文摘

背景和目的。钙调磷酸酶抑制剂(cni)显示开发移植患者的高血压。的在体外孵化的影响环孢霉素(CsA)和他克莫司(Tac)对大鼠胸主动脉血管的松口(TA)和腹主动脉(AA)需要调查。方法。CsA的最佳浓度(1.0毫克/毫升),Tac(0.1毫克/毫升)用于比较endothelium-dependent(乙酰胆碱(ACh))和endothelium-independent(硝普酸钠(SNP))血管放松对苯肾上腺素的受体激动剂(PE)收缩的助教和AA 13-week-old男性雄性sd大鼠中()。结果。在助教,最大引发的血管舒张反应ACh(控制:98%)显著()抑制CsA (由Tac(10%)而不是97%)。在AA,(控制:集成电路₅₀50 nM;100%)CsA (IC₅₀7μM;()表现出强烈的敏感性比Tac (IC抑制ACh-dependent血管松弛₅₀215海里();98%)。CsA和Tac未能影响抑制反应SNP助教和AA。结论。CsA产生深远的抑制作用endothelium-dependent血管舒张而Tac助教和AA。胸主动脉环的地区对公司更敏感,因为血管舒张反应ACh是完全由没有在AA,疼可能招募其他内皮介质除了没有维持血管舒张。

1。介绍

post-transplantation血管病变是一个重要的器官移植后并发症(1]。最初的病理事件被认为是同种异体移植物血管内皮功能障碍,一个条件中有代endothelium-derived放松的因素,减少一氧化氮(NO)。合成减少或增加淬火,氧化应激是导致血管平滑肌(VSM)增加血压的语气和高程,伴随着内皮损伤和血管壁的自我平衡的监管财产损失(2]。减少没有函数被认为发挥重要作用的发展post-transplantation血管病变(3]。移植免疫抑制剂如钙调磷酸酶抑制剂(cni)血管反应性产生实质性的影响,尤其是在没有合成(3]。主要的两种有限公司药物即环孢霉素(CsA)和他克莫司(Tac),都被认为会损害血管内皮功能通过减少代没有释放以及增加代血管收缩的肽,endothelin-1 (ET-1)导致血管张力和合成高血压升高4- - - - - -8]。现在认为这些影响CsA和Tac是由于他们的直接作用于血管,独立于其对肾脏的影响(9]。相比之下,一项研究建议,CsA管理促进增强血管收缩的大鼠胸主动脉环(TA)通过其直接作用于VSM细胞,它可能不会影响endothelium-dependent NO-mediated血管舒张(10]。同一组研究人员也证明了长时间在活的有机体内CsA管理导致endothelium-dependent(血管舒张反应乙酰胆碱(Ach)以及endothelium-independent(硝普酸钠(SNP))减少血管舒张反应胸但不是在腹部的部分大鼠主动脉环(11]。然而,这样的理由段之间的显著程度的地区差异大鼠主动脉环并没有充分解释的研究。研究未能证明在体外孵化与CsA等参股或Tac会影响血管反应受体激动剂。结果与有限公司对调节血管功能确实是非常矛盾的由于研究协议的差异,药物剂量和治疗持续时间(4- - - - - -11]。我们所知,没有任何信息的相对影响比较CsA和Tac的效果反应在TA与腹主动脉血管扩张神经受体激动剂(AA)。

为了解决上面的,本研究的主要目的是检查是否严重在体外孵化有限,短时间30分钟的曝光时间最优和临床相关的浓度CsA(1毫克/毫升)或Tac(0.1毫克/毫升)会影响endothelium-mediated由乙酰胆碱所引起的血管舒张和/或endothelium-independent直接引起的血管舒张VSM放松在苯肾上腺素受体激动剂如SNP (PE)抑制大鼠主动脉环。这是第一次报告的微分和急性影响的比较在体外添加CsA和Tac endothelium-intact TA对AA大鼠主动脉环。

