评价GABA ergic传输调制作为小说的功能目标管理的多发性硬化症:探索抑制GABA对Glutamate-Mediated会引起

文摘

多发性硬化(MS)是一种自身免疫性炎症疾病的中枢神经系统(CNS)的沟通能力在大脑和脊髓神经细胞彼此会受损。一些目前的发现表明谷氨酸的作用会引起女士的开发和发展过度释放谷氨酸导致ionotropic和metabotropic受体的激活,从而导致积累有毒细胞质Ca^{2 +}和细胞死亡。然而,它已被观察到,gamma-aminobutyric acid-A (GABA_一个)受体位于神经终端激活突触前Ca^{2 +}/ calmodulin-dependent信号抑制depolarization-evoked Ca^{2 +}从孤立的涌入和谷氨酸释放神经终端,它表明GABA的潜在含义_一个受体的女士在管理这个概念证明,我们试图探讨选择性GABA的潜力_一个受体受体激动剂或积极的变构调节剂和GABA(安定和苯巴比妥钠)_一个管理水平增强剂(丙戊酸钠钠)女士的实验性自身免疫性脑脊髓炎的检查他们的活动(运算单元)模型大鼠和cuprizone-induced脱髓鞘模型小鼠。在这项研究中,丙戊酸钠钠被发现显示最好的动物模型的活动而苯巴比妥钠显示适度的活动。然而,安定被发现是无效的。

1。介绍

多发性硬化(MS)是一种自身免疫性炎症疾病的中枢神经系统(CNS)的沟通能力在大脑和脊髓神经细胞彼此会受损(1]。的一个主要潜在病理条件下的发展是轴突的髓鞘脱失(女士2]。一些目前的发现表明谷氨酸的作用会引起女士的开发和发展最主要的兴奋性神经递质谷氨酸是中枢神经系统,已被证明有一个中心的角色在一个复杂的通信网络之间建立住宅脑细胞(3]。这证明了女士的大脑核磁共振光谱学研究显示谷氨酸水平升高在急性病变[女士4]。过量释放谷氨酸导致ionotropic和metabotropic受体的激活,从而导致积累有毒细胞质Ca^{2 +}和细胞死亡。然而,一个有趣的发现GABA的在这个上下文_一个受体位于神经终端激活突触前Ca^{2 +}/ calmodulin-dependent信号抑制depolarization-evoked Ca^{2 +}从孤立的涌入和谷氨酸释放神经终端(5),这表明GABA的潜在含义_一个受体在女士的管理因此,防止excitotoxic神经元损伤,通过抑制谷氨酸释放通过gaba ergic调制,可以作为一种有效的治疗方法。

本研究侧重于评估选择性GABA的潜力_一个受体受体激动剂或积极的变构调节剂和GABA水平增强子女士的管理实验动物模型。特别是,安定、苯巴比妥钠和丙戊酸钠钠筛选模型诱导女性活动实验性自身免疫性脑脊髓炎纯种老鼠和cuprizone-induced C57BL / 6小鼠模型女士。安定和苯巴比妥钠都是积极的变构GABA的调节器_一个而丙戊酸钠作为伽马氨基丁酸钠增强器通过抑制GABA转氨酶异化GABA或块再摄取到神经胶质和神经末梢6]。

2。材料和方法

2.1。材料

得到了安定、盐酸米托蒽醌和喹硫平延胡索酸酯作为礼物样本inta制药、艾哈迈达巴德,印度。丙戊酸钠钠得到作为礼物样本Chemclone行业,艾哈迈达巴德,印度。苯巴比妥钠从印度阿博特有限公司购买,孟买,印度。氯化钠、氯化钾、葡萄糖、磷酸氢二钠,磷酸二氢钾、盐酸、冰醋酸和获得Qualigen精细化学品,孟买,印度。所有的试剂和化学物质用于研究均为分析纯。多聚甲醛、percoll、蔗糖、EDTA二钠、三羟甲基氨基甲烷缓冲液,消息灵通的钠盐、小苏打、氯化钙、氯化镁、4-aminopyridine,谷氨酸,河畔⁺(氧化型),醋酸甲苯基紫斑,和luxol快速蓝色污点从Himedia实验室pvt Ltd .)购买印度孟买。Cuprizone,完全弗氏佐剂(CFA)和L-glutamic酸脱氢酶解决方案(牛肝来源)从西格玛奥德里奇,美国。异氟烷(拉曼和Weil pvt Ltd .)蹄兔,印度)用于麻醉的动物。肝素钠从生物大肠有限公司购买,海得拉巴,印度。去离子水为高效液相色谱制备内部使用Milli-Q积分净水系统(微孔Elix,德国)。

