Antileishmanial 5、3′-Hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanonePicramnia股薄肌图尔。(Picramniaceae)水果:在体外和在活的有机体内研究

文摘

种Picramnia属在民间医学用于治疗或预防皮肤疾病,但只有少数物种生物活性和化学成分的研究。p .股薄肌图尔。是一个本地物种来自中美洲和南美洲,虽然它的果实可食用,植物化学的分析或药用的使用这个物种是不知道。在搜索候选人antileishmanial药物中,这项工作旨在评估的antileishmanial活动p .股薄肌图尔。在在体外和在活的有机体内研究。只有ethanolic提取的水果显示leishmanicidal活动。多数主义代谢物是5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone乙醚,表现出较高的活动l . panamensis (v)(EC₅₀17.0 + 2.8毫克/毫升,53.7μu - 937 M)和低毒性在哺乳动物细胞,选择性指数> 11.8。在活的有机体内研究表明,解决方案实施中的黄烷酮(2毫克/公斤/天)或奶油(2%)诱发的临床改善和没有毒性与CL仓鼠。总之,这是第一次报告的隔离5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone的p .股薄肌图尔。leishmanicidal活动归因于这个黄烷酮也是首次报道。最后,在体外和在活的有机体内leishmanicidal活动报告在这里5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone提供了一个更大的对antileishmanial药物发现和开发前景。

1。介绍

利什曼病是一种热带疾病所致利什曼虫寄生虫的影响在99个国家约1200万人。大约有3.5亿人感染,每年发生二百万例新病例的危险(1]。尽管发病率高,治疗的替代品很少和有严重的缺陷相关的主要使用高剂量和长期管理导致中度到重度的毒性(2]。传统药物严重不良反应的存在表明需要新疗法治疗利什曼病。植物来源的天然产物潜在工具对这些发现和几个世纪以来一直用于治疗经验寄生虫病对世界各地的人们,刺激的临床和实验室研究3]。

Picramnia物种(Picramniaceae,以前苦木科)是常用的在民间医药治疗或预防皮肤病,外部溃疡(溃疡),和皮肤过敏4]。在这些植物化学的调查Picramnia导致物种隔离的代谢物(5,6),主要是三萜烯(7- - - - - -9),蒽酮和蒽醌苷10- - - - - -14),而蒽酚酮(10- - - - - -12,15与细胞毒性),抗菌、抗真菌、抗寄生虫活动(16- - - - - -18]。Picramnia股薄肌图尔。是安第斯地区的本地物种在南部和中美洲19]。虽然水果p .股薄肌图尔。是可食用的20.),报道的植物化学成分分析或药用的使用这个物种还不为人知。此外,没有报道antileishmanial活动的Picramnia物种。

出于代谢物的出现与之前在几个杀寄生虫药活动Picramnia物种及其传统使用的皮肤问题,本研究旨在发现antileishmanial活性和细胞毒性在提取和代谢物的树叶和水果p .股薄肌图尔。在这里,的存在5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone在p .股薄肌图尔。水果和antileishmanial活动在体外和在活的有机体内是首次报道。

2。材料和方法

2.1。一般的实验程序

¹HNMR和¹³C NMR光谱(CDCl₃)被记录在力量AMX 300核磁共振光谱仪,使用经颅磁刺激作为内部标准。硅胶60(默克公司0.063 - -0.200网)是用于柱层析法和预镀硅胶板(默克公司60 F_254年,0.2毫米)是用于薄层色谱。

2.2。植物材料

植物材料收集的圣埃琳娜,“部门Silletero,麦德林的直辖市,安蒂奥基亚省部(哥伦比亚),2011年1月2540 m.o.s.l。凭证标本的标本存放在安蒂奥基亚省大学(4588 f . Alzate)。