2。方法

2.1。动物

研究进行了使用13-week-old男性Sprague-Dawley老鼠(300 - 350 g)从查尔斯河实验室购买(圣常数,魁北克,加拿大)。实验动物伦理委员会批准的协议是萨斯喀彻温省大学符合指导的实验室动物保健和使用委员会规定的加拿大动物保健和美国国立卫生研究院出版。

2.2。材料

氯化乙酰胆碱、盐酸去氧肾上腺素、硝普酸钠,所有使用的盐制备柠檬酸缓冲均为分析纯从Sigma-Aldrich获得加拿大有限公司(加拿大安大略省奥克维尔)。环孢霉素A(诺华,山地明^®注入注射。)是来自诺华制药、加拿大Inc .(多瓦尔,魁北克,加拿大),而他克莫司(Prograf,注射。)从Astella购买加拿大制药有限公司(加拿大安大略省马卡姆)。异氟烷和肝素钠从雅培有限和山德士,获得加拿大公司,分别(蒙特利尔,魁北克,加拿大)。

2.3。在体外研究大鼠胸和腹部主动脉环

在体外研究使用戒指准备执行的助教和AA大鼠主动脉。船很快被隔绝的男性Sprague-Dawley后大鼠动物犀牛异氟烷。CsA的影响和Tac引起的张力变化响应的孤立的老鼠助教和AA决定暂停这些准备在器官浴包含10毫升克雷布斯的缓冲区(在120 mM:生理盐水;4.8、氯化钾;1.2,MgCl₂;1.8,CaCl₂;1.2,KH₂阿宝₄;25日,NaHCO₃;11、葡萄糖;pH值7.4与95%阿加油₂,5%的公司₂在37°C)下保持休息2 gr的预张力。如前所述(12,13]。足够的关心被送往插入钩子不破坏内皮。主动脉环首先简约的轻快与高频浓度(~ EC_80年水平)选择性受体激动剂,PE (1μ米)。一旦稳态主音响应,组织在正常洗柠檬酸缓冲一段1小时,相同浓度的PE和响应是反复确定,持续滋补应对体育是复制。然后,固定浓度的乙酰胆碱(10μ米)添加到评估血管舒张的程度PE-constricted戒指。如果血管舒张ACh > 90%,这被认为是一个endothelium-intact准备自ACh唤起只在与完整的内皮血管血管舒张。一旦达到稳定的紧张性反应后的PE、累计课时(1 nM-10浓度增加μ米)或SNP (1 nM-10μM)被添加的方式下添加浓度只有在反应前浓度已达到稳定阶段。收集的数据被认为是控制(治疗前)并与药物治疗后获得的数据在同一组织因为PE-evoked反应可以复制相同的准备,只要抑制药物暴露只有一次。组织被反复洗涤3次,允许恢复清洗至少1小时。同一组织孵化与CsA(1毫克/毫升)或Tac(0.1毫克/毫升)柠檬酸缓冲了30分钟。然后,组织与PE收缩(1μM)达到稳态主音响应,累计增加浓度的乙酰胆碱或SNP是重复的CsA或Tac,直到最大抑制的主音血管收缩剂反应PE可以达到稳定状态。因此,等长张力变化诱发的ACh和SNP的存在与否CsA和Tac PE-constricted环测定相同的船只鼠()。紧张的响应被记录在克图计划(表V5.0.1)使用Powerlab / 8 sp数据采集系统(广告工具分公司,悉尼,澳大利亚)。

