列通过吸附在硅胶或溶解在适当的溶剂。红外(IR)数据记录在珀金埃尔默模型红外光谱(400 - 4000厘米⁻¹用溴化钾磁盘)。的¹H核磁共振,¹³C NMR,部门- 135光谱记录使用力量皇冠400 MHz光谱仪使用经颅磁刺激作为内部标准。所有核磁共振化学位移值数据报告在ppm (ppm)相对于内部标准。所有使用的化学品均为分析纯RanChem一般贸易公司,埃塞俄比亚的亚的斯亚贝巴。

2.2。植物材料收集和识别

的根源c . anisata(Willd)钩。f .前任Benth收集从Oromia地区,西方Wollega区,这是2018年3月在亚的斯亚贝巴以西541公里处。植物被植物学家Shambel而minelik,埃塞俄比亚国家植物标本,亚的斯亚贝巴大学。收集的植物的根彻底清洗用蒸馏水来除去污秽,风干在树荫下,和存储。植物根系干切成小块,风干,磨成细粉。

2.3。提取

粉粉(500克)和二氯甲烷/甲醇浸泡(1:1)72年人力资源与偶尔摇晃。提取过滤和集中使用一个旋转蒸发器在40°C给原油8.7 g提取收率(1.74%)。

2.4。隔离的化合物

粗提取液(8.5克)的硅胶吸附,经过硅胶柱色谱分离(150克硅胶)和筛选了增加梯度的乙酸乙酯n己烷。总共65分数被收集。分数显示类似的R_f值和颜色特征在TLC的总和。分数11 - 12显示黄斑紫外线照射下的R_f价值0.56n己烷/乙酸乙酯(8:2)溶剂系统。集中后,留下的固体材料被反复清洗n己烷生成化合物1。分数19-25组合因为所有分数显示单一的现货和类似的R_f值。集中后,固体被反复清洗n己烷买得起化合物2。分数29-34(16毫克)结合薄层色谱的基础上,概要文件和显示一个红色的点在薄层色谱使用n己烷:层(6:4)作为流动相。集中后,固体被反复清洗n己烷买得起imperatorin(3)。分数46-50(27毫克)结合薄层色谱的基础上,概要文件和显示一个点在薄层色谱使用n己烷:层(5:5)作为洗脱液。集中后,固体被反复清洗n己烷买得起chalepin (4)。

2.5。植物化学的筛选试验

植物化学的筛查在文献[使用标准协议执行4- - - - - -8]。

2.5.1。测试萜类化合物

粗提取液(0.5 g)溶解在5毫升的甲醇和2毫升的提取处理1毫升的2,4-dinitrophenyl溶解在100毫升的2 M盐酸肼。橘黄颜色确认的形成存在的萜类化合物(4]。

2.5.2。检测生物碱

粗提取液(0.3 g)与2毫升的浓盐酸混合。混合物被过滤和混有少量的在室温下戊醇。几滴Dragendroff试剂(碘化铋钾溶液)被添加到酸层和红棕色沉淀是观察到的5]。

2.5.3。测试单宁(明胶测试)

少量的提取与水混合,在水浴加热。提取、1%明胶加入了含有氯化钠溶液。形成白色沉淀则表明了单宁的存在(6]。

2.5.4。测试皂甙(泡沫测试)

粗提取液(0.5 g)在5毫升蒸馏水溶解。混合大力动摇了获得稳定持久的泡沫(7]。

2.5.5。测试类黄酮

乙酸乙酯(10毫升)添加到粗提取液(0.5 g)并使用蒸气浴加热3分钟。混合物过滤,滤液(4毫升)与1毫升的稀氨水混合。形成强烈的黄色批准的类黄酮(4]。

2.5.6。测试对蒽醌类(Bontrager测试)

粗提取液(0.5 g)被带进第一个试管,和5毫升氯仿添加而摇晃5分钟。提取过滤到第二个试管,动摇与同等容积的100%氨水,获得一个粉红色紫色或红色氨层(底层)4]。

