毒性和安全性评价的Doxorubicin-Loaded Cockleshell-Derived碳酸钙纳米粒子的狗

文摘

阿霉素(阿霉素)是一种有效的抗癌剂与细胞毒性效应,限制其临床使用。这种效果是由于其非选择性自然导致损伤细胞的反应性氧自由基的释放。(CS-CaCO Cockleshell-derived碳酸钙纳米粒子₃NP)是一个pH-responsive载体与目标交付潜力。本研究旨在评估重复剂量的毒性影响管理DOX-loaded CS-CaCO₃NP在健康狗。十五只狗平均体重15公斤同样被随机分成5组。狗受到5剂量每三星期的时间间隔与生理盐水(我),(2)强力霉素,30毫克/米²和实验团体:CS-CaCO₃NP-DOX (iii)高剂量,50毫克/ m²(iv)临床剂量30毫克/米²,(v)低剂量20毫克/ m²。射线照片、心电描记法和血液样本收集每次治疗前血液学,血清生化、和心脏损伤评估。心脏和肾脏组织安乐死后收获了组织学和超微结构的评估。的累积剂量阿霉素150毫克/米²在15周披露重大影响体重,血液细胞,功能的酶,和心脏损伤生物标志物与心电图改变,心肌和肾组织形态。然而,狗CS-CaCO₃NP-DOX 150毫克/米²下面没有任何明显的毒性生物标志物的变化比那些给予生理盐水。这项研究证实了CS-CaCO重复剂量的安全管理₃NP-DOX(30毫克/米²在狗5周期。这一发现提供了机会与癌症的狗,可能需要长期政府强力霉素没有不利影响。

1。介绍

阿霉素(阿霉素)是一种有效的化疗药物用于造血的和坚实的管理不同来源的恶性肿瘤(1- - - - - -3]。在过去的二十年里,肿瘤学家的应用进行了广泛的探索,虽然其连续使用仅在临床设置阻碍由于其致命影响器官如心脏、肾脏和肝脏4,5]。阿霉素毒性通常倾向于线粒体氧化磷酸化和钙离子超载通过多个复杂的通路(2,6]。线粒体、肌浆网和核材料损失是由于活性氧自由基释放阿霉素的生物转化中半醌(6,7和ATP合成减少8]。这线粒体遗传物质破坏被认为是与DOX-induced呈正相关临床原发性心肌病(9,10]。

几个最近努力改善阿霉素的副作用(2,11),使用脂质和组装聚合物的阿霉素见Doxil™和Myocet™仍然伴随着轻微的毒性作用器官通过诱发炎性细胞释放(12),和其他配方显示与一些挫折,提高治疗效率,如不稳定和两相的释放动力学机制(13,14]。然而,减少毒性被记录与阿霉素脂质体共轭在老鼠模型中,虽然长期累积效应的脂质体没有记录15]。此外,一些有机大分子曾在纳米药物输送技术16,17]。

因此,这些不断增长的利益使用nanocarrier交付与很少或没有累积毒性抗癌组织鼓励寻找天然生物纳米材料在药物输送。阿霉素交付使用人们提倡减少毒性和提高治疗效果(11,16]。

Cockleshell-derived CaCO₃纳米颗粒(CS-CaCO₃NP),无机生物可降解药物载体,已经被用来在不同的实验研究提供强力霉素和多西他赛(18,19]。尽管癌症治疗的进步,它仍然具有重大威胁肿瘤学家在使用阿霉素在预防癌症转移的连续使用受阻的脱靶效应在增殖健康细胞(20.]。

先前的研究表明,无创技术用于监测心电图和超声心动图心脏损伤,建议在狗接受化疗的评价21,22]。然而,研究表明,部分缩短超声心动图与低特异性由于过度依赖预加载和postload效应在狗阿霉素在几个循环时间表(23]。由于这些,其他的无创性预测DOX-induced化验选择毒性,如血清心肌蛋白质具体量化,心肌肌钙蛋白,NT-pro-brain利钠肽(24,25),广泛应用于临床前和临床实践心脏损伤检测。

阿霉素治疗指数低的搜索需要有针对性的对阿霉素交付nanocarrier固体癌症的治疗。CS-CaCO₃nanocarrier共轭与阿霉素已经证明了控制和缓慢释放在体外和在活的有机体内研究在狗23]。然而,缺乏信息CS-CaCO的毒性和安全性₃狗NP-DOX在反复静脉注射剂量,需要定义最大容许剂量(MTD)的狗,它将作为在获得治疗成功的关键。此外,CS-CaCO的使用₃NP提供强力霉素是减少其脱靶效应通过其pH-responsive释放机制。因此,重要的是要注意,CS-CaCO₃nanocarrier相比其他商用合成聚合物分解缓慢在生理状态下生产^{2 +}和有限公司₂³⁻和释放阿霉素用于治疗目的。分解的产品可能是有用的在肌肉收缩,骨重建,和血液凝血因子,而碳酸盐组件将通过气体排泄交流。因此,本研究旨在评估重复剂量的毒性和安全性影响CS-CaCO管理工作₃NP-DOX健康狗作为替代航母的无机生物来源的阿霉素与特殊利益使用阿霉素引起的毒性和肾毒性生物标志物,组织病理学和超微结构的形态学变化进行评估。

