文摘

细胞细胞骨架,粘附受体,细胞外基质成分,及其空间分布基本在一个细胞的平衡机械传感的环境。我们表明,在肺损伤,细胞外matrix-integrin相互作用改变,这将导致信号改变和机械错义。错义,二次矩阵改变和细胞表面受体的改变,导致细胞刚度增加,受伤和死亡。我们已经确定了一个单克隆抗体β1整合素导致矩阵改造和提高细胞生存。抗体作为变构双重受体激动剂/拮抗剂调制器β1整合素。有趣的是,这种抗体逆转功能性和结构性组织损伤肺退行性疾病的动物模型。

1。介绍

组织再生包括成年细胞的去分化成干细胞状态,这些细胞进入新改建组织的发展,失去了一个相同的。组织修复被定义为替代纤维组织和正常组织的整合蛋白在这些过程是至关重要的。

整合蛋白膜生成蛋白质促进内部和外部之间的双向沟通的一个细胞。整合蛋白有能力将大量的分子细胞内外。这些分子的结合导致的传播信息的细胞,它能影响许多不同的细胞功能,包括细胞代谢活动。

整合素受体,许多类型的β1整合素是迄今为止最无处不在允许细胞检测大量毒素之间的刺激等,蛋白质激素、神经递质和大分子。已有大量的出版物记录的潜在作用β1整合素在组织发展和修复多种组织类型(了1])。很明显,β1整合素起着至关重要的作用在产后皮肤发展和伤口愈合,上皮的损失β1整合素引起广泛的皮肤水泡和伤口愈合的缺陷。最近,有活性的药用化妆品发展的兴趣β1整合素针对配方。摘要研究发现后就是这样一个例子岩藻vesiculosus及其对皮肤疤痕和老化的影响(2,3)后来发现主要归因于alpha2和β1整合素[4]。

整合蛋白,包括β1整合素,表现出全球结构重排和暴露的配体结合位点在激活(5]。细胞的整体实力粘性或贪欲,是由亲和力和化合价(这是反过来由受体的密度及其配体在细胞表面,以及空间和几何布局和运动)(5]。最近的证据表明,亲和力和活动性密切相关的整合蛋白粘着斑集群的大小(6,7]。总的来说,整合蛋白可能有三个主要的细胞外领域的构象;低亲和力,弯曲的构象;扩展的构象与封闭的帽子代表一个中间亲和状态;高亲和性扩展ligand-binding-induced形式,以开放的帽子(8- - - - - -10]。

改变整合蛋白的构象,而不是表达水平已报告在生理和病理改造过程,包括神经突产物,纤维化,哮喘,癌症,和伤口愈合在很多(11- - - - - -14]。成功开发疾病修饰治疗,应该有利于救援或补充枯死细胞通过激活固有除了简单的干细胞再生修复过程。换句话说,改变细胞与其他细胞之间的相互作用及其环境继续提高他们生存和功能异常可能缓解慢性,正在进行细胞损失,许多进步的退化性疾病的一个特点。我们提出,组织修复可能通过救援由机械抑制细胞死亡信号细胞收到异常环境。一个关键的细胞表面受体的附着力β1整合素。我们认为构象的调制β1整合素可能导致细胞骨架改变组织和细胞刚度导致增加对氧化应激的敏感性和死亡,因此,预防这些变化可能治疗中获益。在这里,我们表明,我们已经识别出一个特定的β使用单克隆抗体1整合素的目标模式,我们已经证明,保护组织损伤和促进修复。抗体作为变构双重受体激动剂/拮抗剂调制器β1整合素,导致增加矩阵改造,增强细胞的生存。

2。结果

2.1。的影响β1整合素在Elastase-Induced信号调制

作为一个模型组织改造的疾病,我们调查的活动β1整合素使用一个在体外elastase-induced损伤模型。coculture初级,成人肺成纤维细胞与NCI-H441肺细胞覆盖物,循环机械刺激下,受到弹性蛋白酶治疗。

调查的参与β1整合素激活elastase-induced信号中,我们使用三种不同的单克隆抗体β1整合素。第一是粘连阻塞克隆,据说JB1a,目标主要是氨基酸82 - 87组成的混合域的一部分(15]。我们也使用了粘连阻塞克隆,AIIB2,结合氨基酸残基在一个域(207 - 21816)、甘蓝型广泛报道没有功能影响,结合混合动力/ EGF重复区域(17]。

弹性蛋白酶与细胞培养诱导信号蛋白磷酸化的增加行动的下游β1整合素(图1(a))。过程中受伤,pAKT水平增加,其次是瞬态增加phospho-cJUN和phospho-JNK(图1(a))。其他未发现显著变化12磷蛋白质在采样时间点。


图1
PPE-induced损伤的影响,JB1a治疗(a)激活下游信号的beta1整合素在机械拉伸(星号表示统计学意义 PPE相比)和(b) beta1整合蛋白构象激活所示增加使用反染色β1整合素抗体9 eg7承认主管受体配体相比,染色使用nonconformation依赖抗体(甘蓝型)。

当β1整合素受抗体克隆JB1a没有损伤,对下游的信号没有明显影响。然而,当JB1a添加elastase-induced受伤期间,它废除所有elastase-induced信号蛋白的磷酸化的变化。并没有观察到这种效应与AIIB2或甘蓝型(图2(a))。