2.4。统计分析

添加后的张力抑制诱发每个浓度的ACh或SNP的PE收缩的血管被规范化为稳态紧张性反应诱发的抑制百分比体育。自抑制作用达到接近100%,乙酰胆碱或SNP所需的浓度50%的最大抑制(IC₅₀)以及最大抑制的百分比值为每个孵化条件可以从每个concentration-inhibition生成响应曲线(CRC)使用棱镜软件(图垫Inc .拉霍亚,CA)。获得的数据使用血管分离从一个老鼠孵化池,为一个特定的条件和均值,老鼠被认为是。然后,类似的实验与血管分离出6大鼠(复制)。因此,最后的意思是±SEM值显示在结果部分代表收集的数据从几个老鼠。之间的差异意味着±SEM值不同的孵化条件使用单向方差分析进行分析,其次是图基事后测试和数据被认为是重要的时值< 0.05。然而,对于分配的意义,最接近值达到了部分3。

3所示。结果

添加的车辆(花生油10%)中更高浓度的CsA或Tac准备或添加适当浓度的CsA(1.0毫克/毫升)或Tac(0.1毫克/毫升)中维护器官浴在柠檬酸缓冲一段30分钟未能影响基底的语气,而PE-evoked稳定的助教紧张性反应或AA大鼠主动脉环的部分增强和可比(数据未显示)。

添加ACh导致浓度依赖性抑制PE-evoked稳态紧张性反应1 nM和1之间μ助教和AA。CRC决定从几个实验(图所示1(一)- - - - - -1 (d))。集成电路没有显著差异₅₀或控制值ACh确定没有CsA或Tac鼠助教和AA(图1和表1)。添加CsA(1.0毫克/毫升)导致几乎完全抑制反应ACh的助教价值被明显低得多(%比控制价值ACh) (%)。CsA是如此深刻的急性抑制作用endothelium-intact TA戒指,这是类似于废除的抑制作用ACh endothelium-denuded血管(图1(一))。Tac的添加也反应的抑制,但抑制效果相对要低得多,只有在CRC ACh right-ward转变;的集成电路₅₀值ACh是正确的从一个控制转移的价值海里,纳米在Tac的存在。而右移的程度显著(),Tac孵化未能影响最大的乙酰胆碱的抑制效果价值并不是不同的控制与Tac治疗组之间(图1 (b)、表1)。虽然类似的模式抑制作用的ACh也出现在大鼠AA, CsA和Tac的影响相对不敏感大鼠AA与深刻的抑制效应对CsA和Tac TA(数字1 (c)和1 (d))。除了CsA改变了CRC的均值±SEM IC₅₀控制的价值海里,μ米()。的价值也从完整的抑制(减少%)的水平%,抑制作用显著(;表1)。CsA相比,Tac诱发抑制ACh血管舒张不敏感()与right-ward CRC乙酰胆碱(IC的转变₅₀价值从一个控制增加价值海里,海里的Tac),减少从%,% (,见图1 (c)和1 (d)和表1)。

SNP的增加也产生浓度与完全抑制血管舒张反应PE-constricted助教和AA环前的CsA或Tac(控制数据如图2和表2)。而值达到了100%的准备,TA环相对较低的集成电路更加敏感₅₀值比AA SNP戒指。添加或CsA Tac未能改变显著IC₅₀和值SNP助教或AA大鼠主动脉环(尽管敏感性差异数据2(一个)- - - - - -2 (d)和表2)。

4所示。讨论

本研究的主要发现报道的观察CsA抑制endothelium-dependent血管舒张比Tac在更大程度上,这胸的效果更明显比大鼠主动脉的腹部。急性在体外比较数据在本研究报告与高血压的发病率是一致的发展以前血压正常的肝脏或心脏移植受者接受CsA和Tac。高血压在约80% -90%的患者相比,那些正在接受CsA相对较低(50% - -60%)患者接受Tac治疗高血压的发生率[14- - - - - -16]。另一个最近的报告也表明,Tac显示得分明显降低()比CsA时增加动脉硬化和小型和大型动脉合规指数被认为是继CsA和Tac治疗肾移植受者接收这两个代理(17]。我们目前的功能的重要性在体外研究讨论了上述临床观察的光。