2。材料和方法

2.1。材料

阿霉素公元霉菌素(阿霉素®)50毫克/ 25毫升瓶从Boryung制药有限公司购买,韩国。0.9%的生理盐水,犬类中位数水平以上病人(氨基端Pro-Brain利钠肽)酶联免疫试剂盒,和犬cTn-I / TNNI3(心肌肌钙蛋白I)酶联免疫试剂盒(E-EL-C0212)都从Elabscience购买,中国,储存在−20°C。所有其他化学物质均为分析纯,储存在25°C。

2.2。合成CS-CaCO₃NP和阿霉素转成合成CS-CaCO合并₃NP

的合成、药物加载,以及CS-CaCO的表征₃NP和CS-CaCO₃NP-DOX进行按照协议和程序由Danmaigoro et al。26]。合成CS-CaCO₃NP加载内容更高容量公式被选为阿霉素交付。

2.3。在健康的狗重复剂量毒性和安全性研究

2.3.1。动物处理和伦理语句

总共十五(15)健康成年男性本地狗(犬属狼疮后裔9-24岁)个月,15 - 25公斤,从政府高级官员获得Bandaraya吉隆坡英镑。狗的年龄由牙科识别根据Iohara et al。27),从狗的记录。狗清洗(洗澡),分离使用Bayticol®(Flumethrin)和除虫吡喹酮20毫克/公斤。狗被保持在23±1°C 12小时光和12小时黑暗周期与饲料和访问随意水。所有程序涉及动物保健和处理的指导方针和批准制度动物保健和使用委员会(IACUC)(芬欧蓝/ IACUC / AUP-RO13/2016),马来西亚Putra大学,加拿大动物保健指导委员会的建议的护理和使用实验动物是严格遵守28,29日]。狗被血液学的评估,确认临床健康犬恶丝虫的血涂片,和身体检查,没有狗放在化学治疗剂两时期的适应环境。

2.3.2。排斥与包容的选择标准研究

狗与辨认疾病症状(呕吐、腹泻、心脏杂音或心律失常),坏的气质,或者可怜的体况评分(1/5)被排除在外的选择和招生进入实验研究。然而,狗与正常血液学和血清生化参数,否则健康,良好的气质,选择良好的体况评分,包括在这项研究。狗被安置在动物研究设施(ARF),马来西亚Putra大学兽医学院。

2.4。协议

狗被随机分配到5组()。狗受到缓慢静脉输液(0.9%氯化钠)5剂量每三星期的时间间隔(i)与生理盐水(0.9%氯化钠)(负控制),(2)阿霉素30毫克/ m²(积极的控制),实验组:CS-CaCO₃NP-DOX (iii)高剂量,50毫克/ m²(iv)临床剂量30毫克/米²,(v)低剂量20毫克/ m²按照阿霉素管理日程。第0天(评估政府之前的第一天第一个周期),从获得的数据样本作为基线值。临床和生物废弃物的研究都是根据兽医处理肿瘤指南使用抗癌药物如前所述,全心全意地et al。30.]。

2.5。生理和临床观察

日常物理,对毒性临床症状观察和死亡率。体重、直肠温度和心率都作为基线测量和监控每周两次在这项研究。

2.6。样本收集血液病学的概要文件、血清生化和心脏损伤生物标志物检测的

血液样本被收集在肝素化EDTA和血液学的分析光管,血清酶的功能,和心脏损伤生物标志物,经过2周的适应环境。连续收集血液样本在每个周期。样本立即分析完整的血细胞计数使用Horiba医疗Scil兽医ABC +分析仪(Scil兽医。美国)与全血离心机(离心机埃普多夫5424 r,德国)15分钟在4000 rpm,血清是储存在−80°C进行分析。函数使用维度Xpand最加酶进行分析综合化学系统(思想维度®李世默™200综合化学系统,西门子、德国)评估水平的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸酐(克雷亚)、血尿素氮(BUN)测定肌酐激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)根据协议所描述的Chang et al。31日]。

2.7。毒性评估使用血清生物标志物

犬心肌肌钙蛋白I (cTn-I)和犬NT-pro-brain利钠肽(犬中位数水平以上病人)被用作心脏损伤的主要生物标志物评估由于其选择性和特异性心脏损伤根据卡特赖特et al。32和莎瓦亚等。33]。夹心ELISA方法采用使用犬cTn-I / TNNI3(犬肌钙蛋白I)和犬类中位数水平以上病人(n端Pro-Brain利钠肽)酶联免疫试剂盒(E-EL-C0210)特定的血清样本收集的狗被处理根据制造商的指示和建议(Elabscience生物技术有限公司,中国)。每个在微型板块的光学密度在450 nm波长阅读使用分光光度计(Tecan无限200 Pro标,美国)。

2.8。胸部影像学评估

胸部x光照片的正交视图被暴露在射线照相系统的灵感如前所提出的Gulanber et al。34]。DRX-1移动摄影(全国橙色+ Carestream图像系统3543 c 10040高频模型,美国)被用来评估心脏大小使用椎心得分(家用)如前所述Surachetpong和Teewasutrakul35]。这些程序进行一次在研究的开始,一次的最后3周后5日剂量,与长时间运行和短轴用厘米表示。

2.9。导电性和心脏功能评估使用心电图(ECG)