2.3。准备提取和局部净化

材料在烤箱干35°C 48小时。树叶粉(86克)p .股薄肌图尔。提取先后与正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯,乙醇,最后一个过滤器在室温和集中在真空给相应的提取(2.35(2.7%),5.63克(6.5%)、4.59 g(5.3%),和9.59克(5.3%)、职责)。另一方面,37.34 g的干果提取乙醇浓度后,深棕色粘贴了,7.88 g (21%)。观察的主要化合物通过TLC(流动相,二氯甲烷)。然后,提取受到了硅胶柱层析洗脱梯度的一步n -hexane-ethylacetate(100: 0, 90: 80: 20, 70: 30、60: 40岁,50岁:50、40:60,30日:70年,20:80年,10:90和0:100年,每200毫升)获得20分数(F1-F20)薄层色谱资料收集的基础上。分数F4-F10被认为最有趣的,由于喷洒茴香醛试剂后出现红点。黄烷酮(350毫克,4.4%)被制备薄层色谱使用孤立的从这个分数n-hexane-ethyl醋酸(4:1)混合物。

5、3′-Hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone。¹HNMR (CDCl₃,300 MHz):δ2.83 (H-3β弟弟,17.2 Hz), 3.12 (H-3α弟弟,17.2赫兹),3.85(年代,哟₃),3.96(年代,哟₃),5.37(2,弟弟,,12.9 Hz), 5.78(哦),6.09 (H-8 d赫兹),6.12 (- 6 d赫兹),6.92 (H-5′d赫兹),6.98(6′,弟弟,8.3赫兹),7.09 (2′,d,赫兹);12.07(哦)。¹³C NMR (CDCl₃,75 MHz):δ43.21(颈),55.71(哟₃),56.07(哟₃),78.94 (C - 2), 94.27(8), 95.13(其他),103.17 (C-10), 110.69 (C - 5′), 112.70 (C - 2′), 118.18(其他′),131.56(颈- 1′),145.96 (C - 3′), 147.03 (C - 4′), 162.87 (C-9), 164.14 (C - 5), 168.00(即),196.02 (C = O)(见补充资料在网上可用的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/978379)。

2.4。研究在体外细胞毒性的

细胞毒性活性的提取物和纯化合物在人类U937细胞行评估通过MTT法,如前所述[21,22]。简而言之,在RPMI 1640培养基培养细胞补充10%胎牛血清(的边后卫),和1%的抗生素(penicillin-streptomycin (10.000 U /毫升)100.000细胞/毫升和六个浓度的每个产品(200、100、50岁,25岁,12.5和6.25μg / mL)。细胞培养介质仅被用作负控制(没有毒性),而细胞暴露于两性霉素B (AmB)是积极的控制(毒性)。细胞培养在37°C, 5%的公司₂72小时;然后,每个产品的影响细胞的生存能力是决定酝酿暴露和未暴露的细胞与10 3小时μL ((3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子。MTT减少线粒体琥珀酸脱氢酶是紫色甲瓒,然后用100可溶性μL /异丙醇50%,10% SDS和它的浓度是由光密度在570 nm光谱仪(基准BioRad)。每个产品和未暴露的细胞浓度测试一式三份在至少两个不同的实验。

的在体外细胞毒性被确定为生存和增长的百分比从光学密度获得抑制介绍过o。d。邓肯()为每个实验条件使用公式:可行性(%)=(介绍过o。d。邓肯细胞/治疗未经处理的细胞)×100,对应于100%未经处理的细胞生存能力。反过来,生长抑制(%)计算100−%可行性。生长抑制(%)为每个实验条件获得的数据被用来计算半致死浓度(LC₅₀Probit分析()23]。化合物分类使用任意规模如下:有潜在毒性:LC₅₀< 100μg / mL;中等毒性:信用证₅₀> 100 < 200μg / mL;和潜在的无毒:LC₅₀> 200μ克/毫升。