2.2。动物

女纯种老鼠体重150 - 200 g和雄性C57BL / 6小鼠体重25到30通用汽车获得b . v . Patel会动物屋的中心,艾哈迈达巴德。动物住房和处理进行按照良好实验室规范(GLP)中提到CPCSEA指南。委员会的动物屋登记为目的的实验动物的管理和监督,社会公正和赋权,印度政府,见注册号1661 / PO / / 12 / CPCSEA。综述了所有实验协议和受理机构动物伦理委员会之前启动的实验。

2.3。在大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)模型

2.3.1。运算单元感应、药物治疗和临床症状的评分

,诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎脊髓孤立于女性纯种老鼠如前所述,肯尼迪et al ., 20117]。然而,transcardial灌注的大鼠是根据描述的方法计et al ., 20128前),隔离的脊髓。这之后,从孤立的大鼠脊髓匀浆制备方法Shevach报道后,20019),与某些修改。短暂,一克冷冻大鼠脊髓均质在13000 rpm冰1毫升0.9% w / v氯化钠(1:1的比例)为3到4分钟。匀浆是由涡流乳化完全弗氏佐剂在高速给最后一个1:2 (v / v)脊髓比CFA(注:这是非常重要的添加佐剂抗原,而不是相反)。准备最终乳液(50μL)然后注入后拦路贼(subplantar区域)的老鼠在所有团体除了正常的控制。动物体重变化和临床症状的观察日常运算单元根据以下范围:0 =没有疾病;0.5 =远端柔软的尾巴;1.0 =弛缓性尾巴;2 =轻度下肢轻瘫;3 =中度下肢轻瘫;3.5 =一个后肢瘫痪;4 =前肢的弱点与下肢轻瘫或截瘫和/或清音膀胱;5 =完全后肢瘫痪;6 =四肢瘫痪,垂死的状态,或死亡10]。

然而,与脊髓匀浆免疫之前,动物被分成6不同组的6:我,没有免疫控制收到了生理盐水;第二组(疾病控制集团),免疫,然后收到生理盐水腹腔(车辆的所有治疗);第三组(积极的控制),免疫,然后收到盐酸米托蒽醌(剂量:0.5毫克/公斤体重腹腔内);第四组,免疫,然后收到安定(剂量:2.0毫克/公斤体重腹腔内);集团V,免疫,然后收到了苯巴比妥钠(剂量:30.0毫克/公斤体重腹腔内),第六组,免疫,然后接受丙戊酸钠钠(剂量:200.0毫克/公斤体重腹腔内)。米托蒽醌作为一个积极的控制在这个实验中,因为它目前已被FDA批准用于治疗和女士也被报道在动物减少的迹象和严重性实验性自身免疫性脑脊髓炎(11]。的剂量安定、苯巴比妥钠和丙戊酸钠钠是一些以前的报道中使用的相同的CNS-related活动大鼠(12- - - - - -14]。所有的药物都是每天服用一次的21天。

22天,所有的动物都使用过量的异氟烷麻醉实施安乐死。其次是制备cerebrocortical突触体不连续percoll梯度法和谷氨酸释放试验(执行15]。

2.3.2。制备Cerebrocortical突触体

额叶皮质被从所有的动物和突触体分离纯化在不连续percoll梯度如前所述16]。10%和23%之间的突触体,沉积物percoll乐队,在最终的收集和稀释30毫升的消息灵通的缓冲介质组成的140毫米氯化钠,氯化钾5毫米,5毫米NaHCO₃1毫米MgCl₂,1.2毫米Na₂HPO₄消息灵通的,10毫米葡萄糖,和10毫米,pH值7.4。由此产生的样本然后在27000×g离心10分钟在4°C。形成的颗粒是因此resuspended 5毫升的消息灵通的缓冲区中,蛋白质含量是决定使用micro-BCA蛋白测定试剂盒(皮尔斯猫# 23235,热科学、罗克福德,,美国)。随后,谷氨酸释放试验进行synaptosomal丸。球应该保存在冰和中使用3 - 4 h。