心电图记录在所有实验的狗在毕业典礼前排除心脏功能障碍和心脏室放大和重复的最后三周后5日剂量使用心电图描记的系统(Cardiofax宝石- 9020 k、日本、日本)根据协议所描述的阿尔维斯de Souza,卡马乔36]。

电极放置在狗的站立位置与鳄鱼剪辑放置在皮肤下面手肘关节和膝关节上方小面积与导电介质添加到加强接触。心脏的电活动进行评估的持续时间1分钟,与纸质心电图在50毫米/秒的速度,电压校准1厘米相当于1 mV,规模和50 Hz过滤器,用绝缘的手带着狗手动克制在气喘吁吁的站立位置没有使用手套,肌肉震颤,摇晃,至少3 QRS复合物在跟踪记录。

心率、海浪、间隔、持续时间的P波,公关间隔,QRS波群,和QT间隔,P波振幅都被记录下来。然而,增加或减少20%的心电图参数相比,预处理获得的价值被认为是改变由于之前报道的干预Mauldin et al。37]。

2.10。安乐死,尸检和形态测量学

狗安乐死3周后5日最后一次剂量。尸体进行尸检。相对的心脏和肾脏被移除心脏体重测量。了一个口子乳头肌和和弦的肌腱暴露左和右心室壁和室间隔。心室壁厚度的相对在毫米使用游标卡尺测量心脏重量计算公式采用从Fracasso et al。38]:

2.11。组织病理学分析

心脏(左和右心室壁和室间隔)和肾组织固定在10%缓冲福尔马林处理和组织学评价描述Schafer-Somi et al。39]。大约4块切割µ2235大小的切片机(徕卡切片机,美国)最后,沾染了哈里斯的苏木精和伊红和马森的三色的组织化学和光学显微镜下检查(美国纽约徕卡DM4M),与Moticam Pro 282 5.0 mp (Motic图像软件+ 2.0吐温,香港)。组织损伤的程度、坏死和炎症反应是评估使用定性和半定量的分级系统研究小组由一个病理学家蒙蔽,正如前面所描述的Erboga et al。40]。

2.12。超微结构的研究

选择心脏和肾组织超微结构的研究。组织收窄至2 - 4毫米片和固定在2.5%戊二醛含有0.2钠甲次砷酸盐缓冲(pH值7.2)12小时在4°C和进一步处理按照肋方法描述Bakar et al。41]。嵌入式块是修剪形成一个梯形的形状。超薄的部分(50 - 70纳米厚)是减少使用钻石刀,这是安装在一个铜网格,然后沾醋酸双氧铀及柠檬酸铅。下的组织被认为和检查高分辨率透射电子显微镜(HRTEM、JEOL JEM2100F,美国)在80千伏操作员失明组,随机和5到8显微图。

2.13。统计分析

所有数据分析使用GraphPad棱镜version 7(棱镜GraphPad软件公司,美国)。描述性统计和图表用于临床体征和观察。然而,在所有组织样本大小是平等的,结果表示为平均值和标准偏差,和单向方差分析(方差分析)与土耳其的多个范围测试方法被用于多个比较血液学的参数和血清生化价值,而克鲁斯卡尔-沃利斯检验被用于心脏生物标志物和组织学组织得分,一个被认为具有统计显著性值< 0.05的分析。

3所示。结果

3.1。生理和临床观察和死亡率

没有观察到的死亡率和毒性的证据在研究期间所有的狗。然而,厌食症,软水样粪便,皮肤病变,都表示为脱发与瘙痒面部区域,观察后第四周期(累积剂量120毫克/米²)的自由阿霉素2的3只狗作为一个预定的毒性标志如图1(一)。

3.1.1。免费的强力霉素和CS-CaCO的效果₃在体重NP-DOX在不同累积剂量

减少体重的狗给30毫克/ m²自由观察阿霉素后立即第二剂量约为9%的体重失去后的累积剂量150毫克/米²。同样,体重下降(8.3%)也被观察到狗CS-CaCO₃NP-DOX(50毫克/米²)的累积剂量200毫克/米²比最初的体重。

然而,观察体重的增加在狗CS-CaCO₃NP-DOX 30毫克/米²和20毫克/米²3周后第二个剂量如图1 (b)。减少体重观察狗给自由阿霉素的累积剂量(150毫克/米²CS-CaCO)和累积剂量₃NP-DOX(250毫克/米²)是重要的比那些给予生理盐水(和在过去3周内),分别研究。然而,体重的增加也观察到显著的狗给CS-CaCO累积剂量₃NP-DOX(100毫克/米²相比),下面这些免费阿霉素()在过去6周的实验。

3.1.2。免费的强力霉素和CS-CaCO的效果₃直肠温度NP-DOX在不同累积剂量

直肠温度略有增加从0.5到1°C观察后12小时内所有的狗。然而,直肠温度的增加在政府免费的累积剂量阿霉素120毫克/米²比正常盐水和CS-CaCO累积剂量₃NP-DOX(120和150毫克/米之间的剂量范围²)具有统计学意义 , ,和 ,药品监督管理局分别在3(图1 (c))。

3.1.3。免费的强力霉素和CS-CaCO的影响₃在心率NP-DOX在不同累积剂量

没有显著变化观察心率在15周的自由阿霉素和CS-CaCO₃NP-DOX政府在不同剂量,与正常心音来自窦房结除了狗给予免费的累积剂量阿霉素120毫克/米以上²这表现出浅心音。也有显著降低心率在上面的狗的累积剂量90毫克/米²而狗给予生理盐水()如图1 (d)。

