文摘

的carbohydrate-binding活动密切相关的海藻凝集素红海洋藻类物种Bryothamnion三角的(线下)和Bryothamnion seaforthii(声波测井)被用来区分人类结肠癌细胞变异对细胞膜glyco-receptors。这些细胞凝集素与剂量依赖性的方式进行测试。此外,这两种凝集素明显分化细胞的荧光光谱如图所示使用流式细胞仪配置文件。此外,随着共焦显微镜观察到,线下和声波测井与细胞表面糖蛋白进行了强烈的内化,使他们可能的工具定位策略。

1。意义

我们所知,这份报告是第一个全面调查证明肿瘤细胞膜成分差异探测到从海藻凝集蛋白质。此外,根据我们的结果,Bryothamnion seaforthii(声波测井)和Bryothamnion三棱的(线下)凝集素表现出不同的细胞类型化验资料。这些差异可能是由于不同的存在glyco-receptors,不同水平的表达在细胞表面,甚至差异在这些凝集素受体的亲和形象。

2。介绍

凝集素已被证明的carbohydrate-binding活动在促进各种细胞,负责不同的起源,生产或调解现象独特的中性粒细胞粘附和滚动在炎症过程或一氧化氮诱导巨噬细胞(1,2]。许多凝集素已经成为一个强大的工具在纯化或附膜的结构表征glycoconjugates,以及对细胞行为研究[3- - - - - -5]。

凝集素的使用在许多疾病的治疗已经讨论了在其他地方(6,7),但这种潜力还远未被充分利用。另一方面,这些蛋白已成为行之有效的方法理解癌症和转移的各个方面,考虑到一些研究表明表面改性的碳水化合物在恶性转变,肿瘤细胞分化和转移(8,9),和凝集素,在一些情况下,适合使用检测这种变化。

应用程序提出了凝集素在肿瘤诊断探针(包括它们的使用10)、生物反应调节剂(例如,槲寄生凝集素的免疫调节效应ML-1导致戏剧性的抗肿瘤效应)和作为药物输送载体和定位6,11]。

海洋藻类生物应用凝集素似乎特别有趣,因为它们是在一般情况下,小分子(因此,认为引起轻微的免疫原性),拥有伟大的稳定因多个二硫桥,并显示高特异性对于复杂的碳水化合物和glycoconjugates,如呈现在细胞表面的12- - - - - -14]。

在目前的研究中,我们结合流式细胞术和共焦显微镜检查癌症glycoconjugates表示细胞膜和歧视人类结肠癌细胞癌的转移性变异,使用两个海洋海藻凝集素PITC-labeled纯化的红色海藻Bryothamnion seaforthii和Brythomnion三棱的,分别命名为声波测井和线下。牛血清白蛋白(BSA) PITC-labeled作为消极的控制分析。

3所示。实验程序

凝集素。纯化后声波测井和线下获得在deae纤维素离子交换层析柱根据引用描述的过程15,16]。每个蛋白质的凝集分数最高的海藻池,透析和冻干。证实了纯度12.5% sds - page (17]。PITC-labeling(凝集素的分子探针,Inc .)进行碳酸2.0毫升的0.1米/碳酸氢盐缓冲,pH值9.3,和乙二醇(3:1 v / v),使用一个凝集素/由供应者的比例1:100。常数混合的混合物提交5个小时,在黑暗中,。孵化后,lectin-PITC复杂分开并且由供应者通过分子排阻色谱法使用PD10列(Amersham生物科学)平衡包含5%正丁醇和水。包含labeled-lectins的分数被找到,透析和冻干。

细胞。人类结肠癌细胞腺癌行ls - 180来自德意志Krebsforschungzentrum德国海德堡。LS 180个细胞起源于一个58岁的白人女性结肠癌癌公爵的类型b细胞产生高水平的癌胚抗原(CEA)和表达表面肿瘤相关糖抗原决定路易斯X,刘易斯sialyl路易斯X, Y。

内皮细胞行HPLNEC。B3-human微血管内皮细胞从周围淋巴结的霍奇金淋巴瘤患者孤立的特点,以下描述的过程(18]。细胞系和进一步选择变体不同等级增长OptiMEM中补充3%胎牛血清(所有试剂从Gibco大岛,纽约)。细胞培养在25厘米²TC烧瓶在5%的公司₂-95%湿润空气(猎鹰或合演)每周大气和通道,用0.25%胰蛋白酶/ 0.05% EDTA溶液(Gibco、大岛,纽约)。

