文摘
最初被感染后,疱疹病毒撤退到一个永久的潜伏状态与定期活化导致一个增强的传输和临床疾病的可能性。核苷类似物无环鸟苷降低α三个人类疱疹病毒的临床症状,1型单纯疱疹病毒,HSV-2,带状疱疹。长期的无环鸟苷(ACV)可以减少复活的频率和严重程度,但其生物利用度低,半衰期短需要每天服药。我们实验室正在开发一个皮下交付系统提供长期的、持续的释放无环鸟苷。以前,我们证明了一个植入硅胶(地中海- 4050)设备,浸满无环鸟苷防止1型单纯疱疹病毒在体外和在活的有机体内。在这里,我们扩展我们的在体外观察包括防止HSV-2和带状疱疹。我们还演示HSV-2防护在体外使用地中海- 4750有机硅聚合物为人类长期使用而设计的。当释放无环鸟苷从地中海- 4750是每天用数量来表示,一个初始破裂5天观察,紧随其后的是一个长期的缓慢释放near-zero-order动力学,平均每天发布1.3923±0.5908μ在几天20 g无环鸟苷。发展缓释植入有可能显著影响人类α疱疹病毒感染的治疗。
1。介绍
疱疹病毒是最普遍的人类病原体,大多数人都感染了多个物种的时候他们成年。人类宿主的主要感染后,疱疹病毒撤退到潜伏感染状态持续宿主的一生。周期性的激活潜伏性感染与一个增强的传输和可能症状的风险,导致病变特点,或无症状1- - - - - -5]。
人类α疱疹病毒亚科包括三名成员:单纯疱疹virus-1(1型单纯疱疹病毒),单纯疱疹病毒2 - 2),和水痘带状疱疹病毒(带状疱疹)。所有三个建立主要感染上皮细胞神经元的潜伏性感染。美国居民的年龄14-49,seroprevalence 1型单纯疱疹病毒估计为57.7%,HSV-2为16.2%,而带状疱疹感染几乎普遍引入儿童疫苗之前1995年(6- - - - - -9]。疱疹病毒可以通过各种各样的重新激活身体或情感上的压力。临床活化α疱疹病毒估计发生在大约10 - 30%的感染人类宿主,尽管亚临床脱落的发生频率(8,10- - - - - -12]。疱疹病毒疫情在免疫功能低下的患者更频繁和比健康人更难控制,甚至会危及生命(8,13- - - - - -15]。
自1980年代以来,鸟嘌呤核苷类似物无环鸟苷(ACV)及其衍生物,包括valacyclovir (VACV;Valtrex,葛兰素史克),HSV感染的一线药物治疗和复活4,14,16,17]。而无环鸟苷治疗疱疹是一个突破,它有几个缺点。无环鸟苷口服生物利用度差(~ 20%的摄取药物被吸收),消除血液中的半衰期约3小时(18- - - - - -20.]。因此,为了维持一个恒定的水平足以抑制药物的临床疾病,必须采取药片每天,需要高水平的病人的依从性。
病人的依从性尤其关心那些试图长期预防性治疗生殖器疱疹(21,22]。这是不幸的,因为无环鸟苷可以抑制活化的HSV-2时采取预防性在很长一段时间,减少临床事件和亚临床脱落和减少传播的可能性,与毒性很低(23- - - - - -28]。长期预防措施也被认为利率高的人群艾滋病的传播,随着感染HSV-2增加感染艾滋病毒的可能性(两到三倍29日- - - - - -31日]。
复活的带状疱疹引起带状疱疹,也被称为带状疱疹,这会导致衰弱皮肤敏感性[32,33]。减毒活疫苗带状疱疹疫苗已经在美国自1995年以来,导致儿童水痘的发病率急剧下降,以及未接种疫苗的成年人,后者可能由于群体免疫(8]。而带状疱疹疫苗的功效高,数以百万计的成年人受到水痘带状疱疹的孩子仍然容易受到激活带状疱疹的形式及其频繁的并发症,postherpetic神经痛(PHN),可以发展成为一个持久的持久的疼痛综合征。预防无环鸟苷可以防止发生带状疱疹和PHN [34- - - - - -36]。
尽管长期无环鸟苷使用的安全性和有效性,在相当长的一段时间内的挑战,维护病人的依从性限制了其效用。出于这个原因,我们实验室一直在开发控释交付系统使用植入硅胶棒浸满无环鸟苷。这些棒的设计是为了提供长期的药物以恒定的剂量,而不再需要病人遵守每日服药的。