3.2。验尿

没有显著的变化CS-CaCO狗的尿液样本₃NP-DOX相比在观察不同剂量给予生理盐水(图1 (e))。然而,细微的变化观察尿液颜色从transparent-yellowish色彩琥珀色8小时后自由阿霉素的第三周期管理。

3.3。胸放射性的发现,椎心的大小

正确的横向的射线图像狗免费阿霉素30毫克/ m²累积剂量为150毫克/米²显示一个大心脏心室边境的轮廓与颅隆起靠近胸骨。动脉圆锥的心尖略流离失所的背腹侧的视图(图2)。

意味着增加椎心评分(家用)观察1.36±0.55 v的狗给予免费的累积剂量阿霉素150毫克/米²与基线相比VHS价值。VHS的增加并不显著的狗给CS-CaCO组₃NP-DOX在不同累积剂量比相应的基线VHS值()。类似地,p值的累积剂量狗CS-CaCO₃NP-DOX(250毫克/米²),CS-CaCO₃NP-DOX(150毫克/米²),CS-CaCO₃NP-DOX(100毫克/米²)是0.2354,0.3394和0.1088,分别各自相比基线值(图2)。

3.4。心电图描记的发现与累积剂量的自由阿霉素和CS-CaCO₃NP-DOX

心室率没有变化是观察和公关间隔在狗与基线值相比管理药物(图3),分别。记录的心电图P波的时间大幅减少在狗累积剂量的自由阿霉素150毫克/米²与基线相比P波()(图3)。此外,P波的变化在正常参考范围内的狗CS-CaCO₃NP-DOX和PII振幅的变化也观察到,尽管增加PII振幅狗给予免费的阿霉素(图8)。然而,显著降低QRS时间是狗免费检测阿霉素累积剂量(150毫克/米²)比初始基线数据()(图3)。此外,心电图QRS轴也揭示了一个显著的下降在狗累积剂量的自由阿霉素(150毫克/米²)和CS-CaCO₃NP-DOX(250毫克/米²),和 ,分别(图3)。

然而,有一个意味着显著增加狗免费给予强力霉素的QT间隔3周后的累积剂量150毫克/米²(),在那些CS-CaCO₃NP-DOX 250毫克/米²((图)与基线值3)。

3.5。血液学、血清生化和生物标志物的心脏损伤

3.5.1。免费的强力霉素和CS-CaCO的效果₃NP-DOX在不同累积剂量在血液学的概要文件

血液学的剂量相关具体变化观察到红细胞(红血球)、血小板(plt)细胞,白细胞(白细胞)显著变化在不同层面上各自的细胞水平相比,狗给生理盐水。显著变化观察狗的累积剂量90毫克/米以上²和CS-CaCO₃NP-DOX 150毫克/米²以上的细胞水平相比狗给予生理盐水。与加拿大皇家银行(),经过累积剂量的免费强力霉素150毫克/米²、PLT(< 0.05), 60毫克/米的累积剂量²,都有一个意思是显著减少白细胞的累积剂量90毫克/米²而狗给予生理盐水()(图4)。但是,没有显著改变细胞狗给CS-CaCO概要文件₃NP-DOX(30毫克/米²)的累积剂量150毫克/米²观察下面比狗给予生理盐水。

3.5.2。免费的强力霉素和CS-CaCO的效果₃NP-DOX在不同累积剂量对血清酶功能水平

肝脏、肾脏和结构膜损伤生物标志物监测,没有显著增加的狗给CS-CaCO高山的平均值₃NP-DOX 150毫克/米²下面比基线值和平均血清水平的生理盐水(和)(图4)。然而,观察平均水平的显著变化的狗给予免费的累积剂量阿霉素120毫克/米²和CS-CaCO₃NP-DOX以上剂量150毫克/米²基线值和平均水平相比,在那些给予生理盐水和 ,分别(图4)。此外,类似的模式意味着血清AST高程是观察和狗给予免费的强力霉素90毫克/米²和CS-CaCO₃NP-DOX的累积剂量200毫克/米以上²分别(图4),而平均ALT水平明显高于游离阿霉素和CS-CaCO₃NP-DOX的累积剂量150毫克/米以上²狗的平均水平相比,给予生理盐水 ,分别(图4);然而,LDH、CK克雷亚,包子都显示类似的模式的海拔酶水平与基线值和相应的水平在狗给生理盐水(图4)。

3.5.3。量化的血清犬心肌肌钙蛋白I (cTn-I)

血清心肌肌钙蛋白浓度cTn-I狗在此期间的研究显示在图5。血清cTn-I明显高于狗给予免费的阿霉素(30毫克/米²),在累积剂量(90毫克/米²)(),在实验的最后15周的累积剂量150毫克/米²(),而血清cTn-I控制狗的。也有增加血清生物标志物在狗CS-CaCO₃NP-DOX 50毫克/ m²(150毫克/米²)()和累积剂量250毫克/米²()与对照组相比。此外,意思是狗的血清心肌肌钙蛋白水平给予免费的累积剂量阿霉素90毫克/米以上²相比是明显高于给定的累积剂量的CS-CaCO吗₃NP-DOX 150毫克/米²下面(图5)。