2.5。研究在体外Antileishmanial活动

每个提取或代谢物的活动获得p .股薄肌图尔。决心在佛波醇12-myristate 13-acetate-differentiated u - 937细胞感染细胞内无鞭毛体的l . panamensis (v)表达绿色荧光蛋白基因(MHOM /公司/ 87 / UA140pIR-GFP) (24,25]。一毫升的细胞被分发到每个24-well板(300.000细胞/毫升RPMI 1640中、100 ng / mL)。盘子在37°C,孵化有限公司5%₂在72个小时,然后用磷酸盐缓冲盐水洗两次(PBS)。u - 937细胞被感染了固定相promastigotesl . panamensis (v)35的比例:1(寄生虫:细胞)。盘子被孵化3小时34°C, 5%的公司₂孵化后,细胞被洗两次与PBS和孵化24小时37°C, 5%的公司₂。感染细胞暴露在四个系列浓度稀释的每个产品(100年,25岁,6.25和1.56μg / mL RPMI 1640中)。并行,细胞培养介质中仅被用作控制感染的(负控制)和细胞暴露于AmB被用作控制leishmanicidal活动(积极的控制)。经过72小时的潜伏期在37°C, 5%的公司₂细胞被使用胰蛋白酶/ EDTA溶液和洗两次通过离心法与PBS 10分钟在1100 rpm, 4°C。然后,分析了细胞在一个氩激光流式细胞分析仪(mpl Cytomics FC 500)通过阅读在488 nm兴奋和525海里排放。一万事件是计算。感染细胞的比例是由点情节分析而寄生负载使用直方图计算平均荧光强度分析。每个浓度在一式三份评估至少两个独立的实验。

在体外antileishmanial活动确定感染的比例(可行的寄生虫感染细胞内)根据流式细胞术分析小额信贷机构单位为每个实验条件使用公式:= %感染(FMI治疗感染细胞/ FMI治疗感染细胞)×100 FMI未经处理的可行的寄生虫感染细胞对应于100%。然后,%减少感染的计算使用公式:%抑制= 100−%感染。%抑制了每个实验条件是用来计算的有效浓度50 (EC₅₀Probit分析()23]。化合物的分类根据其antileishmanial活动使用任意规模如下:活跃:电子商务₅₀< 20μg / mL;适度活跃:电子商务₅₀20 >和< 50岁μg / mL;或潜在的一般:电子商务₅₀> 50μ克/毫升。索引的选择性(是)计算了相关的细胞毒性与antileishmanial活动使用的公式:= LC₅₀/电子商务₅₀。

2.6。5的治疗反应和毒性评价,3′-Hydroxy-7, 4′-dimethoxyflavanone在活的有机体内

黄烷酮的治疗反应测试仓鼠(Mesocricetus auratusCL)模型(26]。简单地说,以前麻醉(40毫克/公斤氯胺酮和甲苯噻嗪5毫克/公斤)仓鼠在promastigotes的背侧皮肤接种l . braziliensis (v)(MHOM /公司/ 88 / UA301-EpiR-GFP) (5×10⁸寄生虫/ 100μL PBS)。三个实验小组(每个),由四个男人和四个女人,相应编码:答:黄烷酮纯净,B:黄烷酮2%奶油,和C:马(积极的控制)。黄烷酮治疗纯(40μ每剂L),黄烷酮奶油(40 mg剂量),或马(200μg每剂)后立即开始开发一个典型的溃疡(感染后4 - 6周)。黄烷酮(A和B组)局部使用每日为28天。反过来,MA (20μL, 10毫克/毫升)应用intralesionally,也为28天的每一天。动物福利是监督日常在研究过程中。这两个领域的溃疡和体重测量每两周从治疗开始到研究结束的(完成治疗后三个月)。评价的总体时间点,是预处理日(TD0),治疗结束(PTD0)和后处理天30岁,60岁,90 (PTD30, PTD60, PTD90 resp。)。在研究结束时,仓鼠是人道地牺牲,验尸后,肝脏和肾脏活检组织病理学研究。皮肤活检(从伤病发生的地方)也被qPCR确定寄生虫负载。

每个治疗的有效性评估比较病灶大小之前和之后的治疗。治疗结果的研究记录治愈(治愈100%的面积和完整的病变消失);临床改善(减少损伤的大小> 30%的区域);失败(增加病灶的大小);或复发初始治疗后病变(复活)。比较治疗组之间的有效性任意分数被分配到每个治疗:3 =治疗,临床改善,2 = 1 =复发,0 =失败。

黄烷酮的毒性纯、黄烷酮霜或马是评估根据肝和肾的功能仓鼠在处理和未经处理的动物如前所述26]。天TD0和第8天的治疗(TD8),血液从心脏和血清被离心分离5000 g×2 - 3分钟。血清是储存在−80°C到使用。肝脏和肾脏功能评估通过测量水平的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血尿素氮(BUN)测定,并使用商用肌酐工具包(生物系统公司、西班牙)。肝和肾的功能也在健康评估(未感染和治疗)仓鼠。毒性的治疗是通过比较血清ALT水平决定的,包子,肌酐和后期肝脏和肾脏组织学变化。组织学变化的严重性也分级,其严重程度,中度或轻度。