以前,我们的实验室合成silicone-ACV皮下植入,发布无环鸟苷near-zero-order动力学和防止1型单纯疱疹病毒感染小鼠的细胞培养和1型单纯疱疹病毒再活化(37]。在本文中,我们报告的有效性对另外两个人类的植入α疱疹病毒,HSV-2和带状疱疹,在细胞培养。我们比较释放动力学和在体外功效使用两种不同的有机硅聚合物,其中一个是批准的长期植入人类,和我们比较不同药物的植入物的功效:聚合物的比例,让我们来确定最低有效剂量在体外。
2。材料和方法
2.1。植入物生产
硅胶植入物由一个矩阵和无环鸟苷粉(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,并推进科学化工,劳德代尔堡FL)。使用了两种不同的有机硅弹性体,在文本中指定:地中海NuSil - 4050或NuSil地中海- 4750 (NuSil硅胶技术、Carpinteria CA;http://www.nusil.com/library/products/med - 4035 _med - 4050 _med - 4065 p.pdf和http://www.nusil.com/library/products/med - 4750 p.pdf)。每个弹性体是由两部分组成,A和b两个部分(0.20 g)单独软化与10传递面食制造商(Laroma手工面食机,韦斯顿,Strongsville,哦),然后磨在一起20开始聚合。浸渍的无环鸟苷、药物(0.20 g达到1:1:1的比例按重量的组件,组件B:无环鸟苷如图1,2,4;0.04 - -0.20 g作为图中指定的文本3)被添加到混合,研磨了20多,其次是植入物的形成。这个方法被描述在37]。
(一)
(b)
(一)
(b)
(c)
创建杆状植入物,软化材料将被放置在一个0.5英寸的身份证聚碳酸酯圆柱,装有一个匹配的活塞,通过2毫米直径和挤压死在压力下一吨的阿伯出版社(港货运工具,Parkville MD)。气缸、活塞和模装置是由罗伯特库塔的费舍尔科学和数学学院(陶森大学物理系和地质机械工厂)。移植是治愈在室温下了7天,然后在60°C(24小时38]。固化过程后,植入物被减少到15毫米的长度。植入物被浸泡在40%次氯酸钠消毒(家用漂白剂)一分钟在室温下,将通过四个变化PBS 30秒删除漂白,然后风干。
2.2。确定植入物在细胞培养中防止CPE的功效
24-well培养板是用1毫升/杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM;表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清(双子座生物制品、西萨克拉门托,CA)和1% penicillin-streptomycin-amphotericin B(弗吉尼亚州赫恩登Mediatech Inc .,)。分析HSV-2,非洲绿猴肾细胞(维洛细胞,写明ATCC ccl - 81;Prashant德赛的恩赐,约翰霍普金斯大学医学院)添加到每个好,成长为24小时37°C和5%的公司2融合(约80%。1.6×105细胞/)。单个acyclovir-containing硅胶植入物被放置到每个“植入”。控制井收到无环鸟苷在PBS (PBS /无环鸟苷)最终浓度为0.22μg / mL或没有药物。一个或两天后,井点状注射95单位HSV-2 (G) (Kevin严的礼物,病毒粒子系统,Inc .)或HSV-2(女士)(写明ATCC # vr - 540;写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州),如上所述。数码照片拍摄在感染后3天,除特殊说明外)。Mock-infected井收到完整的DMEM没有病毒。Acyclovir-free控制井(“没有”)收到无环鸟苷和植入。分析带状疱疹,MRC-5细胞(写明ATCC # ccl - 171;写明ATCC)添加到每个好,24小时37°C和5%增长有限公司2融合(约80%。1.6×105细胞/)。一个acyclovir-containing硅胶棒放置到每个“植入”。控制井收到无环鸟苷在PBS (PBS /无环鸟苷)的最终浓度10μg / mL或没有药物。两天后,井点状注射150单位的带状疱疹(奥卡河)(写明ATCC # vr - 795;写明ATCC,弗吉尼亚州马纳萨斯)。数码照片被感染后10天。Mock-infected细胞收到完整的DMEM没有病毒。Acyclovir-free控制井(“没有”)收到无环鸟苷和植入。HSV-2 (MS)滴度测定极限稀释100μL样本删除在感染后3天(39]。