3.5.4。量化的血清NT-Protein脑利钠肽(proBNP)

显著增加proBNP记录累积剂量后60毫克/米²狗给予免费的阿霉素30毫克/ m²相比proBNP水平在对照组(狗)。此外,显著提升中位数水平以上病人在狗CS-CaCO的累积剂量₃NP-DOX 50毫克/ m²(200毫克/米²观察)相比,平均浓度相应的对照组水平。然而,中位数水平以上病人血清CS-CaCO的累积剂量₃NP-DOX 50毫克/ m²(80毫克/米²及以上)的平均水平明显不同于中位数水平以上病人在狗的累积剂量60毫克/米²自由的阿霉素(图5)。

3.6。总在验尸解剖交替

严重,轻微的精确观察出血在心脏的左心室壁2的3狗累积剂量的游离阿霉素150毫克/米²吞下边缘的肝脏和右叶圆出现在所有3狗比的控制狗的肝脏生理盐水。然而,肾功能正常,没有出现严重病变。相比之下,狗的心脏和肾脏给予不同剂量的CS-CaCO₃NP-DOX总值和生理盐水没有显示任何病理损伤,如图6。

3.6.1。形态测量学的体重,心脏重量,和心室质量测量

心脏重量和身体重量显著增加狗给予免费的累积剂量阿霉素150毫克/米²相比那些给予生理盐水(),而狗给予不同剂量的CS-CaCO₃NP-DOX没有任何明显的变化相比狗给生理盐水(图7)。有显著减少左心室壁厚的狗给予免费的累积剂量阿霉素150毫克/米²鉴于CS-CaCO相比₃NP-DOX累积剂量为250毫克/米²()。然而,既不增加也不减少右心室厚度中可观察到所有的狗(图7)。

3.7。在心脏和肾脏组织病理学改变组织由于累积剂量的阿霉素和CS-CaCO₃NP-DOX

微观的调查显示,没有观察到心肌和病理损伤肾组织的狗给生理盐水,鉴于CS-CaCO类似₃NP-DOX累积剂量为150毫克/米²和下面。然而,狗的重大变化是观察到的组织给予免费的累积剂量阿霉素150毫克/米²和狗CS-CaCO累积剂量₃NP-DOX高于150毫克/米²。

心室心肌组织学部分和肾组织的狗给生理盐水和CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量为150毫克/米²出现正常的,如图8。狗的左心室的组织学部分累积剂量150毫克/米²自由的阿霉素显示多个领域的心肌细胞间空泡形成大小不同的破坏集群的作用(以淋巴细胞为主的炎性浸润细胞(图8)。

此外,焦myocytolysis也出现在一些地区出现心肌纤维的肌原纤维错乱与光环液泡,消耗糖原,从而取代的胶原蛋白相比左心室心肌组织切片的狗给生理盐水保留其心肌结构形态与中央核密度(图完全不同8)。此外,没有狗的心室肌细胞破坏和细胞质的桥梁的作用在狗CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量为150毫克/米²或较低浓度如图8。

局灶性出血区域观察细胞间地区狗给予免费的肌原纤维强力霉素和更高的CS-CaCO累积剂量₃NP-DOX高于150毫克/米²(图8)。左和右心室的心肌形态正常,纺锤状中央核无炎性细胞浸润在狗狗生理盐水和CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量为150毫克/米²或更少(图8)。

中可观察到肾,局灶性坏死肾实质导致变形的薄壁组织的地区大量的嗜碱性的管状细胞和暗指出肾小管上皮细胞核的分裂,一些领域的出血,轻微扩张几个肾近端小管的狗给累积的自由阿霉素150毫克/米²(图8)。此外,减少肾肾小球细胞结构与肾小球萎缩导致扩大鲍曼荚膜空间中观察到自由的狗给累积剂量阿霉素150毫克/米²与对照组相比,显示正常肾小体的外观形态与丛肾小球和肾小球囊腔的空间和缩小近曲小管内衬立方细胞,如图8。然而,类似的焦点与肾小管坏死区域中可观察到核分裂和破坏上皮狗CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量为250毫克/米²与对照组相比(图8)。没有观察到的管状改变,肾脏肾小球和薄壁组织的地区的狗CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量为150毫克/米²下面(图8),分别。

一个显著差异()观察细胞间空泡形成之间的左心室组(χ²= (180)= 26.211)。此外,显著差异观察心室心肌组织学结构的狗给予免费的累积剂量的阿霉素150毫克/米²和那些CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量250毫克/米²150毫克/ m²和100毫克/米²与 ,分别比对照组(图9)。

通过实验观察到的空泡形成心室壁组织是肌原纤维的重大损失(直接相关χ²= (180)= 40.138,)。心室壁的空泡形成更狗给予免费的累积剂量的阿霉素150毫克/米²和那些CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量250毫克/米²与和 ,分别与对照组相比,在狗CS-CaCO没有显著差异₃NP-DOX的累积剂量150毫克/米²或更低()和()与对照组相比(图9)。

胞质间质细胞的显著差异渗透和观察出血组(χ²= (180)= 13.068,和χ²= (180)= 18.166,分别),明显高于狗给予免费的累积剂量的阿霉素150毫克/米²和那些CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量250毫克/米²150毫克/ m²和100毫克/米²与 ,分别给予生理盐水相比(图9)。