图2
PPE-induced损伤的影响,针对beta1整合素(a)上使用AIIB2和甘蓝型克隆激活下游信号的beta1整合素在机械拉伸(星号表示统计学意义 PPE相比)和(b) beta1整合蛋白构象激活所示增加使用反染色β1整合素抗体9 eg7承认主管受体配体相比,染色使用nonconformation依赖抗体(甘蓝型)。
2.2。Elastase-Induced损伤的影响β1整合素活性和本地化

接下来我们研究了弹性蛋白酶的影响在配体结合的活动β1整合素使用配体主管特定的反β1整合素抗体9 eg7。配位能力的状态可以是任何中间生理构象或完全激活扩展构象(19]。弹性蛋白酶引起配位主管/活动的增加β1整合素表达明显的染色模式如图1(b)的调制β1整合素,使用JB1a,废除了ligand-competent elastase-induced增加β1整合素(图1(b))。然而,反β1整合素克隆甘蓝型强ligand-competent构象elastase-induced增加(图2(b))。

弹性蛋白酶的影响和JB1a ligand-competent受体的水平不仅仅是由于细胞表面表达(图的变化1(c))。然而,初步测量表明,弹性蛋白酶增加了胞质fraction-associatedβ1整合素也可能归因于回收或退化。地址,我们进行了一次分析β1整合素膜分数。弹性蛋白酶诱导的改变β1整合素回收,影响被JB1a但不是甘蓝型(图3)。elastase-induced的进一步证据β1整合素激活的增加caveolin-1磷酸化后两个小时的接触弹性蛋白酶;再一次被JB1a(图的变化4)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
PPE-induced损伤的影响(0.6 U /毫升)和定位beta1整合素使用JB1a (1 ug /毫升)甘蓝型相比(1 ug /毫升)克隆的动力学beta1整合素水平在细胞膜上在体外用人类肺coculture。(一)细胞的免疫印迹膜的表达β随着时间的推移1整合素。蛋白质提取被加载在平等的浓度(25μ克)。(b)的光密度分析污点纠正使用肌动蛋白作为内部控制。
(一)
(一)
(b)
(b)
图4
PPE-induced损伤的影响(0.6 U /毫升)和定位beta1整合素使用AIIB2 (1 ug /毫升)和甘蓝型(1 ug /毫升)克隆磷酸化caveolin-1水平膜分数。(一)代表的屁股 。加载控制总量的蛋白质(50μ克)。(b)的光密度分析污点纠正使用肌动蛋白作为内部控制。
2.3。JB1a构象的影响β1整合素

进一步确定JB1a的药理作用方式行动,我们质疑的影响见JB1a由于其影响β1整合素链变构效应。我们第一次预计JB1a抗原决定基的位置的基础上的理论3-dimentional结构β1整合素(图5(a))。然后,我们开展了烦恼的研究使用不依从Jurkat细胞。FITC-labelled LDV环肽用于标签alpha4负责人β1整合素,亲脂性的染料R18用于标签细胞膜。LDV-FITC作为供体和R18作为受体(20.]。流式细胞仪是用于采集和测量。JB1a引起构象激活当添加在基线和抑制完整的构象激活诱导的二价阳离子,Mn2 +。JB1a-induced变化导致烦恼效率表明一个中间部分扩展构象Mn相比2 +和其他已知的抑制或激活抗体(数据5(b) -5(e))。


图5
(一)JB1a抗原决定基的位置映射由镍和威尔金斯(15)使用polyview产生3 d中描述(18]http://polyview.cchmc.org/polyview3d.html烦恼分析展示。(b)的基本构象beta1整合素和锰2 +全身的整合素激活。JB1a的影响(c),甘蓝型(d)和B44 (e)整合素在基线和锰2 +全身的整合素激活使用LDV-FITC小分子被烦恼和R18 Jurkat细胞。LDV绑定是绘制平均通道荧光(MCF)与时间。

结合这些研究结果表明,JB1a-mediated影响的药理作用方式β1整合素是一个变构双重受体激动剂/拮抗剂。

2.4。构象的调制β1整合素抑制Elastase-Induced细胞膜成分的变化

使用混合epithelial-mesenchymal在体外文化,我们发现弹性蛋白酶增加中性鞘磷脂酶活性是暂时性的;的抑制效果β通过抗体JB1a(图1整合素结合6(一))。不影响酸性鞘磷脂酶被发现在相同的条件下。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图6
PPE-induced损伤的影响(0.6 U /毫升)和JB1a治疗(1 ug /毫升)在体外用人类肺coculture文雅collagen-coated表面。影响测量在(a)中性鞘磷脂酶活性在文化受到机械拉伸2 - 10%的幅度在1赫兹( ),(b) f -肌动蛋白使用三维重建图像的人类肺coculture受伤后使用弹性蛋白酶演示f -肌动蛋白的形成(蓝色)和半胱天冬酶激活(红色)3/7。神经节苷脂GM1对细胞membrane-green及其抑制JB1a在玻璃上培养的细胞( ),(c) ATP水平( 和每个包括单独测量细胞培养在96 - 8井孔板)。(d)细胞电阻抗( )。
2.5。构象的调制β1整合素抑制肌动蛋白聚合Elastase-Induced变化和细胞阻抗