2.5.7。检测酚类

几滴FeCl的2%₃被添加到粗提取液(0.5 g),和蓝绿黑颜色的形成表明酚类的存在(8]。

2.6。抗菌测试

2.6.1。制备包含提取光盘

相同浓度的20倍µg / mL准备的提取、分离纯化合物,和标准。被纳入无菌agar-disc扩散浓度和干在37°C。琼脂盘是重仔细确认准确的提取和分离纯化合物结合(preweighed相比空白光盘)。

2.6.2。细菌培养

大肠杆菌和铜绿假单胞菌从粪便标本中分离的诊所发现根据常规文化属性和生化测试。每个被包括在研究的四个菌株。一夜之间文化的几个殖民地伊红美蓝(EMB)琼脂转移到大约4 - 5毫升Trypticase酱油汤(TSB)媒介。肉汤在3 - 4小时37°C,孵化和悬挂的浊度调整0.5的麦克法兰硫酸钡的标准。标准的悬架是用于定性和定量抗菌化验。

2.6.3。细菌的敏感性测试

标准化的培养液(20µ介绍了g / mL)无菌琼脂板的表面,和无菌玻璃撒布机用于培养液的均匀分布。无菌agar-disc扩散之前浸泡在一个已知浓度的提取或纯化合物(20µ每盘g / mL)小心地放置在标签播种盘的中心。同样的程序是用于所有使用的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株。板块在37°C和耗氧孵化24小时后检查区域的抑制。抑制区和尺子测量与控制盘(碟只包含生理盐水)。人类病原体微生物菌株用于本研究如下:两个革兰氏阴性细菌,铜绿假单胞菌,大肠杆菌,两个革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。

细菌股票文化孵化24小时37°C在营养琼脂培养基(Oromia公共卫生研究实验室、阿达玛)。菌株是生长在Mueller-Hinton琼脂(尼古拉斯)板块在37°C(细菌生长在营养肉汤37°C和维护在营养琼脂偏在4°C)。琼脂融化(50°C),和微生物文化然后无菌添加到琼脂培养基在45°C的盘子和注入无菌培养皿固定板。这些实验都是在重复执行。盘子被孵化的24 - 48小时37°C的细菌。

抑制区产生的植物提取物比较产生的抑制区商业标准抗生素。一个稀释(20µg / mL)黄anisata提取、纯化合物和标准药物准备在DMSO用营养琼脂管。Mueller-Hinton无菌琼脂板被播种与指示菌株(108 cfu)和允许呆在37°C 3人力资源。控制实验在相似条件下进行使用庆大霉素作为标准药物抗菌活性。周围的区域增长的抑制测量磁盘后24小时孵化在37°C的细菌。敏感的微生物物种的植物提取物和孤立的纯化合物被测量的大小确定抑制区(包括磁盘)的直径在琼脂表面在磁盘和值< 6毫米视为不活跃对微生物(1,9]。

3所示。结果与讨论

3.1。植物化学的筛选

植物化学的筛选试验的二氯甲烷/甲醇(1:1)和甲醇根提取物显示黄酮类化合物的存在,植物甾醇,香豆素类、酚类、生物碱、单宁、萜类化合物和自由还原糖和皂甙(表的缺失1)。

3.2。化合物的结构说明

复合1获得了一个棕色的粉末(熔点:227 - 228°C)的吗R_f价值0.52n己烷/层(8:2)作为洗脱液。红外光谱(KBr磁盘)显示广泛的振动在3290厘米⁻¹归因于羟基(OH)和夏普在1608厘米吸收⁻¹归因于一个羰基一半。的¹H NMR谱(CDCl₃、400 MHz表2为单线态质子)显示信号δ11.68 (1 h,年代,哦)表明羟基(OH)组。羟基的在前场的化学转变表明分子间氢键的存在(仙女效应)、单线态峰的存在δ9.94 (1 h,年代质子,CHO)醛。四个芳香质子观察到的存在δ7.28 (1 h,dd6),7.43 (1 h,dd第7),7.95 (1 h,ddH-5,J= 7.75 Hz),和7.99 (1 h,ddH-8)表明双取代的芳香环的存在。两个脂肪族甲基质子的存在δ1.91 (3 h,年代,H-4′)和δ1.80 (3 h,年代H - 5′)烯质子δ5.35 (1 h,t,J= 5.96赫兹)和苄基的亚甲基质子δ3.66 (d,h′J= 6.90 Hz)表明prenyl组织化合物的存在。