3.7.1。组织化学评价累积剂量的阿霉素和CS-CaCO的效果₃NP-DOX心脏和肝脏组织

组织学部分心肌的狗给生理盐水和CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量为150毫克/米²下面显示类似的正常形态。他们表现出正态分布之间的胶原蛋白肌原纤维(图10)。然而,明显沉积胶原原纤维的间隙中可观察到肌原纤维之间的空间心肌细丝在狗累积剂量的自由阿霉素150毫克/米²(图10)。此外,也观察到沉积致密胶原蛋白矩阵之间的myomysium肌原纤维和出现在心肌组织(图中材料10)。

3.8。狗的超微结构变化在心脏和肾脏组织中累积剂量的阿霉素和CS-CaCO₃NP-DOX

心肌的电子显微照片的狗给予免费的累积剂量阿霉素150毫克/米²暴露出大量的线粒体断裂明显肿胀,嵴迷失方向(图11)。肌原纤维的取向与空泡形成不规则的细胞间隙内的肌原纤维与集群内的电子致密物沉积肌节intermyofibrillar细胞质如图11。此外,分散与自由真空空有液泡的心肌细胞,肌丝的局部破坏,Z-band总在细胞质中的核糖体集群密切indicatives左心室肌原纤维损失的电子显微照片的狗给予免费的累积剂量阿霉素150毫克/米²(图11)。相似的变化在TEM观察心肌的狗CS-CaCO给予高剂量₃NP-DOX的累积剂量(250毫克/米²),标志着观察线粒体肿胀和破裂线粒体在狗自由的累积剂量阿霉素150毫克/米²(图11),而一个明确常规肌原纤维的取向和不同的池线粒体与椭圆形至纺锤状核观察心肌组织在狗生理盐水和CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量为150毫克/米²下面(图11)。

肾组织的TEM的狗给生理盐水显示正常的建筑形态和微绒毛顶端区域的近曲小管线粒体潴泡和神经包膜膜与不同的髓鞘(图11),这是类似CS-CaCO₃NP-DOX的累积剂量150毫克/米²和下面。此外,肾原子核周围的边缘分布染色质材料密切关系正常的线粒体,内质网,基底膜(图11)。然而,这些免费强力霉素150毫克/米²和CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量为150毫克/米以上²有扩张近曲小管,扭曲的线粒体潴泡,泡肾胞质内的地区,和大量的溶酶体和过氧化物酶体的存在(图11)。

4所示。讨论

目前,一些创新的发展见证了在纳米领域的具体应用医学(42]。尽管化疗制剂发展的进步,毒性nano-DOX配方仍然作为一个重大挫折,因为大多数使用的有机nanocarrier自己造成组织损伤(42),使肿瘤学家没有别的选择,而是修改剂量的阿霉素或把它与另一种细胞毒性药物可能不足以抑制肿瘤转移和增长1]。

本研究的主要目的是评估CS-CaCO的安全性和毒性₃NP-DOX健康的狗,这只能通过评估组织损伤生物标志物和细胞学检查的组织更加强调心肌和肾组织。来自本研究的发现,这是缺乏科学文献,将作为指导剂量选择,了解临床应用的安全裕度的公式。

脱发是一种常见的重复剂量毒性作用表现政府强力霉素的临床和实验研究43]。然而,阿霉素为CS-CaCO的封装₃NP防止不受控制的释放和脱发的狗的表现。狗给予免费的脱发观察阿霉素在协议是什么报道Todorova et al。44]在狗重复剂量的20 - 30毫克/米²在20天犬乳腺肿瘤的管理。

一般来说,体重下降是一个细胞干扰和生物标志物指标的安全毒性研究报道Patel et al。45和陈等。46]。众所周知,化疗引起全身体重损失(43]。身体减肥中观察到自由的狗有累积剂量阿霉素同意报告Boussada et al。43在威斯特老鼠和符合发现佐藤et al。47在老鼠和DeFrancesco et al。48在狗。在这项研究中,减肥可能与厌食症,自我平衡的身体功能,和电解质的代谢失衡,早些时候在啮齿动物给予强力霉素(49]。

然而,减少体重损失与CS-CaCO观察₃NP-DOX累积剂量为150毫克/米²可以归因于生物利用度的降低阿霉素的持续控制释放阿霉素CS-CaCO吗₃NP。这最终有助于减少细胞毒性效应与自由CS-CaCO强力霉素和进一步解释了安全的本质₃NP-DOX累积剂量为150毫克/米²比免费的在一个等效剂量阿霉素。

轻微增加直肠温度记录早些时候类似森的报告等。50),5、9日小时内体温增加政府抗癌的老鼠。这种短暂的高程可以与强力霉素和免疫细胞之间的免疫反应。

血细胞的变化特别是红细胞、血小板和白细胞计数都是强力霉素剂量依赖、符合没有报告的研究结果等。5];Tacar et al。51),这可能是由于骨髓抑制效应的强力霉素和iron-DOX交互,从而引起红细胞膜破裂之前报道的Vici et al。52)和Pahouja et al。53)由于强力霉素没有限制其影响不仅独自癌细胞还增殖造血的细胞。