2.7。量化的寄生虫负载

量化的寄生虫在病变是基于单拷贝基因的扩增利什曼虫DNA聚合酶(管家基因)使用实时定量PCR (qPCR)和其他地方所述的标准曲线(27]。最初,600 bp的DNA片段l . panamensis (v)放大了常规PCR (T1000 thermocycler, BioRad)并使用QIAquick凝胶萃取纯化设备根据制造商的说明和产品的结扎InsTAclone pTZ57R / T向量。然后,DH5α细胞(美国英杰公司)与构造转换。构造是纯化,然后,存在将放大120 bp在最初600个基点的序列克隆片段。每个质粒的拷贝数是决定基于克隆片段的大小和插入的大小。标准曲线范围从1到100万寄生虫的日志增加10成立。的QuantiFast SYBR绿色存在工具包(试剂盒Inc .)、美国)是用于qPCR。PCR扩增进行SmartCycler II(美国造父变星,桑尼维尔CA)使用最后一个25的体积μ包含100 L ng的DNA, 12.5μL反应的混合,每个引物100 nmol / L, nuclease-free水。每个测量使用PCR的扩增效率LinReg程序。组织样本的加权和细胞溶解500毫升裂解缓冲(100毫米氯化钠10毫米Tris-HCl 25毫米EDTA,和0.5% SDS, pH值8.0)和0.1毫克/毫升蛋白酶K的孵化一个水浴4小时56°C。然后,DNA提取一毫升的苯酚:氯仿:isoamylic酒精(25:24:1)。在1700转离心10分钟后,水层小心地删除,用90%乙醇洗净,在500×g离心2分钟,在室温下干燥。颗粒resuspended于300年μL(热压处理过的nuclease-free水。DNA是量化使用NanoDrop 1000(美国NH热科学)在260 nm的吸光度和储存在−20°C到进一步使用。

2.8。数据分析

对于每个参数,平均值与标准差(平均数±标准差)计算。双向方差分析数据进行了分析。如果认为重要差异。统计分析了棱镜6.0(美国圣地亚哥Graphpad棱镜CA)。

3所示。结果

多数主义化合物(4.4%的收益率)被确认为5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone后,核磁共振分析和高分辨率质量(图1)。

Ethanolic从树叶和乙酸乙酯提取物(E-EtOH-l和E-EtAc-le)和乙醇提取物水果(E-EtOH-fr)可能为u - 937细胞(LC无毒₅₀> 200μg / mL)(表1),而正己烷和二氯甲烷提取物叶子(E-He-le E-DiClMe-le, resp)高细胞毒性(LC₅₀22.4和29.1μg / mL,分别地。,as shown in Table1)。AmB,高细胞毒性药物,显示信用证₅₀37.5μg / mL,马在u - 937 (LC无毒₅₀> 1000.0μg / mL)。的5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone并没有表现出对人类巨噬细胞细胞毒性(信用证₅₀> 200μg / mL)。

数据代表平均值±SD细胞毒性的50%致死浓度(LC₅₀)和leishmanicidal活动的50%有效浓度(EC₅₀):E-EtOH-fr: ethanolic从水果中提取;E-EtOH-le: ethanolic从树叶中提取;树叶E-DiClMe-le:二氯甲烷提取物;树叶E-He-le:己烷提取物;树叶E-EtAc-le:乙酸乙酯提取物;(选择性)指数=信用证吗₅₀/电子商务₅₀。