使用我们的在体外文化系统中,我们跟踪的标签单体的肌动蛋白,并演示了增加新创f -肌动蛋白形成过程中elastase-induced损伤数据6 (b),12网上,S1-S3补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2012/768720)。形成f -肌动蛋白单体的G-actin能源的依赖,以及ATP耗竭条件下,有一个单体的净转换G-actin聚合物构成的。在cocultures,弹性蛋白酶ATP的水平降低,但这种反应是被JB1a(图6 (c))。

以证实这一发现对细胞力学性能,我们研究了弹性蛋白酶在细胞阻抗的影响。有一个最初的下降和复苏后的阻抗变化的媒体一致应对突然伸展,先前报道(21]。JB1a抑制elastase-induced减少细胞阻抗(图6 (d))。

2.6。构象的调制β1整合素抑制Elastase-Induced半胱天冬酶激活

然后我们调查的影响弹性蛋白酶激活半胱天冬酶的作用β1整合素elastase-induced细胞死亡。弹性蛋白酶诱导半胱天冬酶激活后3小时暴露,导致detachment-induced上皮细胞的细胞凋亡(女性)(数据7(a)和S1-S3)。调制的β1整合素使用JB1a阻止半胱天冬酶的激活。然而,强有力地抑制反β1整合素抗体6 s6,这也是引起同型的聚合,诱导半胱天冬酶激活(图7(b))。


图7
PPE-induced损伤的影响(0.6 U /毫升)和定位beta1整合素使用JB1a (1 ug /毫升)相比6 s6克隆(1 ug /毫升)和广谱半胱天冬酶抑制剂,ZVAD-fmk,半胱天冬酶激活3/7在体外用人类肺coculture在机械拉伸( )。与*星号表示统计学意义 和* * 相比于PPE。
2.7。构象的调制β1整合素逆转Elastase-Induced肺气肿在老鼠身上

调查的意义β1整合素损伤疾病环境中改造是一个关键的组件,我们建立了小鼠模型引起的肺气肿气管内的弹性蛋白酶的安装。老鼠灌输与弹性蛋白酶在第一天和肺损伤随之而来。在后来的时间点,他们反处理β1整合素单克隆抗体,JB1a绑定β1整合素在小鼠组织(22),或车辆,一旦14天(21天组,21 d)或在天21日和28(35天组,35 d)。在随后的调查中,严重的肺气肿是诱导和JB1a B44克隆被灌输在21天、28天前肺功能评估35天。两个克隆证明大鼠β1整合素(图8)。


图8
JB1a和B44免疫反应性与beta1整合素验证人类组织和他们的大beta1整合素在小鼠组织。图片收集使用×40油镜头和蔡司LSM510样品形貌显微镜与奈奎斯特设置。由此产生的图像是deconvolved,三维图像重建使用惠更斯软件(科学卷成像(SVI),荷兰)。

弹性蛋白酶受伤后的21天,有一个显著的进步左倾趋势close-chested呼吸道压力-容积曲线(PV)的老鼠,尤其是集团(图35天9(一个))。JB1a,因为作为一个气管内的剂量在这个时间点,逆转的损失呼吸引起的弹性反冲弹性蛋白酶治疗(图9 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图9
猪胰弹性蛋白酶的影响(PPE, 0.2 U / g)对小鼠的呼吸功能及其逆转使用anti-beta1整合素抗体JB1a(3毫克/公斤)。(a)的影响PPE上意味着在小鼠呼吸道压力-容积曲线的21天(21 d)和35天(35 d)滴剂及其逆转后JB1a(车辆=阿明费)。(b)的逆转PPE-induced增加准静态倒电容之间的5和9厘米H2O通过JB1a治疗损伤后不同时间点。(c)的意思是线性拦截(Lm)的测量21 d和35 d组。 35 d组和 在21 d组。(d) TUNEL染色证明PPE-induced JB1a治疗后肺损伤的影响。(c)的量化TUNEL阳性细胞在肺组织的部分从21 d和35 d组后PPE-induced损伤和JB1a治疗( 每组)。与*星号表示统计学意义 ,* * 和* * * 相比汽车。

除了功能特征的逆转,JB1a治疗相关的结构性修复,通过组织学和形态测量学(图评估9 (c))。在elastase-treated肺、细胞凋亡被TUNEL分析表明在21到35天,即使没有炎症。这是预防JB1a治疗(图9 (d))。没有Ki67的疣状细胞增殖的变化。的功效β1整合素调制使用克隆JB1a很明显甚至在更严重的损伤弹性蛋白酶的高剂量时使用。(图10)。


图10
剂量反应的影响猪胰弹性蛋白酶(PPE, 0.2 U / g和0.3 U / g)对小鼠的呼吸功能及其逆转使用anti-beta1整合素抗体JB1a。PPE的影响意味着在小鼠呼吸道压力-容积曲线从35天(35 d)滴剂及其逆转后JB1a(车辆=阿明费)。

当我们测试的影响β1整合素调制使用JB1a相比,克隆B44后35天集团的协议相同,B44可比剂量(数据无显著影响(11日)和11 (b))。克隆B44相似性最接近的构象效应JB1a从我们担心结果。在平行的研究中,我们测试了强有力的抑制抗体,6 s6引起同型的聚合。同时6 s6没有影响控制动物,其效果elastase-treated对动物有害和恶化受伤确凿proapoptotic效应在体外。