白细胞减少的观察狗给予免费的强力霉素是同意贾德森et al。(54),与阿霉素政府报告中性粒细胞减少和血小板减少。此外,类似的减少观察红细胞和白细胞DOX-induced毒性在鼠标4),猫(55,56),和狗57]。重要的是要注意,直接血小板溶解导致的血小板减少症见过与阿莫西林和长春新碱诱导血小板裂解和报道引起血小板减少症(58,59]。有趣的是,CS-CaCO₃NP-DOX,当在剂量30毫克/ m的方案²没有改变血液学的细胞相比,其等效剂量的自由阿霉素30毫克/ m²。然而,当CS-CaCO₃NP-DOX 50毫克/ m²,它预计最大第三后可能会更高剂量浓度在循环可能导致效果观察。

血清生化评价配置文件提供了支持证据CS-CaCO的毒性和安全性₃NP-DOX相比自由阿霉素。从CS-CaCO阿霉素的缓慢释放₃NP可能阻止过度交互的阿霉素与正常细胞增殖导致细胞损伤是由于氧化反应(40]。阿霉素引起破坏肌细胞的膜,它能刺激大脑释放CK和AST末梢循环(60),因此作为一个肌肉组织损伤指标,与ALT酶在肝脏这解释了细胞膜完整性(60]。

高山和AST的狗,在累积剂量120毫克/米²以上的自由阿霉素,康科德Chen等人的报告。60)和类似的结果鑫et al。61年),在狗、AST和CK增加归因于心肌中断由于氧自由基释放阿霉素代谢途径。

AST的增加和高山自由阿霉素的累积剂量和CS-CaCO浓度更高₃NP-DOX高于120毫克/米²表明细胞损伤的肝细胞导致流出酶的循环绝对与组织学发现观察肝脏组织。

哲人et al。62年]报道LDH和CK增加阿霉素引起的心肌损伤的早期阶段的老鼠。这个报告是符合我们发现狗在LDH和CK水平给予免费阿霉素,尽管LDH的增加不是特定的心肌损伤;然而,CK的累积剂量增加免费强力霉素120毫克/米以上²观察相比在狗给定水平相当于CS-CaCO累积剂量₃NP-DOX,提示心肌损伤和肾损害。肌酐和尿素的变更在狗累积剂量的免费强力霉素150毫克/米²和更高的CS-CaCO累积剂量₃NP-DOX 250毫克/米²是类似于观察到汉et al。63年在小猎犬狗4周重复剂量的喜树碱,具有类似的机制作用与阿霉素的拓扑异构酶酶抑制。

cTn-I目前作为心脏损伤的生物标志物应用于人类和动物(64年- - - - - -66年];因此,它是用于访问在迷你猪心脏损伤(65年,67年)和大鼠(65年,68年]。然而,增加cTn-I水平被用来进一步证实在心肌组织病理变化。有趣的是,cTn-I水平增加的模式类似于观察到的老鼠免费重复剂量的阿霉素1毫克/公斤的卡通水平大幅上升的42天后血清水平达到高原水平在70天69年]。

此外,中位数水平以上病人也是免费诊断试验的监测和评价心脏损伤不管它是否充血性心力衰竭70年,71年特定于cTn-I],尽管少。类似的作品,吴et al。70年]报道大鼠的血清BNP浓度的增加短期和长期重复剂量的阿霉素毒性研究。然而,椎心得分是用来评估心脏在胸腔内大小。狗的平均增加心脏大小给予免费的累积剂量阿霉素150毫克/米²与狗相比CS-CaCO₃NP-DOX同意的结果Nakayama et al。72年在狗),VHS是用来评估心脏大小。然而,心脏轮廓观察增加了心脏x光照片的不透明度,他发现了Guglielmini et al。73年),液体增加透明度和改变心脏的大小和形状轮廓的狗与充血性心力衰竭。

目前心电描记法作为监测心脏安全评估工具;然而,一些临床心脏安全评估应用这个工具来检测心脏异常的导电率(7]。在这项研究中,观察了重大的变化,表现出明显的室上性心律失常与心室扩张和收缩功能障碍是心肌病的暗示。QRS波群的变化、QRS轴和QT间隔在狗累积剂量的自由阿霉素150毫克/米²符合变化DOX-induced心肌损伤报道Kulkarni和偶像7与吴的报告),在协议et al。70年在老鼠和佩雷拉否决权等。74年在健康的狗。这些都是室上或室性心律失常的迹象,因此心肌病的表现,这可能是由于肌原纤维破坏和肌丝定向障碍冲动堵塞心脏。然而,封装CS-CaCO₃NP-DOX的缓慢释放阿霉素可以阻止心肌损伤。

室上性心律失常的观察到剂量相关,这可能是由于多个操作阿霉素的心脏电生理活动;然而,这些研究结果类似的报道佩雷拉否决权等。74年在狗与心肌功能紊乱的迹象,累积剂量的强力霉素150毫克/米以上²。

增加心脏重量和身体重量比狗给予免费的阿霉素可能归因于减少体重。这些发现符合专家的报告等。62年]。因此,增大肌浆网和线粒体肿胀可能归因于增加心脏重量和身体重量比的结构性变化通常观察到DOX-induced心肌病(7]。