此外,存在在前场的单线态芳香质子δ8.07表明这个质子经历醛羰基的各向异性效应。上面的芳香单线态质子的化学位移的位置(H-4)和在前场的化学位移的羟基一部分允许明确转让醛一半在两个碳原子之间的颈轴承质子H-4 (c - 4)和c - 2羟基。的¹³C NMR谱(CDCl₃、100 MHz表2)结合部门- 135显示18个碳的存在。其中,六个信号是由于次甲基碳原子,八季,一个苄基的亚甲基,两个甲基,和一个羰基。的峰值δ195.4是由于羰基的醛一半。含氧sp²季碳被观察到δ157.9 (c - 2)。剩余的碳原子的芳香次甲基碳原子被观察到δ125.9 (c - 4), 119.8 (c - 5), 123.7(其他),120.9(即),和110.9 (8)。此外,由于季碳原子在光谱显示信号δ109.1(颈- 1),115.5(颈),117.4 (C-4a), 125.3 (C-4b), 134.2 (c - 3′), 140.2 (C-8a)和145.1 (C-9a)。prenyl的一部分出现δ22.8(颈- 1′),121.3 (c - 2′), 134.2 (c - 3′),δ25.9 (c - 4′)和18.2 (c - 5′)。因此,基于上述光谱数据和比较文学,化合物的结构1被发现咔唑的衍生物生物碱(1)的俗名heptaphyline [10),后来有一个羟基,即位置。

复合2获得了作为一个和一个棕色结晶粉末吗R_f值为0.56n己烷/层(7:3)溶剂系统。红外光谱(KBr磁盘)显示广泛的振动在3419厘米⁻¹由于羟基的存在的一部分。在1617厘米强劲的大幅振动⁻¹和1100厘米⁻¹建议的存在烯C = C和碳氧(切断),分别。此外,强烈的振动在2849厘米⁻¹和2930厘米⁻¹表明碳氢键的振动亚甲基(sp²)和甲基(sp³),分别。

的¹H NMR谱(CDCl₃、400 MHz表3)透露的山峰δ7.54 (1 h,年代H-4),δ7.193 (1 h, s - 6)δ6.955 (1 h, s, H-9)归因于芳香质子。的存在prenyl一半被确认的基础上亚甲基质子(2)邻烯碳;烯质子(H-3”)和两个甲基被观察到δ3.38、5.34 (1 h,tH-3”)δ1.78 (3 h,年代H-5”)和1.81 (3 h,年代分别,6”)。的峰值δ6.18 (1 h,dd,J= 10.8,17.6赫兹,2′)归因于烯烯亚甲基质子质子相邻终端δ5.09 (1 h, H-3”)δ5.07 (1 h, H-3”)。对称的甲基质子被观察到δ1.48 (3 h, s, H-4′, 5′)。两个单线态芳香质子的存在δ7.19 (1 h, s - 6)δ6.95 (1 h, s, H-9)加上一个在前场的质子δ7.54 (1 h,年代)是在良好的协议与chromene基,后者(H-4)位于的地方β内酯-安置的一半,而6和H-9位于1、芳环的四个位置chromene骨架。

的¹³C NMR (CDCl₃100 MHz,表3)光谱结合部门- 135显示18个碳原子的共振。其中,五个信号是由于次甲基碳原子,八季,三甲基,2亚甲基碳。出现在最在前场的信号δ160.7由于酯羰基,而季碳出现在δ157.3 (8)δ153.3 (C-10)被分配给sp²含氧季碳原子。次甲基芳碳被观察到δ138.3 (c - 4), 102.5 (C-9), 128.2(其他)δ121.2 (C - 3”),和145.6 (C - 2′)。甲基信号由于c - 5”和其他“被观察到δ分别为25.8和17.9。对称碳信号也观察到C - 4′和C - 5′δ26.2,而亚甲基信号观察28.6 (c - 2”)和112.8 (c - 3′)。此外,由于季碳原子在光谱显示信号δ131.2,112.0,124.9,135.0,和40.3分配给颈,c - 5,即c - 4”,分别和颈- 1′。因此,基于上述光谱数据和比较文学,化合物的结构2提出了chromene框架如下所示。