2.3。确定在体外释放动力学
植入物的释放速度无环鸟苷在体外是由高效液相色谱分析。
100年文化,以确定无环鸟苷水平μL(组织培养上清液从被感染的细胞培养(上图)被感染后3天。Penciclovir (1μg)是包括作为一个内部控制,监督效率的无环鸟苷复苏,和蛋白质与1毫升甲醇沉淀。由离心沉淀被移除,然后上层清液干Speed-Vac装置,resuspended 1毫升1:9水:乙腈,然后通过一个0.45μ注射器过滤器(Phenex-RC 4毫米;Phenomenex托兰斯,CA)高效液相色谱分析(见下面)。
发布的长期分析,植入物被放置到1.5毫升微型离心机管与1.0毫升的磷酸盐(HyQ PBS;HyClone,洛根,UT) pH值7.5和举行25°C。每24小时60天,每个植入是搬到一个新的微型离心机管新鲜PBS。
无环鸟苷是由高效液相色谱法(HPLC)测定的数量。每个样本(50μL)与450年被稀释分析做好准备μL乙腈和分析一个安捷伦系统配备了卢娜HILIC 3微米15×100毫米列(Phenomenex托兰斯,CA)权力平等主义的条件下运行90%乙腈/ 10%甲酸(0.1%)作为流动相。计算值与无环鸟苷标准同时运行。
3所示。结果
3.1。对HSV-2 Silicone-ACV植入,带状疱疹的效果
以前,我们证明了ACV-impregnated硅胶植入物表现出对1型单纯疱疹病毒在维洛细胞抗病毒活性。我们试图确定是否对其他疱疹病毒植入物将显示类似的活动。对两株HSV-2测试活动,维洛细胞孵化没有药物,无环鸟苷在解决方案,或地中海- 4050硅胶植入物与无环鸟苷浸渍1:1:1的比例(重量)的组件,组件B:无环鸟苷(见部分2)。两天之后添加无环鸟苷或植入细胞,井不是HSV-2注射(G), HSV-2(女士),单独或中等(“模拟”)。挑战三天后,所有mock-infected细胞保持健康,一样一样挑战细胞收到无环鸟苷在溶液中或地中海- 4050 /无环鸟苷植入;所有保持汇合的单层(图1(一))。然而,细胞感染HSV-2接受在溶液中无环鸟苷和ACV-impregnated植入方面表现出显著的细胞病变效应(CPE),包括细胞舍入和大清除区域的外观。
测试ACV-impregnated硅胶假体隆胸的效果对水痘带状疱疹病毒(带状疱疹),MRC-5细胞孵化没有药物,无环鸟苷在溶液中,用无环鸟苷或地中海- 4050硅胶植入浸渍。两天后,一半的井被挑战与带状疱疹(奥卡河),其余仅接受媒介(“模拟”)。感染后10天,所有mock-infected细胞保持健康,出现的汇合的单层有条纹的成纤维细胞(图1 (b))。细胞培养用无环鸟苷在解决方案或地中海- 4050 /无环鸟苷植入与mock-infected控制是没有区别的。相比之下,VZV-infected细胞没有收到任何药物的形式展出CPE单层的点蚀。
3.2。比较两个聚合物
我们先前证明silicone-ACV植入物生成与地中海- 4050聚合物提供防止老鼠1型单纯疱疹病毒复发。地中海- 4050有一个显著的缺点,然而,在它的使用在人类被限制为最多连续29天。地中海- 4750有相似的物理性质地中海- 4050,但它是受雇于美国食品和药物管理局批准的设备在人类无限制的使用。因此,我们试图比较这两种聚合物的功效为无环鸟苷的运载工具。当结合在一个1:1:1的比例(重量)的组件:组件B:无环鸟苷,植入物生成的聚合物保护维洛细胞从一个HSV-2挑战(图2(一个))。维洛细胞收到一封ACV-impregnated植入后保持平稳单层HSV-2挑战,正如那些收到无环鸟苷在解决方案。植入物类型明显减少了生产的活病毒在感染(图2 (b))。相比之下,细胞没有收到无环鸟苷显示显著的CPE和被感染。此外,无环鸟苷的含量由每个移植类型(图2 (c))被发现在长期与水平在体外药研究(部分3所示。3)。因此,ACV-impregnated地中海- 4750聚合物能够保护培养细胞从一个HSV-2挑战,可比在功效和地中海- 4050聚合物植入物生成。