(一)
(一)
(b)
(b)
图11
猪胰弹性蛋白酶的影响(PPE, 0.3 U / g)对小鼠的呼吸功能及其逆转使用anti-beta1整合素抗体JB1a(3毫克/公斤)相比anti-beta1整合素克隆B44(3毫克/公斤)。(a)的影响PPE意味着在小鼠呼吸道压力-容积曲线从35天(35 d)后由JB1a而不是B44滴剂及其逆转。(b)的逆转PPE-induced静态倒电容增加5至9厘米H2O JB1a治疗( )。与*星号表示统计学意义 ,* * 和* * * 相比汽车。

图12
选定的帧在时间流逝epithelial-mesenchymal文化的视频拉伸(压缩视频)演示f -肌动蛋白的形成(蓝色)和半胱天冬酶激活3/7(红色)弹性蛋白酶的反馈(PPE, 0.6 U /毫升)及其抑制JB1a做细胞培养上玻璃。Sytox绿色是用于细胞跟踪。(一)控制,(b) PPE (0.6 U /毫升),和(c) PPE + JB1a (1 ug /毫升)。

3所示。讨论

在本文中,我们调查的作用β1整合素在肺气肿肺损伤和修复。我们证明了β1整合素在epithelial-mesenchymal变得变构激活细胞,推论,变构调节抑制elastase-induced受伤。我们进一步证明一个潜在的细胞机制β1 integrin-mediated效果。为此,我们建立了一个在体外elastase-induced肺气肿模型系统,复制的特性在活的有机体内。我们发现,变构调节β1整合素抑制半胱天冬酶激活,f -肌动蛋白聚合形成,细胞ATP水平和异常波动,总量的条件下β1的表达和激活抑制。我们的调查的主要发现是,直接变构调节β1整合素与特定单克隆抗体,功能性和结构性的逆转elastase-induced诱导组织损伤在活的有机体内。我们的研究结果支持了这样的观点,即cytomechanics细胞命运的决定因素和影响修复很重要。

激活后,integrin-linked激酶(同类)结合的胞质域β1整合素亚单位(23]。反过来,同类激活信号通路如倍数蛋白激酶B (PKB / AKT),抑制糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)活动影响转录因子结合的DNA序列(23- - - - - -25]。我们证明elastase-induced损伤激活下游信号β1整合素,这种效应被目标调制β使用克隆JB1a 1整合素。虽然JB1a称为抑制性抗体,影响elastase-induced信号是特定于JB1a因为目标β1整合素通过抑制克隆AIIB2没有克隆甘蓝型同样的效果也没有。elastase-induced激活的β1整合素被证明有一个证实增加ligand-competent的检测β1整合素也并非由于蛋白质含量增加,而是增加回收利用。相比之下,反β1整合素克隆甘蓝型诱导增加ligand-competent构象;前所述[产生影响26]。

α和分离β亚基的腿是一个关键的步骤,整合素激活弯曲结构转换为一个扩展的构象,从而允许headpiece-ligand接触(8]。因此,我们质疑的影响与JB1a由于其影响β1整合素链变构效应。事实上,针对相同的抗原决定基内的氨基酸序列JB1a混合域地区使用其他抗体报道稳定受体的生理中间状态以类似的方式作为一个变构拮抗剂(8]。我们采用了一个分析方法用于检测整合蛋白构象变化(20.,27),发现,在基线条件下,JB1a激活效应时充当一个构象的对手β1整合素与锰激活。我们已经检查了8其他克隆和确定最接近JB1a克隆其构象效应B44和小屋21克隆;这两个绑定到第二混合域β1整合素(综述(1])。因此,添加JB1a的报道影响,我们已经表明,它的功能作为受体激动剂和拮抗剂。

然后我们试图阐明整合素激活反应损伤的重要性。受体聚集,部分得益于与细胞蛋白相互作用如窖蛋白细胞膜流动性。细胞质膜的构成直接影响β1整合素功能和膜流动性以应对其他类型的损伤(28,29日],在[复审1]。在使用在体外混合epithelial-mesenchymal文化,我们发现弹性蛋白酶增加中性鞘磷脂酶活性是暂时性的;的抑制效果β1整合素抗体JB1a绑定。中性鞘磷脂酶协会最近已被证明在吸烟的肺损伤模型(30.]。

caveolin-1基因中断,这是参与整合蛋白聚集和激活,导致肺纤维化和损伤可逆的部分肝切除术后肝再生治疗血糖(31日),表示可能的能源保护的重要性。有趣的是,之前的报告表明,β1 integrin-mediated粘附调节那些高胆固醇膜microdomain内在化是由phosphocaveolin-1 [32)和caveolar内吞作用可以被小干扰RNA击倒β1整合素[33]。我们发现变构调节抑制elastase-induced窖蛋白磷酸化增强的想法,在受伤,整合素异常激活和聚集在elastase-induced损伤导致细胞损伤。

整合素激活可以通过outside-inside发生和/或内外信号。我们从我们的结果,outside-inside假设β1整合素信号和激活期间诱导损伤,可能是由于细胞外基质降解(了1])。矩阵的完整性已被证明会扮演一个关键的角色在各种损伤包括肺气肿34)和淀粉样蛋白β神经毒性(35]。事实上,未发表的数据显示,从我们的实验室β1整合素变构使用JB1a调制,但不是6 s6或TS2/16,导致增加perlecan [36];改变对预处理部分敏感与环己酰亚胺和非特异性的金属蛋白酶(mmp)活化剂aminophenylmercuric醋酸(APMA)。perlecan的变化在应对JB1a伴随着增加组织抑制剂metalloproteinase-1 (TIMP1)最初和pro-MMP-9随后。