E-EtOH-fr显示中度leishmanicidal活动细胞内无鞭毛体l . panamensis (v)(EC₅₀35.7μg / mL)(表1),而E-EtOH-le E-EtAc-le一般对细胞内无鞭毛体l . panamensis (v)(EC₅₀> 100μg / mL)。不幸的是,E-He-le和E-DiClMe-le (EC₅₀> 22.4 > 29.1μg / mL, resp。) leishmanicidal活动浓度对细胞毒性的宿主细胞利什曼虫寄生虫。正如所料,AmB和马是高度活跃的对细胞内无鞭毛体l . panamensis (v)(EC₅₀0.06和6.8μg / mL,职责)。的5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone显示高(EC antileishmanial活动₅₀17.0μ53.7 g / mL,μ米)的生物活性5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone高度选择性与提取物> 11.8,水果和树叶是< 2.0(表吗1)。AmB和马有一个625.0 > 147.1,分别。

治疗l . braziliensis (v)40μL / 2毫克/公斤体重/天/ 28天的黄烷酮(A组)导致临床改善4/6仓鼠减少40 - 80%的病变大小,失败在1/6仓鼠,仓鼠和复发的1/6。寄生虫负载在这群动物寄生虫是392.3 + 192.7 /毫克的组织。另一方面,黄烷酮霜治疗40毫克/ 2% /天/生产28天(B组)治疗在2/6仓鼠病灶大小的减少(100%);临床改善(> 80%的减少他们的损伤大小)在2/6仓鼠和复发在2/8仓鼠(活化初始治疗后溃疡PTD45或PTD75)。这类寄生虫寄生负载为2405.0±4312.6 /毫克的组织。最后,治疗intralesion注入200 MAμ克/天/一周两次/ 28天(C组)治愈仓鼠5/6和1/6仓鼠有经验的复发,治疗后15天。仓鼠治愈寄生虫的数量是218.5±393.7每毫克组织寄生虫。仓鼠的寄生虫负荷处理黄烷酮溶液(A组)中发现类似仓鼠对待马(C组),虽然它是仓鼠中发现不同处理黄烷酮霜()。

治疗效果是基于结果的差异在每个不同阶段的评价:治疗(PTD0)和PTD30年底,PTD60 PTD90,使用任意规模中描述的材料和方法。获得的治疗结果的平均值在每个时间点每个治疗组总结在图2。局部治疗的有效性与局部黄烷酮纯(A组)类似于观察intralesion注入马(C组)在任何时间点在随访中除了在PTD90反应是高在C组的差异没有统计学意义()。另一方面,局部黄烷酮霜(B组)的有效性高于黄烷酮在PTD90纯。这些差异没有统计学意义()。

一些动物在每个治疗组经历了减肥< 10%。因此,减肥并不是与毒性相关的治疗5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone。的肝功能异常,血清ALT水平包子和肌酐肾脏功能障碍,测量8天在这个黄烷酮治疗,感染和未经处理的仓鼠了水平的提高与黄烷酮在治疗后的血清ALT和面包配方,而肌酐水平轻度增加治疗后马。然而这些水平类似仓鼠感染但未经处理(表中观察到2)。差异没有统计学意义()。

另一方面,动物没有观察组织学改变归因于治疗处理5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone。相比之下,仓鼠马处理诱导下面的变化,观察在肝脏:暗晦,空泡的脂肪变性,karyomegaly, binucleation和色素沉着。这些发生在中度到重度的学位。马治疗也引起肾功能的变化,包括空泡的和脂肪变性和binucleation轻度至中度学位。

4所示。讨论

皮肤利什曼病是一种传染性的疾病,可以导致严重的心理和社会歧视,特别是脸部和身体的其他可见的区域是妥协。在此,在搜索新的或更好的药物来治疗CL, antileishmanial活性和细胞毒性产品来源于叶子和果实p .股薄肌图尔。进行了测试在体外。只有ethanolic提取水果温和leishmanicidal活动细胞内无鞭毛体l . panamensis (v)巨噬细胞和细胞毒性和antileishmanial活性和毒性的多数主义化合物提取验证在活的有机体内。