3.3。最低有效剂量测定硅胶假体隆胸的无环鸟苷
确定无环鸟苷的最小有效剂量在体外硅胶假体,我们生成的地中海- 4750与不同比例的聚合物无环鸟苷。由于聚合物由相同比率的两个组件(A和B),这是表示为一个由三部分组成的比例按重量的地中海- 4750部分:地中海- 4750组件B:无环鸟苷。植入物生成,减少大量的无环鸟苷,在比率1:1:1(33%),3:3:2(25%),2:2:1(20%),3:3:1(14%),和5:5:1 (9%)。所有植入提供保护HSV-2维洛细胞感染时观察到的挑战,三天后细胞相比没有收到植入或植入无环鸟苷(图3)。当细胞进行挑战,五天后植入无环鸟苷浓度最高的四个仍然提供保护。然而,CPE 5天HSV-2感染细胞治疗植入含有9%无环鸟苷(图3最低,9%无环鸟苷,面板)。相比之下,细胞接受高剂量的无环鸟苷保持不变在5天(没有显示)。仍然有效的最低剂量植入第五天包含14%无环鸟苷。
3.4。在体外释放动力学的无环鸟苷制成的植入物医疗地中海- 4050和- 4750聚合物
以前,我们表明,无环鸟苷不断释放杆状植入物生成与地中海- 4050聚合物与near-zero-order动力学在63天时间内,由光谱光度测量的无环鸟苷的定量。我们试图扩展这些观察结果公布的无环鸟苷地中海- 4750和量化无环鸟苷的高效液相色谱法。植入物生成的聚合物都浸满无环鸟苷在1:1:1比例,无环鸟苷的速率释放决心在60天内(图4)。符合我们以前的观测,植入物的初始破裂释放无环鸟苷,紧随其后的是一个长期的缓慢释放。然而,尽管地中海- 4750年爆发时期持续了五天,地中海- 4050植入了长期破裂,它持续了大约10 - 20天(图4和[37])。初始破裂后,地中海- 4750植入发布的无环鸟苷与near-zero-order动力学剩下的60天的测试时间。我们观察到平均每天发布1.3923±0.5908μ从地中海- 4750 g无环鸟苷在天20植入。这是72%低于4.9165±2.5450μ每天从地中海- 4050 g无环鸟苷公布同期植入。
4所示。讨论
临床活化导致痛苦的生殖器损伤估计发生在10 - 25%的人感染HSV-2 [11,12),和长期预防无环鸟苷治疗可以显著降低临床事件的频率24,26- - - - - -28,40]。尽管大多数HSV-2血清反应阳性的人无症状,超过四分之三没有携带病毒,亚临床期间脱落HSV-2源合作伙伴当大多数性传播的发生(12,41- - - - - -43]。预防无环鸟苷或VACV已经被证明可以减少病毒传染和性传播HSV-2 [23,25,28,44),不会导致耐药性在免疫活性的病人28]。
最近HSV-2动力学分析确定病毒扩张最快前12小时一集脱落并通过第二或第三天峰。研究参与者采取每天无环鸟苷在平均膨胀率减少了日志的第一天脱落相对于那些服用安慰剂,连同发作频率减少53% (45,46]。第一次12小时后开始脱落的事件后,然而,病毒动力学不再回应的抗病毒药物。这些结果支持无环鸟苷的临床观察期间需要尽早进行递归为了有效47]。事实上,常数预防无环鸟苷比急性治疗更有效减少疾病的持续时间和严重程度,可能是因为它可以确保药物存在病毒扩张的关键凌晨之前和期间(48]。
在美国,每年大约一百万人体验带状疱疹,多达50%的人活到85岁的忍受一生中至少有一个事件(33]。一旦确诊,带状疱疹的抗病毒药物并不妨碍其频繁的续集,慢性神经性疼痛综合症称为postherpetic神经痛或PHN [33,35]。长期的抗病毒药物管理局尚未测试作为一个策略来防止带状疱疹或PHN一般人群。然而,当预防长期口服治疗与无环鸟苷或VACV测试接受癌症患者化疗或骨髓移植,带状疱疹的发生,因此,PHN是预防34,36]。
有人建议,广泛的童年带状疱疹疫苗接种可能负责一个观察增加成人带状疱疹,由于失去自然提高成人免疫(49,50]。当前推荐预防带状疱疹疫苗接种的健康成年人,可以减少51%患带状疱疹的可能性和PHN的66% (51,52]。长期的无环鸟苷可能提供了一个额外的工具,减少带状疱疹的频率和严重程度和PHN老人。