由于细胞整合素激活也会发生变化(37,38]。各种报告强调了等离子体膜脂质成分的影响β1整合素作用[29日,39,40]。神经酰胺增加在elastase-induced受伤已被证明导致细胞凋亡(30.,41]。我们已经表明,elastase-induced损伤的发病,中性鞘磷脂酶可能导致增加β1整合素激活;抑制的调制产生影响β使用JB1a 1整合素。

整合素激活与增加与肌动蛋白细胞骨架的接触(42,43]。最近,肌动蛋白聚合作用已被证明是影响香烟模型(44]。我们调查了肌动蛋白聚合在体外系统elastase-induced过程中损伤的影响β1整合素的调制过程。我们使用活细胞成像标记单体的肌动蛋白结合确定增加新创的形成肌动蛋白聚合自phalloidin染色未能证明新形成的聚合。我们能够显示肌动蛋白聚合过程中增加elastase-induced受伤。这种效应被调制的抑制β1整合素。

然后我们调查elastase-induced损伤如何影响ATP。在ATP耗竭条件下,有一个单体的净转换G-actin造成聚合物构成的一个改变的比率ATP-G-actin和ADP-G-actin合成f -肌动蛋白形成分散聚合(45]。我们选择描述ATP动态变化在体外elastase-induced后受伤。我们发现不仅长期接触后的水平相对较低,而且前减少,异常波动时检测到的接触弹性蛋白酶。这些反应被抑制的变构调节β1整合素。

由于细胞膜成分和肌动蛋白细胞骨架的改变,我们试图确定这些变化是否有细胞力学性能的影响。我们已经表明,细胞阻抗改变elastase-induced过程中受伤,这种效应被调制的抑制β1整合素。尽管这个测量不区分细胞成分的变化造成的影响,和交互,当结合肌动蛋白聚合和细胞膜成分改变的证据,它进一步支持我们的概念。有强有力的证据的作用的肌动蛋白细胞骨架在细胞存活和分化,主要来自研究关注于胸腺素β4所示。胸腺素β4功能主要是隔离蛋白肌动蛋白单体和促进伤口愈合和心脏修复通过影响细胞的生存46]。

此外,我们能够显示半胱天冬酶激活端点检测和实时。Elastase-induced半胱天冬酶激活被调制的抑制β1整合素。然而,完全抑制β1整合素使用6 s6克隆(强有力的抑制剂和诱导物的同型的聚合)激活半胱天冬酶。

我们的研究结果支持假设细胞力学在细胞命运中发挥关键部分,因此影响修复。调查这在疾病环境改造是一个关键的组件,我们建立了小鼠模型引起的肺气肿气管内的弹性蛋白酶的滴注法。肺气肿是一种不可逆转的组件的慢性阻塞性肺疾病,全球发病率和死亡率的主要原因。

我们提出,在不可逆转的适度严重肺气肿,β的推论1整合素就变构激活,才可能变构调节成为治疗有益。活化抗原表位的表达β1整合素,因此完全扩展的活性构象,在人类疾病的了解甚少,由于技术上的限制。然而,最近,配位能力的存在β1整合素从诱导痰嗜酸性粒细胞哮喘病人的样本进行了研究,发现与(气道高反应47]。调制的β1整合素使用JB1a逆转elastase-induced肺气肿当管理两个不同的时间点后和肺气肿的稳定。它没有影响汽车灌输的动物。这证实了无意识的肺功能测试和结构分析使用均值线性拦截。之前我们也认定调制β1整合素函数允许在肺部疾病的分隔作用继续通过改变GATA-6池和TTF-1表达细胞(48]。

虽然克隆B44,最接近JB1a-induced构象的影响效果,显示出一些影响elastase-induced肺功能异常,它减少了肺合规在正常的动物。我们还没有决定是否克隆B44诱导纤维化或变更在气道反应来解释观察到的功能效果。

因此,针对β1整合素JB1a诱导前所未有的疾病修饰效果。关键事件,从我们的研究明显,细胞表面受体分布的协同变化导致受体活动状态和改变细胞膜成分的变化。这种效应使细胞更加适应力学环境改变,从而减少的趋势损伤导致细胞刚度增加,损失的能量,并最终死亡。

4所示。材料和方法

4.1。信号

成人肺成纤维细胞(写明ATCC CCD-8Lu)被播种到collagen-I-coated BioFlex 6-well盘子0.5×106/好。第二天,NCI-H441细胞被播种的成纤维细胞在同一密度。与媒体含有0.1% FCS细胞被饿死。板块受到拉伸在2 - 10%正弦拉伸1赫兹为2、4或6小时。PPE添加0.3 U /毫升单独或结合JB1a (1μg / mL,来自约翰·威尔金斯的礼物马尼托巴省),AIIB2 (1μg / mL,爱荷华大学发展研究杂种细胞银行),或甘蓝型(1μg / mL, Santa Cruz)。结束的时候,媒体是吸气和蛋白质从细胞中提取层使用Bio-Plex细胞溶菌作用工具包(Bio-Rad)。蛋白质浓度溶解产物用BCA法测量。磷蛋白质溶解产物进行分析(50μg /样本)使用Bio-Plex磷15-Plex分析工具包(Bio-Rad)一种蛋白激酶,c-Jun,分子,ERK1/2, GSK3,组蛋白H3, HSP27,我κB IRS-1物、MEK1 P38 MAPK, Src, STAT3和6。测量是根据制造商的指示。