CsA和Tac是行之有效的有限公司,作为免疫抑制剂通过抑制钙调磷酸酶,钙,calmodulin-dependent serine-threonine蛋白质磷酸酶3 T淋巴细胞(18]。海拔在胞质自由钙水平T淋巴细胞抗原结合后的T细胞受体导致激活钙调磷酸酶促进一些细胞因子的转录基因导致器官排斥。有限公司提供保护转录这些细胞因子激活钙调磷酸酶。虽然两剂抑制磷酸酶,他们目标不同cytoplasmic-binding蛋白质。CsA还有抑制而Tac目标FK-binding蛋白质抑制磷酸酶(19]。这样细微的机制和网站的行动可能导致他们的微分影响血管的影响。参股的保护性免疫抑制效应还带有负面影响高血压的成本(16]。提出了许多不同的机制等高血压的发展(i) endothelium-dependent受损血管舒张由于减少代没有从内皮,(2)增加血管收缩剂肽的生产,ET-1,从内皮,(iii) endothelium-independent增强血管收缩的血管平滑肌,(iv)肾血管收缩,增加交感神经(v)升高驱动之后,激活肾素-血管紧张素系统导致氧化应激以及随之而来的血管收缩,和肾钠(vi)缺陷处理导致钠潴留(17]。尽管所有这些机制可能导致高度的血压,早些时候的研究提出,公司除了起到直接血管作用它对肾脏的影响(17]。早期的研究与公司提出了,他们可以调节endothelium-dependent以及endothelium-independent血管舒张(4- - - - - -11]。因此,重要的是要建立这些代理通过执行直接血管的影响在体外研究使用扫描仪的准备。CsA等参股的可能机制和Tac可能改变serine-threonine残留的磷酸化状态的内皮没有合酶(以挪士)导致以挪士表达和活性的降低。因此,减少内皮细胞中没有一代已经记录之前(7,8]。同样,抑制endothelium-independent膨胀诱发等直接nitro-vasodilators SNP也被建议(10,11]。然而,没有研究,比较两个CsA的影响和Tac在任何特定的脉管系统。本研究解决这个关键问题。本文虽然不是第一个报告之间的差异在生理变量CsA Tac,但比较体外功能描述:研究微分效应endothelium-dependent和独立血管放松在老鼠的助教和AA。

现在证实Tac是10强100倍比CsA有限公司(20.]。因此,我们选择的浓度比较急性的决心在体外CsA(1毫克/毫升)和Tac(0.1毫克/毫升)是合适的和合理的。我们证明的最优低浓度的CsA 30分钟导致废除endothelium-dependent血管舒张反应ACh胸大鼠主动脉环而孵化与Tac同样的时间导致只有部分抑制的反应。此外,Tac是更强有力的抑制剂乙酰反应的腹主动脉环的一部分。vasculotoxic CsA的影响的区域差异与深刻的抑制endothelium-dependent (ACh-mediated)和边际endothelium-independent (SNP-induced)在胸血管舒张,但不是在腹部主动脉环就得以证实的11]。在这项研究中,主动脉环收获在体外考试的紧张反应CsA慢性口服后血压正常的Sprague-Dawley老鼠的剂量20毫克/公斤十天或政府的长期的剂量50毫克/公斤7天。这种治疗后,组织是收获,在体外反应测定。相反,在我们的在体外研究中我们收获的助教和AA正常SD大鼠和安装在器官浴;后来我们血管扩张器响应之前和之后暴露的参股了30分钟助教和AA戒指。我们的数据表明,CsA的抑制作用是更深刻的TA与AA。韦贝克等人无法提供一个令人信服的解释为什么CsA选择性减毒endothelium-dependent ACh介导的血管舒张的助教而不是AA大鼠(11]。此外,没有抑制SNP-induced血管舒张在我们的研究中,这证实了低浓度的参股了我们使用没有影响cGMP介导的血管舒张反应等直接代理nitro-vasodilator SNP在细胞水平的特点。我们也证实孵化与CsA或Tac提高了PE收缩反应(肾上腺素能受体激动剂)助教或AA;然而,助教和AA之间响应模式是类似的。其他研究人员也表示,没有节段血管收缩剂反应诱发的PE差异胸和腹部大鼠主动脉环由于PE激活一个亚型肾上腺素能受体在区域(21]。因此,我们的数据确认在体外有限公司的影响与抑制endothelium-dependent血管舒张特别是器官浴孵化后30分钟。