使用植入式设备交付antiherpetics并非没有先例。Vitrasert(博士),聚乙烯醋酸乙烯alcohol-ethylene polymer-copolymer与更昔洛韦浸渍,可以植入intravitreously治疗艾滋病患者巨细胞病毒性视网膜炎的,虽然设备必须更换每5到8个月(53]。Vitrasert已经有限的临床使用和从未被部署到α治疗人类疱疹病毒感染。
在我们之前的研究中,地中海- 4050硅胶植入物释放约1μ每天g(无环鸟苷,我们观察地中海- 4050的五分之一(37]。这种差异最可能来源于之前的方法,我们用来量化的差异无环鸟苷。在早期的研究中,上层清液受到几个光度分析前处理步骤,有可能对样品保留和测量精度的影响。相比之下,这里由高效液相色谱直接分析了上层清液,最小化处理和相关样品损失。此外,挤压过程的优化在制造可能已经改善我们植入物的质量。
除了提供连续给药,局部植入设备提供的可能性减少药物剂量远低于常用的系统。仍有一些不确定性治疗是否应该目标网站的延迟或重新激活,尽管局部抗病毒药物的疗效倾向于后者。所有阿尔法疱疹病毒主要特点是本地化的延迟和活化,因此是局部治疗的潜在目标。这些包括多样化兽医疾病的病原微生物,如猫疱疹结膜炎和牛疱疹mammillitis [54,55]。
基于初始破裂后的释放动力学测量期间,每个地中海- 4750植入理论上可以持续到17.5年,但药物传输的动力学和所需的最小剂量治疗效果需要在真正的长期决定的在活的有机体内研究。为本地和系统性分析交付设备的无环鸟苷以及功效在活的有机体内我们目前正在进行的研究在动物模型。
5。结论
以前,我们观察到植入硅树脂浸渍装置与无环鸟苷提供预防1型单纯疱疹病毒在体外和在活的有机体内(37]。在这里,我们扩展在体外结果证明α剩下的两个人类疱疹病毒防护,HSV-2和带状疱疹。我们也获得了保护HSV-2使用有机硅聚合物(地中海- 4750)批准的设备部署在人类长期使用。最低剂量的14%无环鸟苷被要求获得一个完整的五天HSV-2防护。地中海- 4750植入的初始破裂释放无环鸟苷持续5天,紧随其后的是一个稳定的每日大约1.4的发布μg无环鸟苷near-zero-order动力学在年底前60天的测试时间。
作为初步的一步,这项研究表明antiherpetic无环鸟苷可以制定成一个长期的运载工具函数作为一个抗病毒药物干预,可能会持续相当长的时间,比每日口服维持疗法更容易管理。
持久,植入式药物输送设备有可能显著影响人类α疱疹病毒感染的治疗。鉴于亚临床的高频HSV-2脱落,连续治疗被建议对于那些频繁暴发以及并发感染艾滋病毒的人(43];连续的、长期的剂量也会可能会减少传输的频率敏感的性伴侣。使用缓释植入消除相关的问题与每日服药的病人的依从性。VZV-positive个体、交付的无环鸟苷植入式装置有可能降低带状疱疹和衰弱的发生率续集,postherpetic神经痛。长期使用无环鸟苷与重大收购耐药性无关个体免疫活性的(28]。
利益冲突
作者宣称他们没有利益冲突与任何商业或政府实体描述的这个工作。
作者的贡献
n·m·约翰逊,s . b . Longdo s . o . McGusty-Robinson, s . l . Semenkow是相等的贡献者。
确认
鲍勃库塔,陶森大学费舍尔科学和数学学院的机械工厂,建立聚合物挤出模具系统。泰瑞帕森斯博士约翰霍普金斯医学院药理学系是帮助我们发展的高效液相色谱方法。作者还要感谢以下的学生参加了这个研究项目:劳伦·彼得森史蒂文?威特德里克·格里斯,米娜Alizadeh,水晶杜伦,Ron Toothman贾亚特里Krishnan,苏珊濑户。作者承认陶森大学教师发展研究委员会的支持,陶森研究生协会,本科研究委员会。陶森大学费舍尔科学和数学学院也为这个项目提供了本科生科研基金。Shenika o . McGusty-Robinson和萨曼莎·l·Semenkow部分支持的美国微生物学会暑期本科生研究奖学金。这个项目被授予不支持。R15AI084069国家过敏症和传染病研究所。完全的责任作者和内容并不一定代表官方观点的国家过敏症和传染病研究所和美国国立卫生研究院。