左心室壁厚同意的报告Nakayama et al。72年],心室壁变薄与扩张型心肌病相关。此外,心肌的变化符合结果报告的野田佳彦et al。75年)和工作等。76年]DOX-induced毒性具有独特的特性不同于其他心脏损伤如心肌空泡形成,水肿,肌纤维膜损害与间质纤维化有关。这些组织病理学变化可能是由于自由基释放iron-dependent交互和放松管制的钙通道与细胞导致无控制回流泵内和外的细胞。

狗的正常心肌组织的组织学结构CS-CaCO₃NP-DOX的累积剂量150毫克/米²下面进一步提供证据表明没有毒性诱导的心肌组织的狗类似于发现观察到拉赫曼et al。77年在兔子在脂质体阿霉素封装聚合物nanocarrier。狗给CS-CaCO心肌迷失方向观察到₃NP-DOX更高以上累积剂量200毫克/米²他的发现杨et al。78年在健康的老鼠和Maksimenko et al。69年]以来,老鼠从CS-CaCO释放阿霉素的浓度₃NP是非常低的累计直接细胞损伤引起。

此外,间质纤维化心肌组织中观察到的狗免费阿霉素和CS-CaCO高剂量₃NP-DOX(累积剂量250毫克/米²)符合慢性模型显示心肌细胞损伤和纤维化(79年,80年),这可能是由于心肌细胞补充行动向再生肌纤维发生变性或坏死。

肾脏是一个主要的排泄器官,直接蒽环霉素的目标,导致肾毒性表现为薄壁组织和细胞损伤81年]。然而,缝内的载体分子裹入隔膜由于用于药物输送载体分子的大小导致肾小管组织损伤(82年]。肾小球和肾小管损伤在我们的研究中观察到的病变在啮齿动物据Cianciolo et al。83年和没有等。5在啮齿动物和小型猪动物模型,分别。此外,我们的研究结果还同意死因等人的作品。84年)集群的核材料观察结果从脂质过氧化自由基的生产。

Shivakumar et al。85年)报道,阿霉素有可能诱发肾组织损伤导致的肾小球肾炎在这项研究中观测到的。阿霉素诱导肾毒性的机制股票类似的途径的毒性是通过多因子的诱导的途径,从氧化应激、线粒体功能障碍,转导通路的变化(86年]。的一个基本的细胞变化观察到由于DOX-induced破坏线粒体形态,揭示了心肌的超微结构检查和肾组织。同样,cardiorenal毒性报道了佩雷拉et al。87年)和Berthiaume et al。88年重复自由阿霉素管理时,肌纤维方向障碍和心肌线粒体与吞下空泡形成破裂观察心脏组织的健康的动物模型。然而,有趣的是,在这个工作中,剂量提出了重复剂量CS-CaCO临床剂量方案管理₃NP-DOX 30毫克/ m²5治疗没有证人cardiorenal毒性作用导致cardiorenal结构和功能变化与狗相比同等剂量给免费阿霉素30毫克/ m²。

阿德里亚细胞中观察到狗的存在是由于肌浆网扩张据阿迪et al。89年)在心肌组织损伤。所有的变化符合观察到病变组织病理学观察,光学显微镜,类似于先前的报道在DOX-induced毒性(89年,90年]。

狗的心肌重复剂量的CS-CaCO₃NP-DOX累积剂量为150毫克/米²在临床团剂量30毫克/米²没有任何明显的超微结构变化与形态结构在光学显微镜观察。这是由于持续的少量的阿霉素浓度从CS-CaCO发布₃NP-DOX在正常生理微环境的报道在体外分析(18]。然而,在相反的研究结果报道Dhingra et al。91年在线粒体信号,阿霉素诱导小鼠的坏死。

阿霉素的肾脏也有针对性的器官如前所报道Salouege et al。92年)和Cianciolo et al。83年),但阿霉素的顺序器官亲和力少相比,心脏是由于心磷脂浓度。周et al。93年]表明,近端小管的顶端区域的微绒毛和丰富的足细胞负责分泌nephrin podocin,狭缝结构组件的隔膜。观察超微结构的改变是类似于变化报道Ayla et al。94年道)和et al。95年)在他们的工作,清晰可见内皮细胞的液泡化与肾小球基底膜增厚和足突细胞足细胞凋亡的过程。脚的变性过程中足细胞观察进一步证实了微粒的肾小球闭塞空间观察到在同一组织在组织病理学分析。

5。结论

总之,本研究表明DOX-loaded cockleshell-derived CaCO₃NP低毒性和nephropathic效果在更高的累积剂量(250毫克/米²)作为自由阿霉素相比健康的狗。因此,这项研究表明CS-CaCO₃NP可以降低阿霉素的脱靶效应在狗与狗提高生活质量的目的,需要长期的治疗机制。本研究进一步揭示了重复剂量的安全性和耐受性CS-CaCO管理₃NP-DOX健康狗由于低数量的阿霉素接触重要器官,从而减少毒性和肾毒性的风险。

数据可用性

生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

在这项研究中使用的协议都是符合国际动物保健和委员会的指导单位。

的利益冲突

没有利益冲突的这篇文章的作者之一。

确认

作者承认拿督阿兹博士的帮助下Tengku易卜拉欣的超微结构组织解释和评价和Hilman先生公司芬欧汇川集团动物研究机构的技术支持在动物处理和药物输送。这项工作是财务支持的原型开发研究资助计划(PRGS 5532300)马来西亚的高等教育。

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