Prejunctional毒蕈碱受体的表征：在VIP和功能反应和受体基因表达的绵羊颌下腺释放的影响

抽象

在麻醉的羊体内实验中，目前研究具有不同选择性毒蕈碱受体拮抗剂是否会影响贵宾释放响应副交感神经索电刺激鼓膜神经不同，如果在发布的更改可能会关联到改变分泌和血管舒张反应。还检查了毒蕈碱受体亚型的位置。在实验中，将血液之前和在任一或哌仑西平的methoctramine的不存在和存在鼓索神经的电刺激过程中收集的颌下静脉引流出来。虽然metchoctramine增加的蛋白质的输出，哌仑西平抑制流动唾液和提高的蛋白质产量，血管扩张，与VIP的输出。在形态学检查，抑制毒蕈碱受体M4在腺体interacinarily发生。结论prejunctional毒蕈碱受体，最有可能的M4亚型，发挥VIP的绵羊颌下腺副交感神经释放的抑制性调节。

1.简介

的流体分泌反应绵羊颌下腺乙酰胆碱施加通过毒蕈碱性M1和M3受体，而M5受体似乎也参与胆碱能血管扩张反应[1]。然而，在副交感神经腺神经元，神经肽血管活性肠肽（VIP）可以与乙酰胆碱colocalised [2]。在羊的颌下腺，VIP存在于神经末梢相邻小血管和腺泡[都3]。在这种腺体以及在羊腮腺，富含蛋白质的颌下唾液VIP介导的分泌，此外，血管舒张作用[4-6]。然而，VIP是在若干物种的[引发从唾液腺蛋白质分泌显着有效的7-11]和VIP似乎在人类颌下腺作用也，二者关于分泌和血管舒张[12-14]。在postjunctional水平，VIP和乙酰胆碱相互作用和外源性VIP和毒蕈碱受体激动剂的同时施用，明显的正向协同作用出现[7，8，15]。两个发射机的物质之间的串扰在prejunctional水平发生也[6，16，17]。在绵羊颌下腺中，“M2 / 4” - 选择性拮抗剂methoctramine的静脉内注射显著增加的蛋白质的副交感神经诱发分泌1]。另外，prejunctional受体的非选择性毒蕈碱受体阻断已经在许多物种的显示与VIP的在副交感神经支配腺体的电刺激的释放增加VIPergic响应一起[6，18，19]。在prejunctional受体的阻断的效果似乎非特异性，并影响神经肽VIP两者的释放和经典的副交感神经变送器乙酰胆碱[17]。相较于乙酰胆碱，VIP优先在激烈的副交感神经刺激释放[20]。因此它是目前不知道是否封锁具有不同选择性特性毒蕈碱受体拮抗剂影响VIP的响应副交感神经索鼓室神经电刺激释放不同，并且，如果是这样，在发行时的转变可以关联到变更分泌和血管舒张反应。For this purpose blood was collected out of the submandibular venous drainage before and during electrical stimulation of the ovine chorda tympani nerve at a high frequency (8 Hz) in the absence and presence either of the muscarinic “M1-selective” receptor antagonist pirenzepine or the muscarinic “M2/4-selective” receptor antagonist methoctramine [21]。为了寻找形态相关于功能性的调查结果，不同的蕈毒碱受体的表达和细胞定位通过免疫组化评估。