复合3一个被孤立的橙粉R_f价值0.59n己烷/层(6:4)溶剂系统。红外光谱(KBr磁盘)显示在1723厘米宽吸收带⁻¹,1297厘米⁻¹,2917厘米⁻¹归因于C = C拉伸的芳环,切断拉伸,拉伸和碳氢键分别为甲基。的¹H NMR (CDCl₃、400 MHz表4)光谱显示两个质子紧身衣δ6.36 (1 h,d,J= 9.6 Hz)和7.77 (1 h,d,J= 9.6 Hz)归因于烯质子,其中一个是在前场的原因β内酯-安置的一部分。两个烯质子被观察到δ7.69 (1 h,d2”,J= 2.4 Hz)和6.82 (1 h,dH-3”,J= 2.4 Hz)相互耦合,这表明存在呋喃环连在芳环上。单线态的存在芳香质子被观察到δ7.36 (1 h,年代6)。prenyl组的存在证实了基于两个甲基信号的峰值δ1.72 (3 h,年代,H-4′)和δ1.74 (3 h,年代,H-5′),烯质子δ5.65 (1 h,t,2′)和含氧亚甲基δ5.0 (2 h,t)。后者表明prenyl集团是附加到氧气。

此外,上述¹H NMR模式表明复合chromene骨架与呋喃环融合。的¹³C NMR (CDCl₃、100 MHz表4)光谱显示共有16个碳原子。在前场的化学转变出现在的信号δ160.5加上信号δ114.6和143.8显示α,β共轭内酯一半。其他五季碳原子δ116.5、125.9、131.6、144.5和148.6被分配到c - 5,即C-9, C-10,分别和8。其中,三个碳原子的sp²含氧季碳原子,8,C-9, C-10芳环。

呋喃一半的次甲基碳原子被观察到δ146.6 (c - 2”)和106.7 (c - 3”),其中在前场的化学位移值前与氧原子的附件协议。在其他出现在芳甲烷δ113.2。含氧亚甲基prenyl的一部分出现δ70.2(也证实了部门- 135向下),而剩余的碳prenyl一半组出现在δ119.8 (c - 2′), 139.7 (c - 3′), 25.8,和18.2 (c - 4′和c - 5′),分别。因此,基于上述光谱特性,化合物3被发现在良好的协议与chromene骨架被俗名imperatorin (3)[12]。

复合4获得了作为一个黄色无定形粉末(熔点175 - 176°C)的吗R_f价值0.53n己烷/乙酸乙酯(4:6)溶剂系统。红外光谱(KBr磁盘)显示广泛的振动在3385厘米⁻¹、夏普吸收1600厘米⁻¹和1255厘米⁻¹归因于羟基一半(哦),芳香苯环,分别和切断。在2925厘米强吸收带⁻¹显示碳氢键的存在sp的拉伸³脂肪族的一部分。1730厘米的吸收带⁻¹显示存在的羧基一半的C = O伸展。

的¹H NMR谱(CDCl₃、400 MHz表5)透露芳香质子的存在δ7.178 (1 h,年代,H-5)和6.69 (1 h,年代面向H-8),表明两个对位的芳香质子,而在前场的质子的化学位移δ7.48 (1 h,年代H-4)建议β-安置的α,β共轭体系。的山峰δ3.19 (1 h,年代,H-3′)和δ3.17 (H,年代,H-3′)建议的非对映异构的亚甲基质子毗邻不对称碳(c - 2′)。这再加上含氧次甲基的存在信号δ4.73 (1 h,t)表明,呋喃环的存在。甲基被观察到的信号δ1.47(6小时,年代H-4“5”),δ1.37 (3 h,年代,H-5′),δ1.27 (3 h,年代,6′)。终端烯质子的存在δ5.09 (2 h,ddH-3”)加上烯质子δ6.17建议的存在重新安排prenyl一半的化合物。上面的¹H NMR模式表明,化合物的香豆素呋喃环骨架,减少一半是芳环和融合α,β重新安排prenyl组共轭内酯环轴承。