4.2。β1整合素成像

成人肺成纤维细胞(位于马里兰州Rockville,写明ATCC CCD-8Lu)被播种到collagen-I-coated玻璃盖玻片。第二天,NCI-H441(写明ATCC,罗克维尔市,MD)被播种的成纤维细胞在同一密度。与媒体含有0.1% FCS细胞被饿死。板块受到PPE在单独或结合JB1a 0.3 U /毫升(1μ克/毫升)或甘蓝型(1μg / mL) 1和3小时。这些细胞被然后用冰冷的4%多聚甲醛固定。细胞被封锁使用超块(皮尔斯)和双应用使用抗体配位能力β1整合素(9 eg7 BD生物科学)和JB1a紧随其后Alexa 488 anti-rat和Alexa 555 -反-鼠标,分别与TO-PRO3核染色。图像获得使用蔡司LSM 510×40油镜头和原始图像提出了利用LSM图像浏览器。

4.3。荧光共振能量转移(FRET)

人类白血病Jurkat(克隆E6-1)细胞株从写明ATCC购买(马里兰州罗克维尔市)。氯化十二烷基罗丹明B (R18)从分子探针。FITC-conjugated模拟的α4特定肽4 - ((n′2-methylphenyl) ureido) -phenylacetyl-L-leucyl-L-aspartyl-L-valyl-L-prolyl-L-alanyl-L-alanyl-L-lysine (LDV-FITC)是合成Commonwealth生物技术(弗吉尼亚州里士满)。

细胞,并使用BD LSRFortessa bead-based荧光进行了测量。LDV-FITC绑定的详细分析是前面描述的20.]。细胞治疗一系列浓度的荧光配体(通常经历海里)的二价阳离子Mn(1毫米2 +),最终选择4纳米实验。类似的研究R18和10 um浓度达到饱和绑定。所有的实验都是在消息灵通的缓冲区(110毫米氯化钠,10毫米科,10毫米葡萄糖,MgCl 1毫米230毫米,玫瑰,pH值7.4)包含0.1%的葬礼。Jurkat细胞用于1×10的密度6细胞/毫升。动力学分析是前面描述的(20.]。简单,细胞在玫瑰preincubated缓冲区有或没有二价阳离子10分钟37°C。样品分析了30年代建立一个基线,然后添加荧光配体LDV-FITC是流式细胞仪广告。额外的测量进行了反的存在β在1 - 10 1整合素抗体μ克/毫升。研究的抗体增加了1分钟开始前的测量或30秒后添加LDV-FITC观察到没有任何区别。数据是600秒200000事件。数据被转换为意味着通道荧光随时间使用FlowJo软件(树明星,Inc .,俄勒冈州,美国)。

4.4。细胞分离
4.1.1。β1整合素

成人肺成纤维细胞(CCD-8Lu)被播种到collagen-I-coated文化菜肴。第二天,NCI-H441细胞被播种的成纤维细胞在同一密度。与媒体含有0.1% FCS细胞被饿死。板块受到PPE在单独或结合JB1a 0.3 U /毫升(1μ克/毫升)或甘蓝型(1μg / mL) 1和3小时。在实验的最后,媒体使用MEM-PER吸气和细胞层提取蛋白质提取工具包(皮尔斯),蛋白质化验膜分数使用BCA方法,和50μg到10% sds - page分离,转移到Hybond-ECL(通用电气医疗集团)。膜都是沾着朱红色年代(σ)评估的质量传输和加载和探索β1整合素(JB1a)其次是HRP-labelled二级抗体和使用ECL-Plus开发(通用电气医疗集团)和暴露于Hyperfilm发射极耦合逻辑(通用电气医疗集团)。光密度分析进行了使用ImageJ (NIH)。

10/24/11。窖蛋白

在一组额外的实验中,细胞培养到所述collagen-I-coated Bioflex盘子和受到拉伸2 - 10 10%,30分钟,1到3个小时。PPE添加0.3 U /毫升单独或结合PPE添加0.3 U /毫升单独或结合JB1a (1μAIIB2 (1 g / mL)μg / mL),或甘蓝型(1μg / mL)。结束的时候,媒体是吸气,蛋白质从细胞层中提取分离利用区划的蛋白质提取工具包(有色,Biochain)。蛋白质含量测定采用BCA的方法。溶菌产物被分离到10% sds - page使用Biorad迷你千变万化3 Dodeca电泳细胞同时运行12凝胶可以确保光密度分析的有效性。凝胶被转移到ECL-hybond发射极耦合逻辑。膜都是沾着朱红色年代(σ)评估的质量传输和加载。探讨了ECL膜β1整合素使用JB1a(慷慨的礼物从约翰·威尔金斯,马尼托巴省)和小鼠肌动蛋白抗体(NH3, Abcam),或(兔子反,BD生物科学)和phosphocaveolin窖蛋白- 1 (BD生物科学)。二次检测是使用680 nm和800 nm荧光抗体(LiCor),和这些墨迹图像,使用LiCor系统。光密度分析进行了使用ImageJ (NIH)。