2.方法

2.1。动物

The experiments were carried out on 11 adult ewes of various breeds (35–72 kg body weight) under the Animals Scientific Procedures Act (1986); Project Licence PPL 80/1316. The in vivo experiments were performed at the Physiological Laboratory, Cambridge University, and the ethics Committee of the Cambridge University approved the study design. Food but not water was withheld for 48 hour prior to each experiment. Anaesthesia was induced and maintained with sodium pentobarbitone (Sagatal, Rhône Mérieux Ltd., Harlow, UK; 15–30 mg kg^-1IV (via a catheter in the femoral vein) and then 0.1–0.3 mg min^-1 kg^-1IV（调节以保持一个稳定的血压））。手术是如先前描述的方法进行[1]。总之，气管插管，并同侧上升颈交感神经切断。通过股动脉导管，监测动脉血压。索 - 舌神经暴露切块，和颌下腺导管插管。唾液发生无自发流动。每同侧linguofacial静脉支流，除了排水颌下腺，结扎。The animal was heparinized (Mutiparin, CP Pharmaceuticals, Wrexham, UK; 1000 IU kg^-1IV）中，linguofacial静脉空心，和颌下静脉流出物通过一个光电液滴计数器转向并通过泵返回到动物。最后，双极铂刺激电极被放置在管道和鼓索靠近压盖的种脐下。The protocol involved parasympathetic stimulation at 8 Hz continuously for 10 minutes (20-V square wave; 10-ms pulse width). At the end of each experiment the animal was given a lethal dose of barbiturate (Pentoject, Animalcare Ltd., York, UK;CA15 mL 20% w/v), and the contra-lateral submandibular gland dissected out and weighed ( g;）。关于血液的样品中，这些称重用于血液流动的重量估计和然后返回到动物以保持循环血液量，除了颌下静脉血液流出物保持VIP估计该卷。所述gravimetrical测量确保了高的精确度，因为血流增加偶尔以至于下拉计数器没有单个液滴之间判别;提出的所有血流数据从gravimetrical测量值计算。动脉血液样本从间隔腺体释放的VIP的进入循环的计算股动脉收集;动脉和静脉VIP浓度之间的差异，这是在结果部分提供的实际数据。The samples were collected into chilled preweighed tubes containing aprotinin (2500 KIU mL blood^-1），然后在+ 4℃下离心很快尽可能与等离子体隔离在℃。血浆VIP浓度通过酶免疫测定（EIA为VIP，半岛实验室公司，加利福尼亚州，美国）进行测定。The minimum detectable concentration for VIP was 0.02 pmol mL^-1（range 0–7.6 pmol mL^-1;linear range 0.03–0.61 pmol mL^-1）。唾液样品分析用Lowry法其蛋白质含量[22]。关于蛋白质的分泌，这被给定为蛋白质输出，从而无视唾液流率;也就是说，它没有作为蛋白质浓度给出。

2.2。免疫组化

麻醉剂致死剂量，组织从给药后对侧颌下腺是从动物的组织学检查解剖出来。零件最靠近腺肺门的腺体组织的一部分（中央，下部）被移除。将标本固定在磷酸盐缓冲的4％多聚甲醛（pH 7.0）中，然后包埋在石蜡中。

对毒蕈碱受体的表达的免疫组织化学调查，进行了在低温恒温器在厚度为4中制备的不同样品的横截面 米将切片用滑板加热至60℃15分钟，然后进行在100％二甲苯两个30分钟的变化脱蜡;然后将切片在100％，95％，85％，和70％乙醇温育串行，接着Tris缓冲盐水（TBS）再水合。Then the sections were immersed in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) and were microwaved for four cycles of 4 minutes. Endogenous peroxidase was blocked with 0.03% hydrogen peroxidase for 30 minutes. Nonspecific protein binding was blocked with 5% bovine serum albumin (BSA) in TBS for 30 minutes. The sections were thereupon incubated overnight at 4°C in a humidified chamber with polyclonal rabbit anti-mAChR subtype specific antibodies (Research and Diagnostic Antibodies, Berkley, USA) diluted 100x in TBS containing 1% BSA. The presence of the muscarinic receptors was revealed using an avidin-biotin-complex immunoperoxidase method (ABC Staining System, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA; system used following the manufacturer’s instructions) that uses 3,3P-diaminobenzidine (DAB) as a substrate. The sections were counterstained using Mayer’s hematoxylin. As a negative control, duplicate sections were immunostained without exposure to the primary antibody, which resulted in no brown staining of the tissue.