的体外选择LS180 (EB3)细胞增加了人类HPLNEC亲和力。根据(B3微血管内皮细胞进行了19]。EB3变体受到进一步选择接种体内,在无胸腺的NCrν/ν雄性小鼠,通过各种航线的接种(静脉注射、intrasplenically或orthotopically),选择不同转移的变体(20.]。重复的段落之后,几个高转移性细胞变异。凝集素结合实验,LS 180年EB3,和三个变体选择:第一个变种,LS - 180 EB3 5 w (5 w),通过优先到肝脏,原位(到肠壁)移植;第二个,ls - 180 eb3 3 lnln (3 lnln),通过静脉注射接种后外周淋巴结,第三个,ls - 180 eb3 8 w (8 w)变体,intrasplenic接种后在肝脏转移形式,。细胞在OptiMEM传播媒介补充5%胎牛血清和2毫米谷氨酰胺(所有试剂从Gibco,生命科学),5%的公司₂-95%湿润的气氛。25厘米的细胞培养²水瓶(Falcon),后来通过用0.25%胰蛋白酶/ 0.05% EDTA。自支原体细胞培养系统的污染导致了基础研究的主要问题,每个细胞变异筛选样品的污染支原体检测工具酶免疫分析法(德国勃林格Mannhaeim)。结果是消极的(数据没有显示)。

选择凝集素浓度用于lectin-cell-interaction的化验,不同剂量的凝集素最初评估(1、2、5、10、15、20、25g / mL)。

lectin-cell-interaction分析,收集细胞用0.05% EDTA在10毫米磷酸盐,pH值7.4 (PBS),暂停(210⁵细胞)在200年L(包含0.1% BSA PBS。不同浓度的细胞被孵化PITC labeled-lectin在200年L (PBS / 0.1% BSA为1小时,然后离心机(1000g为5分钟),然后洗来消除不相互影响的由供应者labeled-lectins。1.0毫升PBS的细胞恢复和分析FACSCalibur流式细胞分析仪(正)。活细胞(5000)是为每个数据文件。数据处理和计算的平均荧光强度是细胞追求软件(正)。共焦显微镜分析使用整除包含50 250年000个细胞L PBS / 0.1% BSA增加了150包含凝集素(25 L (PBSBODIPY-lectin绑定和10 g / mLg / mL PITC-lectin绑定)。合成材料被分为两个玻璃管和孵化,此外,和在黑暗中,45分钟。孵化后,暂停离心机(1500rpm) 5分钟。上层清液被丢弃,颗粒在100年恢复L (PBS含有1%多聚甲醛;这些细胞被培养在室温下45分钟。涡流细胞悬液后,10的整除L放在载玻片和盖玻片。交互分析大约4小时后,使用蔡司Axiovert 100显微镜、共焦系统,Bio-Rad MRC 1024人,配备了488 nm氩激光器。

4所示。结果

PITC-labeled海藻凝集素声波测井和线下被允许与LS180交互,EB3,三结肠癌细胞变异(3 lnln、5 w, 8 w)。流式细胞仪分析表明PITC-labelled蛋白质都能够识别这些细胞细胞膜组件(表1)。细胞表面组件的识别表明,这些凝集素能区分癌细胞变异(图1)。的转变引起的荧光强度的交互作用PITC-lectins细胞变异非常相似,这表明凝集素绑定到细胞表面可能是由相同的组件。然而,有趣的是,这两种凝集素可能分化的细胞在相同的实验条件下进行测试。相互作用的分析,关于细胞识别,表明,声波测井和线下歧视细胞变异。

温度变量(和)是用于验证PITC-lectins的绑定属性的差异。这个步骤是必要的,因为绑定的凝集素膜元素很可能发生,细胞膜的流动性降低,能量消耗在运输过程中是有限的。在强相互作用的凝集素与glycocalix组件通常诱发他们的吸收和存储等酸性液泡的溶酶体21]。凝集素的结合流式细胞仪观察到被共焦分析确认没有差异的labeling-patterns声波测井和线下可以观察(图2)。尽管如此,当一类活动评估,一些观察特性。一般来说,内化(图很明显3)。

5。讨论

血凝活性提取物的红色海藻B.seaforthii和b三棱的首次报道了我们组(22,23]。他们凝集分数主要是公认的兔子,鸡,牛trypsin-treated红细胞。净化瓶是一个8.9 -kda cysteine-rich蛋白(16)和mono - di和三糖不抑制其血凝活性(15]。后者财产的氨基酸序列(16)将这些蛋白质与植物凝集素的其他组织,这是自然分组的基础上他们的单糖特异性或序列同源性。因为这些蛋白质似乎拥有carbohydrate-binding特异性不同于著名的植物凝集素,他们已成为一个新的工具来测试不同的活动已经调查了使用植物凝集素,尤其是glycoconjugates的表征。

根据我们的结果,两个凝集素表现出不同的细胞类型检查配置文件。这些差异可能是由于不同glycoreceptors的存在,不同层次的表达在细胞表面,或由差异仍然在这些凝集素与受体的亲和力。另一方面,没有显著的交互中观察到负控制(BSA)和细胞。BSA添加用著名的物理化学特性,因为它是一个蛋白质不凝集素活性,它可以由供应者的绑定。