现在证实ACh-induced endothelium-dependent血管舒张的释放不完全介导的主要管道容器如主动脉(22,23]。,血管直径减少可以招募,除了没有,其他内皮介质如endothelium-derived超极化因子(EDHF)和/或环前列腺素(PGI₂)维护血管舒张,即使没有释放是钝化23,24]。因此,在小血管等主要肠系膜动脉及其分支(肠系膜小动脉)或降序腹主动脉,血管舒张反应ACh坚持即使NOS抑制剂,包括L-NAME在媒介endothelium-dependent血管舒张疼是由代EDHF [25- - - - - -28]。有限公司发挥选择性的封锁以挪士表达式及其活动通过调节丝氨酸苏氨酸磷酸化网站号(8]。因此,参股了选择性地抑制只以挪士和不影响Ca^{2 +}依赖EDHF激活与小和中间电导Ca^{2 +}激活K⁺通道(SK_Ca和本土知识_Ca在部分大鼠降主动脉。没有调节血管舒张反应ACh助教。CsA和Tac抑制NO-mediated血管舒张课时由于serine-threonine磷酸化以挪士。很可能在减少以挪士CsA的影响是深远的活动虽然Tac是相对不敏感的急性后胸地区CNI孵化。这与先前的发现是一致的CsA影响血管功能(29日,30.]。没有备用或补充EDHF介导的血管舒张。因此,废除ACh-mediated血管舒张的CsA,很大程度的抑制血管舒张ACh Tac的加入。在AA,补偿EDHF-mediated血管舒张保持反应ACh尽管以挪士封锁所有限公司在这个地区。我们的功能数据表明,CsA更有效的屏蔽以挪士比Tac助教和AA环抑制剂效力的顺序是CsA > Tac和敏感性的抑制反应的顺序被TA > AA。这也是符合什么是在临床设置后高血压的发病率相对较高的CsA Tac治疗相比,虽然整个肾毒性和副作用neuotoxicity发生率Tac是相对较高(后18,31日]。先前的发现与在体外孵化的Tac小鼠主动脉器官浴显示受损endothelial-dependent放松反应空调采暖与改变细胞内钙释放影响以挪士(32]。显然,更多的研究是必要的调查的反应ACh确定合并后的存在和缺乏以挪士抑制剂(L-NAME)和EDHF抑制剂(apamin + TRAM-34) CsA和Tac维护在孵化中解决这些问题。

5。结论

我们的短期在体外功能研究显示,CsA更有效抑制endothelium-dependent Tac, ACh-induced血管舒张助教和AA。有地区差异对参股了TA是更敏感比AA封锁。此外,我们还发现,公司没有影响SNP-induced胸和腹主动脉血管舒张。

缩写

哦:	乙酰胆碱
有限公司:	钙调磷酸酶抑制剂
儿童权利公约:	量效曲线
客服人员:	环孢霉素的
以挪士:	内皮细胞一氧化氮合酶
ET-1:	Endothelin-1
EDHF:	Endothelium-derived超极化因子
没有:	一氧化氮
体育:	苯肾上腺素
Tac:	他克莫司
SNP:	硝普酸钠
特点:	血管平滑肌
助教:	胸主动脉
AA:	腹主动脉。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

作者感谢萨斯喀彻温省的政府提供的资金艾哈迈德教授Shoker支持这项工作通过肾移植项目,肾脏学,医学、萨斯卡通、加拿大皇家大学医院。