文摘

抗胆碱酯酶(antich)用于治疗阿尔茨海默氏症。比较两个antich的影响,甲磺酰氟(MSF)和多奈哌齐,在海马细胞外水平的ACh调查在活的有机体内microdialysis在自由移动的老鼠。无国界医生组织在1和2毫克/公斤产生剂量依赖性增加空调采暖射流从10分钟注射后至少3小时。在2毫克/公斤,增加还是出席24小时。多奈哌齐1毫克/公斤显示一座类似的但是小一些的效果,而且,矛盾的是,2毫克/公斤显示不一致的效果。无国界医生组织在1和2毫克/公斤的海马乙酰胆碱酯酶活性下降54.8和20.1%的控制,分别。这些结果表明,无国界医生组织是一个合适的候选人阿尔茨海默病的治疗。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)是一种缓慢进行性神经退行性疾病,其特征是老年斑包含的存在β淀粉样蛋白(β)在脑组织,tau-neurofibrillary在神经元缠结,不同transmitter-containing轴突的损失,尤其是胆碱能神经(1,2]。不幸的是,治疗策略针对淀粉样斑块与plaque-removing疫苗或γ分泌酶调节器有令人失望3,4]。

人们普遍认为胆碱能系统的进行性神经退行性变的基础,至少在某种程度上,阿尔茨海默病(AD)的认知恶化[5- - - - - -7]。支持这一假设的结果令人鼓舞的症状改善临床试验使用疼痛抑制剂(8,9通过增强中枢胆碱能功能),理论上通过允许乙酰胆碱(ACh)能保持更长时间的在突触间隙。有趣的是,一些疼痛抑制剂也已报告是有效的也在减少淀粉样斑块10,11]。

甲磺酰氟(MSF),大脑疼痛的长效和高度特定抑制剂(12,13),已被建议作为一个安全有效的姑息治疗老年性痴呆的阿尔茨海默型14),以及一个方法来减弱stroke-induced赤字在一个简单的学习和记忆任务13]。因此,本研究的主要目的是比较MSF-induced增加海马细胞外ACh,治疗目标的地区之一的广告,与多奈哌齐的影响,参考药物广泛用于症状治疗的广告。为此,本研究通过测量海马的细胞外ACh进行在活的有机体内microdialysis自由移动的老鼠在无国界医生组织管理和多奈哌齐。

2。材料和方法

男性Sprague-Dawley老鼠(日本SLC、滨松、日本)加权每笼200——250克被安置在标准实验室条件下(23±1°C,湿度55±5%)免费获取标准颗粒饮食(毫克当量、东方酵母有限公司东京)和饮用水随意灯在喂饲,20:00。动物处理和程序依法进行了动物福利法案和指导的护理和使用实验动物在岩手大学动物实验委员会批准,日本。每组五个老鼠。

所有试剂都是分析级。无国界医生组织是购自Sigma-Aldrich(美国密尔沃基)和((R, S)6-dimethoxy-1-indanon-2-yl 1-benzyl-4 -[(5日)]methylpiperidine盐酸多奈哌齐是礼物卫材有限公司有限公司(日本东京)。

据侯赛因Microdialysis实验等。15]。简单地说,老鼠与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,i.p。)然后放在一个立体定位器(科夫仪器)。指南的微量透析可把时程延长套管(AG-8 Eicom,日本京都)植入左侧海马用以下协调(前囱):A- - - - - -L + 4.8毫米和5.8毫米,,V- - - - - -4.5毫米。手术后,动物们回到家里笼,允许恢复。至少3天前开始微量透析可把时程延长

乙酰胆碱和胆碱含量不同的动物被量化的透析液通过高效液相色谱仪(HPLC)与电化学检测(ECD)。探测实验的日子,微量透析可把时程延长(A-1-8-02 Eicom,京都)小心地插入到海马通过引导插管。进口探头连接到一个2.5毫升的微量透析可把时程延长不漏气的注射器和林格氏溶液灌注(氯化钠147毫米、氯化钾4.0毫米,CaCl₂包含1 2.3毫米)μ恒流2 M毒扁豆碱水杨酸μ使用microperfusion泵L / min,允许自由移动的老鼠一立方有机玻璃框(30厘米×30厘米×40厘米)。