2.3。估计

颌下血管阻力（SVR）是通过将灌注（动脉血）压力（毫米汞柱）由颌下血流量（估计l min^-1[克腺]^-1）并表示为％的变化。结果表示为平均值±S.E.M.并通过双向ANOVA，随后的Bonferroni的后测手段统计学评估。所有流和输出每对侧腺的单位重量表示。

3.结果

3.1。血管扩张剂和分泌应答的副交感神经支配的刺激

在不存在刺激，颌下腺是静态根据分泌，而平均基础腺血流量 mL min^-1g gland^-1该组中（），在该检查哌仑西平的效果。在小组审查methoctramine效果的基础血流量 mL min^-1g gland^-1（）。此外，血压两组几乎相同（VS mmHg), and neither antagonist affected the pressure. Electrical stimulation of the chorda tympani at 8 Hz evoked a mean flow of saliva over the 10-minutes stimulation at of和 l min^-1 g gland^-1哌仑西平分别与methoctramine，给药前。相应地，在不存在拮抗剂的颌下血管阻力的平均下降值和％， 分别。这些变化在血管阻力反射的刺激过程中的平均血液流量（在不存在拮抗剂的;哌仑西平组）和 mL min^-1g gland^-1（在不存在拮抗剂的; methoctramine组）。在刺激周期的平均蛋白产量为两组和 g min^-1 g gland^-1， 分别。

3.2。响应继毒蕈碱拮抗剂的管理

methoctramine 100的静脉给药 g kg^-1（）对唾液的流动没有影响既不（图图1（a）），血管阻力（图图1（c）），或者上VIP的颌下输出（图1（d））。蛋白质的总体输出在methoctramine的存在下增加（％;），虽然没有显着性获得了在时间上分开的点（图图1（b））。哌仑西平（40 g kg^-1IV;约30％）显著降低唾液的流动。总的血管扩张剂（％;），以及该蛋白质分泌应答（％;）都显著上升。两种反应也达到在刺激周期的第二半显著增加。

（一个）

（b）中

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（d）

（一个）
（b）中
（C）
（d）

图1

▲ ■ ^-1 ▲ ■ Comparison of the changes in submandibular flow of saliva (A), submandibular protein output (B), submandibular vascular resistance (C), and VIP output (D) in response to chorda tympani stimulation at 8 Hz continuously for 10 minutes (from point of time 0 to 10; indicated by horizontal bar) in the absence (）并且在存在（）methoctramine（面板的左侧立柱; 100g kgIV）在5麻醉绵羊和在不存在（）并且在存在（）哌仑西平（面板的右列的; 40 克/公斤iv）以6麻醉绵羊。值是平均值±S.E.M。

3.3。VIP版本

The concentration of VIP in the submandibular venous effluent plasma during chorda tympani stimulation at 8 Hz rose steadily during the stimulation period. The basal release of VIP in the absence of stimulation amounted to pmol mL^-1。当鼓索神经是由在不存在拮抗剂的电刺激质疑，VIP输出增加了9〜11倍。methoctramine静脉给药后，在10分钟内刺激总平均VIP输出没有显著上升。在哌仑西平的存在下，在VIP没有变化期间刺激的前两个阶段发生，而它是在刺激的第三期间显着增加（增加16倍;;数字1（d））。

3.4。免疫组化

在免疫组化检查，在颌下腺泡组织（图中检测到除M2受体所有毒蕈碱受体亚型2）。在腺体间质中，对毒蕈碱受体M4清楚染色出现。Occaisonally，对毒蕈碱受体M1一个模糊的染色似乎也有发生，但被interacinarily检测到其他亚型无染色。

（一个）

（b）中

（C）

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图2

颌下腺的免疫组化标记。图像演示了在染色不存在抗体时（一个;对照）;染色在毒蕈碱M1（b）中，M2（C）的存在下，M3（d），M4（e）和M5（F）受体的抗体。酒吧在面板显示10 米