多数主义化合物被确认如下。同样的黄烷酮以前隔绝Chromolaena odorata(l)(菊科)[28),艾定无性系种群。maritima(菊科)[29日),而Heliotropium glutinosum菲尔。(Heliotropiceae) [30.)和命名eriodictyol-7 4′二甲基醚。然而,的存在5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone作为一种多数主义化合物Picramniaceae家族是首次报道。此外,活动5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone对l . panamensis (v)和l . braziliensis (v)报告还首次。与其他黄烷酮类已报告有活动利什曼虫物种和t . cruzi;因此,例如,5、6、7-trihydroxy-4-methoxyflavanone从甲醇分离提取的Baccharis婆罗对promastigotes(菊科)活动l . braziliensis (v),l . (l) amazonensis和l . chagasi (l)(集成电路₅₀49.0、53.0和57.0μg / mL, resp)和胞内无鞭毛体l . chagasi (l)(集成电路₅₀45.0μg / mL)。这5、6、7-trihydroxy-4-methoxyflavanone也在trypomastigotes活跃吗t . cruzi(集成电路₅₀20.4μg / mL)没有细胞毒性小鼠腹腔巨噬细胞,但相当多的恒河猴肾细胞毒性(LLC-MK2)和tumoral单核细胞THP-1细胞(LC₅₀31.0和49.0μg / mL,职责)。31日,32]。同样的,5、4′-dihydroxy-7-methoxyflavanone(sakuranetin-2)孤立也b .婆罗积极反对promastigotes吗l . amazonensis (l),l . braziliensis (v),l . (l)专业,l . chagasi (l)(集成电路₅₀51.9,45.1,52.6,38.4μg / mL,职责)。这个黄烷酮也积极对细胞内无鞭毛体l . chagasi (l)与集成电路₅₀值为43.7μ克/毫升。没有毒性Balb / c小鼠腹膜巨噬细胞观察。然而,这种化合物显示相当大的肾细胞毒性LLC-MK2和人类单核细胞THP-1细胞(IC₅₀25.9和39.5μg / mL,职责)。这个黄烷酮也十分活跃t . cruzitrypomastigotes(集成电路₅₀20.2μg / mL) (33]。

此外,5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone报告是在细胞内无鞭毛体活跃但不活跃的无菌无鞭毛体l . panamensis (v)(数据没有显示)。这个结果表明,黄烷酮可能需要代谢内化后宿主细胞产生代谢物负责leishmanicidal活动,是见过用五价锑(33]。虽然由宿主细胞代谢的可能性仍有待确定,antileishmanial活动的5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone在细胞内寄生虫可能与螯合铁(Fe)的能力剥夺这种必需营养素从细胞内形成34]。

的5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone管理2毫克/公斤体重/天(解决方案)或2%(奶油)在28天能够诱导治疗或临床改善CL仓鼠实验感染l . braziliensis (v)。虽然黄烷酮的有效性低于马的治疗结果在研究结束时,寄生虫负载两组相似的治疗。这些结果证实,5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone能杀死细胞内的无鞭毛体l . braziliensis (v)出现在溃疡,但效率是影响不仅通过剂量还制药配方。没有治疗产生不利影响体重,组织学形态、或血液的ALT水平,包子,肌酐归因于黄烷酮的毒性作用。因为水平治疗后观察到类似感染/未经处理的仓鼠,变化可能是相关的利什曼虫感染过程。此外,氮的化合物可能会增加由于氨基酸的高降解或高蛋白饮食和并不总是与肾脏的变更(35]。

5。结论

在此,5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone首次报道在Picramniaceae家族的一个物种。活动对l . panamensis (v)和l . braziliensis (v)也是首次报道。总的来说,生物测定试验结果观察到在这个调查表明5、3′-hydroxy-7 4′-dimethoxyflavanone隔绝p .股薄肌图尔。代表承诺antiprotozoal导致药物来治疗CL的进一步发展。治疗反应的黄烷酮改善可以通过增加数量的活性成分配方,增加政府的频率或延长治疗的日子。最后,这项工作贡献新的知识化学成分和生物活性的小说p .股薄肌图尔。,a native species from Central and South America.

缩写

肤色线:	皮肤利什曼病
信用证50:	半致死浓度
电子商务50:	有效浓度50
是:	索引的选择性。

伦理批准

动物试验机构伦理委员会支持所有程序(没有行动。77 - 2012)。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢简历台面,她帮助生物化验。Colciencias (ct - 357 - 2011)和安蒂奥基亚省大学(Cidepro和Estrategia de Sostenibilidad 2013 - 2014)。他们也感谢女士a·阿尔瓦雷斯语言审查。

补充材料

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