透析液收集在前30分钟是丢弃,以确保一个稳定的基线的乙酰胆碱释放。此后,20μL以10分钟的间隔采灌流液样本。在收集、20μL (1μM ethylhomocholine包含10毫米EDTA二钠是添加到每个样本作为内部标准。水平的乙酰胆碱和胆碱的透析液(20μL /注射)测定用高效液相色谱电化学检测(Eicom,京都,日本)配备一个酶柱(AC-ENZ Eicom,日本京都)。一个20μL样本的灌流液/ ethylhomocholine解决方案然后注入高效液相色谱配备儿童早期开发(测定、Eicom京都)和酶柱(AC-ENZ Eicom,《京都议定书》)。

乙酰胆碱和胆碱阳离子交换柱上分离(EICOMPAK AC-GEL, Eicom,京都)和十二烷基硫酸钠(0.5毫克/毫升)。的流动相由0.05磷酸盐缓冲剂(Na₂HPO₄12小时₂O) pH值8.2包含0.13毫米EDTA二钠,tetramethylammonium氯0.6毫米,1.2毫米SDS泵1毫升/分钟。保留时间和乙酰胆碱分别为7.3和13.2分钟,分别。

基底流出被定义为三个样本的平均产出药物管理局之前,和结果计算基线和乙酰胆碱的百分比。

建立基底流出后,动物收到以下IP注射之一:无国界医生组织(1或2毫克/公斤)或多奈哌齐(1或2毫克/公斤)溶解在车辆(80μL乙醇+ 88μL渐变20),准备1毫升总量等渗氯化钠。所有控制动物注射同样的等渗氯化钠/汽车解决方案同样的路线和体积(1毫升/公斤)的药物。

实验中,最后微量透析可把时程延长老鼠与氯仿安乐死,大脑被移除,探针的位置在海马体被视觉检查20μ冰冻切片。

乙酰胆碱酯酶化验,老鼠在一个平行组接受相同的注射无国界医生组织,多奈哌齐,或车辆在同一安排实验中使用的动物微量透析可把时程延长。三个脑区,海马、纹状体和大脑皮层(皮层)很快被解剖后冰在180分钟和24小时注射MSF或多奈哌齐然后均质在磷酸盐缓冲溶液(0.1米0.1米Na₂阿宝₄+ 0.1米KH₂阿宝₄,pH值8.0),其次是稀释相同的缓冲到200年,400年和200年组织重量,分别分析疼痛活动的方法Ellman et al。16碘化)与0.48毫米acetylthiocholine作为底物2分钟25°C使用uv - 240分光光度计(日本岛津公司公司,日本京都)在412海里。

乙酰胆碱和胆碱的细胞外水平个人老鼠相对于均值计算基底释放(前三10分钟连续样本的平均基底释放药物管理局为100%)。方差分析,其次是Dunnett事后考验的重复测量(治疗与时间),用于分析乙酰胆碱和胆碱基线变化以及测试的显著差异。一定程度的被送往显示显著的效果。

3所示。结果

无国界医生的注射和多奈哌齐(1和2毫克/公斤i.p。)没有产生任何可观察到的临床体征或症状的老鼠。流出的基础利率仅仅注射控制老鼠的海马pmol ACh / 10μL / 10分钟pmol胆碱/ 10μL / 10分钟()。在海马乙酰胆碱的反应在整个实验过程中车辆的治疗没有明显不同。

如图1无国界医生组织,增加了剂量依赖性的方式释放乙酰胆碱。无国界医生组织,在1毫克/公斤,引起显著(,)和长期的ACh海马的射流从10增加到180分钟回到控制水平后24小时无国界医生组织的管理。2毫克/公斤,高剂量的无国界医生组织产生一个一致的和相对较大的乙酰胆碱释放增加10到90分钟(),从120年到180年逐步减少min (,治疗后)。在2毫克/公斤MSF,海拔ACh流出仍高在注射后24小时()。

多奈哌齐对ACh流出也显示在图1。剂量为1毫克/公斤多奈哌齐产生一个小但是一致的增加空调采暖射流在前180分钟。然而,2毫克/公斤的剂量没有产生效果,存在剂量依赖的相关性和内在流出180分钟没有不同于动物实验获得的剂量1毫克/公斤(数据未显示)。

如图2,胆碱流出减少逐步从基础水平在整个过程中对每组注射后的第一个180分钟,无国界医生组织,多奈哌齐和控制,但回到基底24小时。降低不显著的组接受无国界医生组织或比对照组多奈哌齐。