2.3.3。谷氨酸释放试验

谷氨酸释放cerebrocortical突触体决定使用一个试验中,外源性谷氨酸脱氢酶和辅酶ii⁺用于一些氧化脱羧的谷氨酸释放。这导致NADPH的生成,然后发现fluorimetrically [17]。Synaptosomal小球在玫瑰resuspended缓冲介质和孵化37°C 3 - 4分钟促进等离子体膜的极化。随后,1毫米辅酶ii⁺、50单位/毫升谷氨酸脱氢酶和1.2毫米CaCl₂是补充道。由此产生的样本是培养5分钟,之后的3毫米4-AP (4-amino吡啶)添加到刺激谷氨酸释放。荧光然后用荧光谱仪(SL174 Systronics印度有限公司)在激发和发射波长359 nm和468 nm,分别。数据点每隔10秒了。4-AP(钾通道阻滞剂)是本研究中使用稳定的等离子体膜电位突触体,后来导致增加细胞质免费的Ca^{2 +}通过的电压门控钙浓度^{2 +}频道。最后,这将导致生成的自发动作电位能够触发exocytotic释放谷氨酸(15]。

2.4。老鼠Cuprizone-Induced脱髓鞘

2.4.1。模型开发和治疗

36个雄性C57BL / 6小鼠()被用于这项研究。实验组、给药途径和治疗运算单元模型的协议是一样的。然而,药物的剂量如下:安定,1.0毫克/公斤体重;苯巴比妥,20.0毫克/公斤体重;丙戊酸钠钠,150.0毫克/公斤体重。的剂量安定、苯巴比妥钠和丙戊酸钠钠是一些以前的报道中使用的相同的CNS-related小鼠的活动(13,18,19]。喂养动物的饮食引起的急性脱髓鞘是含有0.2% cuprizone (bis(环己酮)oxaldihydrazone)混合到一个地面标准啮齿动物食物随意一段4周。食物是刚做好的cuprizone是一种不稳定的化合物。控制动物收到正常的颗粒的饮食。安定、苯巴比妥钠和丙戊酸钠钠对28天的日常管理从当天的cuprizone治疗。喹硫平延胡索酸酯(剂量:10毫克/公斤体重)作为一个积极的控制,因为它已经被报道,慢性管理奎硫平变弱的髓磷脂分解cuprizone-exposed老鼠的大脑皮层(20.]。所有的药物都是每天服用一次的28天。

2.4.2。组织准备、染色和显微镜

29天,组织进行评价。所有的动物都麻醉使用异氟烷麻醉和灌注transcardially 10 U /毫升肝素在磷酸缓冲盐(pH值7.4)其次是4% w / v多聚甲醛。大脑被孤立和5μm切片的日冕部分是使用一个旋转切片机(型号0126、Yorco、印度)。幻灯片被沾luxol快速蓝色和孵化隔夜60°C紧随其后的是二次染色与醋酸甲苯基紫5分钟。组织切片观察中所有可能的变化IX51奥林巴斯光学显微镜下解剖(奥林巴斯光学有限公司,东京,日本)。这些照片被奥林巴斯TL4相机中。观测结果比较来检测髓鞘脱失的程度。

3所示。结果

3.1。临床症状的评分模型运算单元

在不同临床症状的实验性自身免疫性脑脊髓炎动物组如图1。苯巴比妥钠和丙戊酸钠钠的临床评分治疗动物大大减少()相比患病组的动物。此外,抑制上述治疗组的临床症状的模式类似于阳性对照组。然而,没有明显的症状被发现在抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎安定治疗动物疾病对照组相比,表明它可能不是有效的防止疾病进展。

3.2。谷氨酸释放试验模型在实验性自身免疫性脑脊髓炎

谷氨酸释放的数量(nmol /毫克蛋白)在不同时间间隔的突触体动物的所有组如图2。结果显示过度释放谷氨酸的突触体病对照组(指示谷氨酸会引起)的发生而释放的谷氨酸水平的突触体动物正常的控制和阳性对照组明显低()。然而,观察无显著差异的谷氨酸释放档案的动物接受安定和苯巴比妥的对照组相比。这表明他们并没有产生任何抑制谷氨酸释放。谷氨酸钠丙戊酸钠治疗动物显示发布概要文件类似于正常的和积极的对照组,也显著不同()而患病的动物。

3.3。组织学观察Cuprizone-Induced脱髓鞘的老鼠

Luxol快40岁以下的蓝染色观察冠状部分x放大如图3有髓鞘的轴突被染色蓝而nonmyelinated轴突染粉红色。成功的模型开发的确认是确认该地区突出的髓鞘脱失的胼胝体病变的对照组。然而,组织的正常和积极控制动物显示蓝色彩色乐队表明有髓鞘的轴突的存在。在这个实验中,观察到,丙戊酸钠钠抑制髓鞘脱失,多数胼胝体轴突的彩色蓝而其他一些彩色粉红色。然而,苯巴比妥显示适度保护cuprizone-induced髓鞘脱失(薄和强烈的蓝色颜色的有髓纤维部分)。图片显示一个提示髓鞘脱失的安定治疗动物,从而表明安定无法抑制cuprizone引起的髓鞘脱失。