4.4.3。鞘磷脂酶活性

成人肺成纤维细胞(CCD-8Lu)被播种到collagen-I-coated BioFlex 6孔板为0.5×106/好。第二天,NCI-H441细胞被播种的成纤维细胞在同一密度。与媒体含有0.1% FCS细胞被饿死。板块受到拉伸在2 - 10%正弦拉伸1赫兹为2、4或6小时。PPE添加0.3 U /毫升单独或结合JB1a (1μg / mL)。结束的时候,媒体是吸气,液氮快速冻结,lyophilised使用Amplex红鞘磷脂酶和酶活动化验分析工具包(英杰公司)根据制造商的指示。

4.4.4。延时研究

细胞培养中描述的方法在50000细胞/膜上胶原蛋白我Bioflex膜使用的硅胶垫圈10毫米直径。细胞缺乏与媒体含有0.1% FCS, Syto 16(分子探针)。媒体被免职,Alexa-Fluor 647贴上G-actin (100μg /膜)使用流入从兔子被加载(分子探针)。PhiPhiLux-G细胞被加载2D2半胱天冬酶激活(OncoImmune)的可视化。膜被安装到StageFlexer (FlexCell),放置在舞台上的正直Leica-TCS-NT共焦显微镜系统(徕卡Microsystems GmbH,海德堡,德国),并受2 - 10%循环拉伸1 Hz长达6小时。图片收集同时从3通道每隔1分钟,使用×10的镜头。由此产生的延时电影与伊万里瓷器整理和分析软件(Bitplane AG)、瑞士)。在不同的时间点在研究过程中,膜的静态系列光学部分收购了三个荧光通道时辅以brightfield通道图像的集合。

4.4.5。三维共焦显微镜

NCI-H441细胞和人类肺成纤维细胞培养如上所述在collagen-I-coated玻璃盖玻片在20000细胞在一个面积直径5毫米。媒体被Alexa-Fluor 647标签G-actin (30μg /盖玻片)使用流入从兔子被加载(分子探针)。PhiPhiLux-G细胞被加载2D2可视化的半胱天冬酶激活(OncoImmune)和FL-ganglioside 1 (GM1分子探针)想象等离子体膜。图像是通过4个独立渠道收集(GM1: ,半胱天冬酶 肌动蛋白: 并使用x63 brightfield)水透镜和蔡司LSM510样品形貌显微镜。由此产生的图像分析与伊万里瓷器软件(Bitplane AG)、瑞士)。三维图像重建。

4.4.6。ATP测量

在另一组实验中肺成纤维细胞和上皮细胞被播种到96多井盘子如上所述。这些细胞被饿死在媒体包含0.1% FCS在DMEM-glucose-free 0.1% FCS 45分钟前处理(我)PPE 0.3 U /毫升单独或(ii)之前PPE JB1a (1μg / mL)。在实验的最后,ATP水平是使用ATP生物荧光测量的工具(珀金埃尔默)。

4.4.7。电阻抗

欧洲互通性系统委员会监控小直径250微米电极的阻抗作为细胞生长的基质。当细胞生长在电极,他们阻碍电流。细胞分层描述之前到幻灯片(8 w10e,应用生物物理学)含有8井每箱装十圆250μ米直径并行活动电极连接在一个常见的黄金垫。PPE添加0.3 U /毫升单独或结合JB1a (1μg / mL)。阻抗监控使用欧洲互通性系统委员会的控制器模型1600(应用生物物理学)。

4.5。半胱天冬酶激活人类间叶细胞和上皮细胞Coculture测量

成人肺成纤维细胞(CCD-8Lu)被播种到collagen-I-coated BioFlex 6-well盘子0.5×106/好。第二天,NCI-H441细胞被播种的成纤维细胞在同一密度。与媒体含有0.1% FCS细胞被饿死。板块受到拉伸在0 - 5%,0 - 10%,或者2 - 10%正弦拉伸1 Hz 6小时。控制盘塑料或bioflex板块没有拉伸也包括在内。PPE添加0.3 U /毫升单独或结合JB1a (1μg / mL) 6 s6(1毫克/毫升)或ZVAD-fmk 10μm .年底曝光时间1,3,6小时,媒体是吸气和半胱天冬酶3活动化验使用Caspase-Glo 3/7 (Promega)根据制造商的指示。

4.6。大的β1整合素抗体

人类和小鼠神经细胞被固定在甲醛。细胞被封锁使用超块使用抗体(皮尔斯)和应用β1整合素(JB1a B44,来自约翰·威尔金斯的礼物马尼托巴)其次是Alexa 647 anti-mouse(分子探针)和核染色7-AAD(分子探针)。图像z栈获得使用蔡司LSM与奈奎斯特计算器设置(510http://www.svi.nl/NyquistCalculator)使用Plan-Neofluar 40 x / 1.30石油DIC透镜和原始图像deconuolved并使用惠更斯提出了3 d软件(科学卷成像SVI、荷兰)。