无国界医生组织的影响和多奈哌齐对疼痛活动在海马体,纹状体和皮层在180分钟(图3(一个))和24小时(图3 (b)药品监督管理局如图后)3。无国界医生组织在1毫克/公斤减少疼痛活动在海马,纹状体,和皮质约50%,55,51岁,和49%的各自的控制活动。2毫克/公斤,无国界医生组织生产了80 - 90%的抑制,使疼痛活动大约12,各自的控制活动的11%。多奈哌齐1毫克/公斤没有产生任何重大影响疼痛的活动三个大脑区域在注射后180分钟。剂量的2毫克/公斤,然而,在大脑皮层产生显著减少疼痛活动但无法海马和纹状体180分钟后管理(图3(一个))。图3 (b)也显示了大脑区域疼痛活动24小时后1毫克/公斤的无国界医生组织或多奈哌齐。疼痛的活动在海马,纹状体,和大鼠皮层无国界医生组织管理是44岁的36和41% (分别控制0.001)值。在24小时,没有其他活动的显著差异并没有观察到疼痛的三个大脑区域之间的老鼠多奈哌齐治疗或车辆。

4所示。讨论

我们以前报道,单一剂量的无国界医生组织在1.5毫克/公斤南卡罗来纳州extraterminal ACh和细胞质的浓度的显著增加小鼠的大脑皮层中(17]。在这些实验中,增加部分内容的大脑组织体外和均质分析在180分钟被发现升高,增加持续24小时。extraterminal ACh早一点确定的体外实验可能大约对应于细胞外ACh在当前在活的有机体内实验在相同时间点。目前的实验证实了早些时候结果并显示剂量的1毫克/公斤或2毫克/公斤MSF强烈增加细胞外ACh在第一次180分钟后管理和效果持续24小时后,高剂量的2毫克/公斤。

相应增加ACh流出MSF后发现,目前的研究还发现,同一剂量减少疼痛海马的活动控制约55%和20%的180分钟后1毫克/公斤,2毫克/公斤的无国界医生组织,分别控制约44%的24小时后1毫克/公斤的无国界医生组织(剂量研究唯一24小时)。这些结果支持一些研究阿尔茨海默病药物的影响表明增加水平的内在各脑区细胞外被发现与减少疼痛活动(8,9,18- - - - - -22]。

多奈哌齐(1.66毫克/公斤),卡巴拉汀(0.4毫克/公斤),和石杉碱甲(超过0.6和3毫克/公斤)被发现增加海马的细胞外ACh和结果通常不是那么不同口服或腹腔内管理(8,18]。所有这三个药物产生极大增加细胞外ACh 3小时之内,大多在30到60分钟后管理。另一方面,目前的研究表明,无国界医生组织细胞外水平ACh增加至少3小时没有显示明显的峰值。后2毫克/公斤无国界医生组织,显著增加还是出席24小时。

虽然多奈哌齐是公认有效的增加释放乙酰胆碱从海马在自由移动的动物8,9),然而,目前的研究发现,多奈哌齐成功地增加细胞外ACh只在1毫克/公斤。令人惊讶的是,它没能证明存在剂量依赖的相关性影响的剂量2毫克/公斤。虽然多奈哌齐的剂量,1毫克/公斤,2毫克/公斤,被选为MSF结果相比,一个可能的解释为我们未能找到多奈哌齐对细胞外ACh的影响存在剂量依赖的相关性可能是2毫克/公斤的剂量不够大于1毫克/公斤剂量产生一个明显的差别。多奈哌齐的影响存在剂量依赖的相关性增加纹状体的细胞外ACh水平通过先前的报道(18)获得通过使用剂量为1,3,5毫克/公斤。

在目前的研究中,多奈哌齐在剂量的1和2毫克/公斤没有任何明显的抑制性影响疼痛在海马的活动管理(图后180分钟3(一个))。多奈哌齐是一个可逆的疼痛抑制剂(9,23)和它产生的疼痛抑制可能消失当组织均质多奈哌齐将被稀释。

5。结论

目前的研究表明,无国界医生组织在剂量1和2毫克/公斤射流产生一致的增加乙酰胆碱的自由移动的老鼠在前3小时以微量透析可把时程延长剂量和持续增长仍在高剂量出席24小时。自切抑制剂患者的主要治疗药物用于广告,agent-like无国界医生组织,从而增加细胞外ACh在海马体持久的功效但是没有过多的刺激,可以作为一个有效的疗法来减轻或防止中枢胆碱能报道引起认知障碍的赤字。

承认

作者要感谢莫斯博士D.E.,Department of Psychology, University of Texas at El Paso, USA. for reviewing the paper and valuable suggestions.