4所示。讨论

以前的研究已经表明GABA和谷氨酸脱羧酶活动的浓度和[女士血液减少实验性自身免疫性脑脊髓炎21,22]。基于这些研究结果,试图探讨选择性GABA的潜力_一个受体受体激动剂或积极的变构调节剂和GABA水平增强剂的治疗在目前的研究中,女士安定、苯巴比妥钠和丙戊酸钠钠筛选为他们的活动对模型在实验性自身免疫性脑脊髓炎女士在老鼠和cuprizone-induced脱髓鞘模型小鼠。在上下文模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎,发现苯巴比妥钠和丙戊酸钠钠抑制运算单元的临床症状;然而,安定未能症状控制这些实验性自身免疫性脑脊髓炎。虽然安定和苯巴比妥都积极变构GABA的调节器_一个受体,可能他们的观察活动的差异的原因可能是他们的结合位点的差异23]。苯巴比妥钠和安定独立行为,通过绑定到β亚基苯二氮GABA的结合位点_一个受体,分别。安定只有GABA facilitatory行动而苯巴比妥GABA facilitatory以及GABA模仿效应(23]。这意味着它不仅提高了GABA的行动也引起的Cl^{- - - - - -}离子通道。此外,苯巴比妥也块钙通道,从而导致抑制介质释放。丙戊酸钠钠是GABA氨基转移酶的抑制剂,增加GABA水平可能负责抑制谷氨酸会因此髓鞘脱失动物。在实验性自身免疫性脑脊髓炎

然而,在上下文的谷氨酸释放试验,丙戊酸钠钠被发现在所有这三个药物最有效。它显著地抑制临床体征和谷氨酸释放可能归因于它能够提高GABA在谷氨酸释放的抑制作用,从而防止谷氨酸会引起。这是观察到,虽然苯巴比妥,临床症状的抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎未能抑制谷氨酸释放。虽然这一发现还不清楚的原因,它可能是假定其他途径参与了其作用机理。

在cuprizone-induced C57BL / 6小鼠髓鞘脱失,观察,安定不产生任何抑制髓鞘脱失而丙戊酸钠钠抑制髓鞘脱失程度好,相当与积极的控制。动物用苯巴比妥钠治疗显示适度抑制髓鞘脱失。Cuprizone诱导线粒体形态的改变也是猜测,这copper-chelating复合的毒害神经的特性是由于细胞呼吸的干扰是一个关键的线粒体的功能。此外,似乎一组酶的活性是干扰髓损失在第一天或数周之前cuprizone暴露的24]。然而,没有可用的报告是关于活动的丙戊酸钠和苯巴比妥钠钠线粒体的细胞反应。因此,进一步的研究需要了解这些发现背后的具体原因,阐明这些药物的途径显示他们的药理作用在这个模型。

5。结论

本研究的发现表明,丙戊酸钠钠可能作为潜在的药物管理的女士然而,这只是一个初步的发现和进一步需要广泛的研究在此背景下。此外,选择性的候选新药代理通过gaba ergic系统可能是设计和筛选对女士他们的活动。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突披露。

确认

作者希望承认夹,艾哈迈达巴德,提交不。NIPERA330913,提供所有设施开展这项工作;国际制药、艾哈迈达巴德,印度提供安定、盐酸米托蒽醌,样品和喹硫平延胡索酸酯作为礼物;和Chemclone产业,艾哈迈达巴德,印度为提供丙戊酸钠钠样品作为礼物。