的¹³C NMR谱(CDCl₃、100 MHz表5)显示共有十八碳信号,在前场的高峰的δ162.3是由于酯羰基,而sp²含氧第四纪芳香碳出现在δ160.3(即)δ154.7 (C-9)。信号在δ71.7 (c - 4′)被分配到的含氧sp³季碳。剩余季碳原子被观察到的信号δ130.8(颈),124.3(其他),113.1 (C-10)和40.3 (C - 1”)。次甲基碳出现在δ138.1,123.4,97.2,90.0,和145.8被分配到C - 4 C - 5, 8, C - 2′,分别和C - 2”。此外,由于亚甲基碳原子光谱显示信号δ29.7和δ112.1被分配到颈- 3′和颈- 3”,也证实了部门- 135向下。对称碳信号观察c - 4“5”δ剩余26.1和甲基信号也被观察到δ其他26.0 c - 5′和24.3 (′)。因此,基于上述光谱特性,化合物4被发现在良好的协议与chromene骨架的俗名chalepin (4)[13]。

3.3。抗菌活性

提取和分离的化合物的抗菌活性c . anisata在20浓度检查吗μ对4 g / mL致病性菌株:两个革兰氏阳性细菌,金黄色葡萄球菌和b . substilis,两个革兰氏阴性细菌,大肠杆菌和铜绿假单胞菌(表6)。结果显示,heptaphyline的导数(1)和imperatorin(3)表现出对类似的抗菌活性金黄色葡萄球菌和b . substilis和14 mm区两个菌株的抑制作用,而与环丙沙星(15毫米)。Chalepin (4)也表现出对前途的抗菌活性金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌14和12毫米抑制区,分别与环丙沙星(15毫米)相比,而chalepin (4)透露更多的抗菌活性抑制区(16毫米)b . substilis相比与环丙沙星(15毫米)。一般来说,原油提取和纯粹的孤立的化合物都是无效的大肠杆菌病原体的浓度。

4所示。结论

这项研究是为数不多的企图孤立根的植物化学的成分c . anisata埃塞俄比亚的生物多样性。物化检测二氯甲烷/甲醇(1:1)和甲醇根提取物显示黄酮类化合物的存在,植物甾醇,香豆素类,酚类、生物碱、丹宁,萜类化合物,和免费的还原糖和皂甙的缺失。硅胶柱色谱分离的二氯甲烷/甲醇(1:1)和甲醇的根中提取了三个香豆素类(2 - 4),包括已知香豆素imperatorin (3)和chalepin(4)以及一个咔唑生物碱(1),导数已知的咔唑生物碱heptazoline。化合物2和4首次分离的根源c . anisata。化合物的结构特点的基础上,光谱数据(¹H核磁共振,¹³部门- 135 C NMR, IR)以及与文献报告相比。在协议与以前的研究中,广泛的传统使用的植物可能归因于其丰富的生物碱和香豆素成分。抗菌测试结果显示分离化合物显示有前途的抗菌活性金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,b . substilis。的导数heptaphyline (1)和imperatorin (3)表现出对前途的抗菌活性金黄色葡萄球菌和b . substilis(分别为14岁和13毫米的抑制)与环丙沙星(15毫米的浓度为20µg / mL)。Chalepin (4)透露更多的抗菌活性b . substilis(16毫米抑制区)与环丙沙星(抑制区15毫米)。这些药物的重要次生代谢产物的发现根提取带来了研究人员的注意,做更多的研究工作在药用植物的重要性。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者承认阿达玛科技大学拨款支持开展项目成功。作者感谢化学系,亚的斯亚贝巴大学核磁共振和红外光谱仪器。

补充材料

化合物的红外光谱和核磁共振光谱数据1- - - - - -4都是免费的手稿作为补充材料。(补充材料)

引用

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