不寻常的细胞表面蛋白的糖基化已经经常与恶性肿瘤细胞的特点有关。这些包括增加Lewis-related抗原的表达,polylactosamine,- (16)GlcNAc分支trimannoside核心的N与低聚糖和mucin-type结构O有关聚糖(24- - - - - -26]。积累的证据表明这些异常糖基化对肿瘤远处转移的进展和发展很重要(27]。

黏蛋白异常糖基化也被观察到。他们是复杂的,富含碳水化合物的o类型分泌的糖蛋白通过粘膜和粘膜下腺体和被认为是病原体和粒子物理/化学屏障(28,29日]。黏蛋白可以大致分为分泌或跨膜。微分这些糖蛋白的表达与恶性转化(30.]。事实上,许多细胞表面黏蛋白的表达在结直肠肿瘤摄动。MUC1和MUC13,例如,高度表达这类癌相比,正常结肠细胞(17,29日]。

众所周知,糖蛋白黏蛋白是强大的特定抑制剂hemaglutinating凝集素的活动,特别是那些远离海洋藻类(12- - - - - -15]。事实上,粘蛋白已被用作外源凝集素亲和色谱法矩阵净化(31日),以及抑制剂对生物功能表达的海藻凝集素(32- - - - - -34]。

考虑到这里介绍两种凝集素结合黏蛋白的能力和根据上述数据和我们的,我们推测,可以将一个或两种糖蛋白受体被声波测井和线下癌细胞检测。

凝集素的carbohydrate-binding活动一直在研究非常有用的改变细胞膜糖基化,虽然不能解决这一问题的复杂性,单一的方法。事实上,凝集素结合carbohydrate-derivative自组装单层膜,显示相同的凝集素可以切换从一个碳水化合物配体到另一个随着carbohydrate-ligands的表面密度增加(35]。这一事实暴露问题的维度和复杂性,表明研究或自然或异常细胞表面glyco-receptors地图,而不是一个一组特征明显凝集素与类似的配位能力,应该是可用的。

观察,对凝集素的交互与不同的细胞比例增加不同浓度测试,直到10克/毫升。高于这个浓度(10毫克/毫升),它具有饱和glycoconjugates公认的凝集素。因此,交互时不会增加较大浓度的外源凝集素。根据我们的结果,可以利用声波测井和线下调查结构修改细胞膜glycoconjugates细胞系统,我们已经测试了在目前的研究。然而,更详细的调查他们应该进行精确glycan-binding特异性。

所表现出的不同概要文件的高度相似的凝集素声波测井和线下的细胞类型研究为豆科凝集素相当普遍,这可能显示明显的生物活性,尽管他们的高相似性主要序列和整体三维结构(36]。事实上,一项研究从我们这组报道非常显著差异的能力声波测井和线下凝集素预防链球菌坚持了搪瓷薄膜体外(33]。此外,好特异性由我们集团的未发表的研究表明,声波测井和线下实际上表现出明显的特异性对于大多数glycoconjugates(例如,牛颔下粘蛋白和猪胃粘蛋白)进行了测试。因此,我们建议这些准时序列的差异反映了当地的三维结构的改变。这样的改变足以引起一个变量碳水化合物亲和力,并可能构成的主要原因通过声波测井和线下所示的不同的概要文件。然而,这种猜测取决于一个事实,即lectin-receptor交互protein-carbohydrate交互,不能证明了抑制化验lectin-cell交互系统使用经典植物lectin-inhibitory糖类,如半乳糖、葡萄糖、α-methylmannoside或乳糖,正如所料,由于没有研究报告是为了mono的海藻凝集素特异性或双糖。

生物信号转导外源凝集素的性质,一般来说,似乎是由于他们然后交联多糖受体结合的能力。这交联导致受体之间的相互作用和细胞骨架蛋白的变化,伴随改变其他表面的流动和聚集事件,包括那些负责声波测井和线下的内化。

凝集素的发现绑定癌细胞,观察其内部化是相当吸引人的,因为他们可以作为运营商cancer-targeted疗法(6]。有证据表明,药物结合更好的癌细胞比正常细胞内化(37),但如果这种药物是绑定到内化外源凝集素,不仅特异性药物的效力可能增强。

总之,我们证明了海藻凝集素声波测井和线下能够区分人类结肠癌细胞变异对其细胞膜glyco-receptors和可以用来研究细胞膜的结构修改glycoconjugates癌症细胞系统。此外,我们表明,该绑定癌两种凝集素的细胞内化的结果,这是一个非常有趣的属性,可用于未来的应用程序,如药物输送。

确认

作者感谢CNPq提供的财政支持,斗篷/ COFECUB, FUNCAP。他们会感谢保罗·史密斯先生修改英语语言的使用在这个手稿。a . h .桑帕约b . s . Cavada和e·h·特谢拉CNPq高级调查员。