引用

1. a Compston a科尔斯,“多发性硬化症”,《柳叶刀》,卷359,不。9313年,第1231 - 1221页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. a Compston a科尔斯,“多发性硬化症”,《柳叶刀》,卷372,不。9648年,第1517 - 1502页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. 答:立顿和p·a·罗森博格“兴奋性氨基酸作为神经系统疾病,最后共同通路”《新英格兰医学杂志》上,卷330,不。9日,第622 - 613页,1994年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. r . Srinivasan n . Sailasuta r·赫德美国纳尔逊·d·佩尔蒂埃,”谷氨酸升高的证据在多发性硬化使用核磁共振光谱学在3 t,”大脑,卷128,不。5,1016 - 1025年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. p .长,美世,r . Begum g . j . Stephens t . s . Sihra和j·n·约万诺维奇,”神经终端GABAA受体激活Ca^{2 +}/ calmodulin-dependent信号抑制电压门控钙^{2 +}涌入,谷氨酸释放。”《生物化学》杂志上,卷284,不。13日,8726 - 8737年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. Lazo j, k·帕克,l·布鲁顿古德曼和吉尔曼:治疗的药理基础麦格劳-希尔,纽约,纽约,美国,第十版,2007年版。
7. h·s·肯尼迪,f . Puth m·范·霍伊和c Le Pichon”的方法去除大脑和脊髓的从成年小鼠和大鼠,一个单位”实验室动物,40卷,不。2,53-57,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. g . j .计、d . r . Kipke和w·沙恩,“整个动物灌注固定啮齿动物,”《可视化实验,没有。65年,文章ID e3564, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. e . m . Shevach“为自身免疫和炎性疾病动物模型,”当前免疫学的协议,页15.2.1-15.2.4,约翰·威利& Sons,牛津大学,英国,2001年。视图:谷歌学术搜索
10. c . Beeton a·加西亚和a·g·钱迪,“诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎chronic-relapsing临床评分,“《可视化实验,没有。5篇文章e224 2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. s . c .岭、a . e . Sloboda和r . a . McReynolds“米托蒽醌抑制实验过敏脑脊髓炎,”临床免疫学和免疫病理,35卷,不。1,35-42,1985页。视图:谷歌学术搜索
12. r . Farooq d . j . Haleem和m . a . Haleem”剂量相关的抗焦虑药安定的影响:与血清电解质、血浆同渗重摩和收缩压(SBP)的老鼠,”巴基斯坦药理学杂志》上的报告25卷,37-42,2008页。视图:谷歌学术搜索
13. w . Loscher和d Honack”,比较去氧苯巴比妥和苯巴比妥的抗惊厥的疗效在治疗慢性amygdala-kindled的老鼠,”欧洲药理学杂志,卷162,不。2、309 - 322年,1989页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. f . Bosetti j·m·贝尔和p . Manickam”老鼠大脑基因表达微阵列分析慢性丙戊酸钠钠管理后,“大脑研究公告,卷65,不。4、331 - 338年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. m . p . Cid a . a . Vilcaes l . l . Rupil n a·萨尔瓦·g·a·罗斯,“参与gaba ergic系统谷氨酸释放的额叶皮质突触体从Wistar鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎,”神经科学卷,189年,第344 - 337页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. p . r . Dunkley j·w·希思,s·m·哈里森·e·Jarvie p . j . Glenfield和j·A·p·Rostas”快速Percoll梯度程序隔离突触体直接从S1分数:同质性和亚细胞形态学分数,”大脑研究,卷441,不。1 - 2日,59 - 71年,1988页。视图:谷歌学术搜索
17. 答:a . Vilcaes g .可•福尔兰正抑制Ca和g·a·罗斯。^{2 +}端依赖大脑皮层谷氨酸释放突触体实验性自身免疫性脑脊髓炎的老鼠,”神经化学杂志,卷108,不。4、881 - 890年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. s e .文件和l . j .威尔“苯巴比妥钠对电动机的影响活动和探索在鼠标:宽容和戒断反应的发生率的发展,“药理生物化学和行为,35卷,不。2、317 - 320年,1990页。视图:谷歌学术搜索
19. a . k . Rehni n·辛格,“逆转pentylenetetrazole-induced小鼠癫痫活动通过氯化镍,”印度药理学杂志》上的报告第41卷。。1、15—18,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 江y, h .徐w . et al .,“喹硫平缓解cuprizone-induced白质病理学在C57BL / 6小鼠的大脑,”精神分裂症的研究,卷106,不。2 - 3、182 - 191年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. z Gottesfeld, d .分类、c·韦伯和r·亚嫩河”的改变GABA系统在实验过敏脑脊髓炎引起瘫痪,”神经化学杂志,27卷,不。3、695 - 699年,1976页。视图:谷歌学术搜索
22. e . v . Demakova v . p . Korobov, l . m . Lemkina”测定γ-氨基丁酸浓度和谷氨酸脱羧酶的活性在多发性硬化症患者血清,”Klinicheskaia Laboratornaia Diagnostika,没有。4、15 - 17日,2003页。视图:谷歌学术搜索
23. r·e·Twyman c·j·罗杰斯和r·l·麦克唐纳”微分调节γ酸氨基丁酸受体通道的安定和苯巴比妥神经病学年鉴,25卷,不。3、213 - 220年,1989页。视图:谷歌学术搜索
24. 阿诺德和c·拜尔,”由雌激素在大脑中神经保护:线粒体隔间作为假定的治疗目标,“神经化学杂志,卷110,不。1、1 - 11,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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