4。讨论

通过研究对刺激的功能反应，被搜索相关因素在VIP输出的变化。通过免疫组织化学检查，形态特征相关性也看了。功能参数，即，流体和蛋白质分泌和血管扩张反应，几乎相同的那些先前报道[1]。In the current report, observations were only performed at a high frequency of stimulation (8 Hz). Neuropeptides, such as VIP, are preferentially released at intense stimulation of the nerve. Previously, activation of prejunctional muscarinic receptors has been shown to inhibit the release of VIP in salivary glands of cats, ferrets, sheep, and rats [6，18-20]，并在神经元释放的影响已被证明对分泌以及对血管扩张的影响[16，20]。在其他器官中，毒蕈碱prejunctional抑制性受体的药理学表征表明受体是的任一个M2或M4亚型[17，23-27]。然而，在唾液腺取得形态学观察表明，prejunctional毒蕈碱受体可能是M1，M4和M5的受体亚型的28，29]。在敲除小鼠的实验中，位于prejunctionally抑制毒蕈碱受体已被证明是M4亚型的，而不是毒蕈碱M2受体[三十]。

在目前的实验中，哌仑西平减少唾液流的神经刺激诱发的增加而增加。即使存在VIP诱发以及耐阿托品副交感神经流体响应;毒蕈碱受体刺激是在实际腺[液分泌的主要刺激物1，6]。鉴于小VIPergic响应的，唾液的由副交感神经刺激引起的流的哌仑西平抑制可能是对腺毒蕈碱受体的作用，这是根据我们以前的表示毒蕈碱M1受体在腺泡细胞的发生报告[1]。然而，所有其他参数，也就是蛋白质输出，血管扩张，以及VIP版本，分别哌仑西平给药后增加。虽然哌仑西平优先结合毒蕈碱M1受体，毒蕈碱拮抗剂的选择性窗口很窄，就是说，拮抗剂是选择性对特定亚型是错误的，即使对于哌仑西平。关于M1比M2受体的100倍更高的亲和力哌仑西平显示，但它显示了M1在M4受体只有约5倍更大的亲和力21]。将在还原所述流体响应当然结果如目前观察到由哌仑西平上腺泡兴奋性受体（例如，M1受体）的效果。如果这一直是唯一的影响，蛋白质产量也将被削弱。然而，由于其在尽管所述流体响应的减少的增加，其原因必须在增加蛋白分泌的刺激分泌这种发现，例如，通过一种有效的蛋白作为cotransmitter VIP [4]。导致增加反应的拮抗作用是通过抑制性受体（毒蕈碱M2或M4受体）的阻断产生的。关于对这些受体当前使用的拮抗剂的亲和力，它是接近上M4受体是相同的，而methoctramine对M2受体比哌仑西平的30倍更高的亲和力。虽然哌仑西平显著增加蛋白质产量，血管扩张和VIP的释放，methoctramine表明朝着同一个模式的倾向。因此，通过M 4受体的作用比对毒蕈碱M 2受体的作用的可能性较大。

目前的结果中一个引人注目的现象是，VIP和贵宾原型响应的发布，也就是蛋白质分泌和血管扩张，就并行。这种封锁引起了反应增加的事实主张的作用是通过抑制受体的阻断造成的想法。在形态学检查，毒蕈碱受体似乎在腺体组织的基质部分，这是根据到组织学已经描述神经纤维发生[31]。在目前的形态学检查，染色毒蕈碱受体M4并且还可能对检测到毒蕈碱受体M1。由于没有毒蕈碱受体M2已经在形态学检查，无论是目前还是在绵羊颌下腺以前的意见被检测[1]，似乎是合理的结论是，M4亚型的抑制性毒蕈碱受体prejunctionally本地化。由于M1的prejunctional推动者受体亚型在其他唾液腺已描述17]。在羊颌下也腺这种受体可能可能发生。总而言之，目前的观测表明，抑制毒蕈碱受体调节的羊颌下腺，这些都可能是毒蕈碱M4受体亚型的发射机的神经元释放。

致谢

这项研究是由来自瑞典牙科协会，威廉OCH玛蒂娜Lundgrens Vetenskapsfond和马格努斯Bergvall基金会的资助。作者感谢已故博士AV爱德华兹，生理实验室，剑桥大学，英国在他的实验室功能进行实验。

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