4.7。在老鼠身上PPE-Induced空气空间扩张模式

女性C57 / BL6小鼠(6 - 8周大)灌输气管内的与猪胰弹性蛋白酶(罗氏)之前详细(49)为0.2 U / g。伦理审查委员会批准的所有程序都是爱丁堡大学的。程序进行下一个项目颁发的牌照号码PPL60/3984英国内政部在动物(科学程序)法案1996。14天(21 d组)或21日和28天(35 d组),治疗小鼠气管内的与anti-integrin抗体JB1a在无菌PBS 3毫克/公斤。选择的剂量相当于使用的临床剂量的抗体α4β1整合素[50]。对照组与PBS JB1a或灌输最初B44 14天(21 d)或在天21日和28 (35 d)。额外的车辆与PBS对照组被灌输天1和14天(21 d)或1,21到28 (35 d)。我们已经进行了研究对照组灌输了一个同形像控制(MOPC21 Sigma-Aldrich)和没有看到效果。组治疗14天,动物被终止在21天(21 d),治疗组的21天、28天,动物被终止在35天(35 d)如下。这些动物犀牛使用钠pentobarbitone(45毫克/公斤),瘫痪用泮库溴铵(0.8毫克/公斤),和tracheostomised通风使用小动物呼吸机(Flexivent SCIREQ,蒙特利尔)8毫升/公斤,150次/分钟的速度和积极的呼气压力(偷看)3而言不啻结束2O。

在通货膨胀和通货紧缩压力-容积曲线得到逐步的方式运用体积扰动增量在16秒。压力信号被记录和压力-容积(p - v)曲线计算出每一步的高原。常数K是获得使用Salazar-Knowles方程和反映了通货紧缩的上层部分的曲率pv曲线。准静态倒电容反映了肺的静态弹性反冲压力在给定肺体积。这是通过计算p - v曲线的线性部分的斜率。

在一个额外的研究中,女性C57 / BL6小鼠(6 - 8周大)灌输气管内的0.3 U / g猪胰弹性蛋白酶(弹性蛋白产品)如上详细。在21天、28天的评分,治疗小鼠气管内的anti-integrin抗体JB1a或B44在无菌PBS 3毫克/公斤。对照组与PBS JB1a或灌输最初B44在21天、28天的评分。额外的车辆是根植与PBS对照组1天,21日和28日。肺功能评估如上所述。

4.8。组织化学

测量后,动物被牺牲和肺被移除和formalin-fixed 25厘米H的压力2O,石蜡包埋,切片在4μ米厚度。矢状的部分被用来从每个动物组织学和免疫组织化学损伤的评估和地貌形态示量分析(线性拦截,Lm)。每部分图片来自10个领域数字化使用Image-Pro 3.3 +(5.1版)和micropublisher RTV相机连接到蔡司Axioskope 10 x的目标。字段大小为0.83μ米×0.63μm。意思是线性拦截计算出每个字段(横向和纵向)线的长度除以肺泡拦截的数量。

4.9。细胞凋亡检测

终端deoxyribonucleotidyl转移酶- (TdT)介导的dUTP尼克结束标记(TUNEL)法分段评估红ApopTagTM工具包(Chemicon)。量化的数据积极凋亡细胞核染色使用×40石油收购目标的蔡司510 Axiovert共焦显微镜系统(卡尔蔡司有限公司韦林花园城,赫特福德郡,英国)。stage-tiling实用程序是用于收集的4×4平铺的图像,相当于总面积0.921毫米×0.921毫米,从肺部成像部分~ 8毫米×8毫米(从左、右叶两个瓷砖)。图片主要是肺泡组织构造。图像被转换为8位灰度,J和图像被用来计数细胞的总数。手动TUNEL阳性细胞数。

4.10。统计分析

所有数据使用SPSS分析窗口。数据分析使用一般线性模型和多元方差分析与事后 以及。

信息披露

r . AlJamal-Naylor和d·哈里森的发明者知识产权详细的调制的治疗效果β1整合素功能由r . AlJamal-Naylor和罗伯特·j·内勒(WO2005037313(2003年10月17日)和WO2008104808(2007年2月27日))。发明家是AVIPERO有限公司的联合创始人和股东发展反β1整合素人性化导致帕金森病、肺气肿和关节炎(http://www.avipero.com/)。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。

作者的贡献

r . AlJamal-Naylor和d·哈里森导致了知识产权、科学投入,规划和实施实验,和纸准备。l·威尔逊参加了共焦成像和时间流逝实验调查的损伤和修复的机制。b .哈里森初步进行β1整合素聚类(免疫荧光)和分离实验。美国麦金太尔ATP进行实验。f·罗西烦恼的研究导致了流式细胞术。m·马斯登在飞行员提供技术援助在活的有机体内研究。

确认

作者也想谢谢罗伯特·j·内勒的科学编辑指导和詹姆斯·g·马丁为他宝贵的科学建议。这项工作是支持首席科学家办公室的一部分,苏格兰政府。所有的工作都是由首席科学办公室(苏格兰)赠款CZB4/129和CZB4/602除了养老资金从爱丁堡大学的病理学分工。

补充材料

时间流逝的视频epithelial-mesenchymal文化在拉伸2 - 10%幅度在1赫兹长达6小时(压缩视频)展示了S1。基线f -肌动蛋白的形成(蓝色)和半胱天冬酶激活3/7(红色,Sytox绿色是用于细胞跟踪)控制文化,S2。形成f -肌动蛋白的增加(蓝色)和半胱天冬酶激活3/7(红色),以应对弹性蛋白酶(PPE, 0.6 U /毫升)和S3。增加f -肌动蛋白的抑制(蓝色)和半胱天冬酶激活3/7(红色),以应对弹性蛋白酶(PPE, 0.6 U /毫升)通过瞄准β1整合素使用JB1a (1 ug /毫升)。

  1. 补充材料1
  2. 补充材料2
  3. 补充材料3