不同的收缩受体激动剂对Cofilin的磷酸化状态的影响在肺动脉平滑肌

文摘

我们假设agonist-induced收缩与phospho-cofilin / cofilin (P-CF / CF)比例肺动脉(PA)戒指和培养平滑肌细胞(PASMCs)。PA环用于等距收缩和连同PASMCs化验P-CF / CF的等电点聚焦和免疫印迹。P-CF / CF PA和分化PASMCs测量的22.5%,但只有14.8%的未分化PASMCs。随着PA可比的收缩反应,endothelin-1(100海里)和去甲肾上腺素(1米)诱导P-CF / CF的患病率增加,而血管紧张素ⅱ(1米)诱导没有。所有受体激动剂激活Rho-kinase LIMK2,激活被抑制Rho-kinase消除。对国内外低频(20 nM)会使血管紧张素ⅱ,但不是5 -羟色胺(1米)介导的增加P-CF / CF。总之,所有测试受体激动剂激活Rho-kinase-LIMK途径和增加P-CF / CF。血管紧张素ⅱ激活PP2A和抵消LIMK-mediated CF磷酸化。CF磷酸化稳定周边肌动蛋白结构和可能导致PA的最大收缩。

1。介绍

肺循环之间的气体交换便利吸入空气和血液,血液作为储层和一个过滤器。平滑肌细胞层的肺动脉(PA)发挥主要作用,这些功能通过调节血管肌原性的语气和肺血流量。大多数的平滑肌细胞(smc)在健康的肺血管是有区别的,和他们的主要功能是收缩和放松。这些函数是由肌动蛋白和肌凝蛋白的细胞,提供驱动力的收缩反应(1,2]。然而,肌肉力量的肌动球蛋白耦合和生产是由其他调制与收缩域相关的蛋白质,包括肌动蛋白结合蛋白calponin, h-caldesmon,原肌球蛋白(3,4]。它也越来越清楚,SMC收缩取决于蛋白质与肌动蛋白结构近端细胞膜如证监会、粘着斑激酶(FAK),桩蛋白,蛋白HSP27、cofilin。这些蛋白参与调停附件粘着斑的形成复合体的应力纤维细胞膜(5]。

Cofilin (CF)是一种肌动蛋白结合蛋白功能的细胞边缘皮层下的主要解聚蛋白肌动蛋白复合物(6,7]。CF本地化尖头的肌动蛋白丝,减少他们的长度则ADP-coupled肌动蛋白单体(8]。CF的肌动蛋白解聚活动是受pH值,与适配器蛋白质协会,与磷酸肌醇(9,10]。然而,可逆的磷酸化是最重要的机制:只有nonphosphorylated CF具有肌动蛋白filament-depolymerizing活动,尽管Ser3-phosphorylated CF缺少这样的活动(11,12]。因此,CF的磷酸化状态管理能力维持皮层下肌动蛋白网络的完整性。

CF的磷酸化是由两个蛋白激酶家族:睾丸蛋白激酶(TESK)和LIM激酶(LIMK)。然而,TESK激活细胞依附到纤连蛋白和能传感信号整合素受体外围肌动蛋白结构(13]。LIMK是由可溶性配体激活,激活是由单体的gtpase Rho-dependentρ家族和随后的激活的蛋白激酶PAK和Rho-kinase14- - - - - -16]。ρgtpase可以激活不同的代理,包括收缩神经递质(17),激素(18),有丝分裂原,生长因子(19- - - - - -22),血管生成代理(23),或细胞应激(24- - - - - -26]。因此,ρGTPase-Rho-kinase-LIMK通路可能提供的关键信号控制CF-mediated重建皮层下肌动蛋白网络以应对不同的细胞膜受体的激活或压力因素(11,14]。然而,激活模式和CF的角色在收缩血管平滑肌肌动蛋白丝重构是未定义的。

本研究的目的是评估收缩受体激动剂改变的磷酸化状态cofilin刚切割犬PA环和培养PASMCs,并评估参与信号转导事件cofilin磷酸化在休息和肺动脉平滑肌的收缩。

2。材料和方法

2.1。动物治疗和组织解剖

调查符合指导实验动物保健和使用的发表的美国国家卫生院(NIH没有出版。85 - 23,1996年修订),与特定的协议批准的动物保健和使用委员会内华达大学雷诺。从成年杂种犬肺得到狗的安乐死的巴比妥酸盐过量。肺部解剖和二阶肺动脉分支是孤立的,然后用于切割环等长收缩实验,或者驱散和文化血管细胞,如我们之前所述的出版物(27]。

2.2。分散PASMCs

犬的二级分支PA解剖,从结缔组织清洗,放置在无汉克的解决方案,包含125毫米氯化钠,氯化钾5.36毫米,15.5毫米,0.34毫米,0.44毫米蔗糖,葡萄糖10毫米,2.9毫米,10毫米玫瑰,pH值7.4c .血管被纵向解剖开,内皮细胞和棉签和平滑肌层刮碎和消化,和平滑肌细胞培养如前所述[27]。

2.3。等长收缩实验

新鲜的犬PA环(约2毫米直径)安装在10毫升器官浴和位移监测与堡10等距力量Myobath 4系统中传感器(世界精密仪器,萨拉索塔,佛罗里达州,美国)。休息1 g应用于每一块肌肉的力量。这是发现组织部分延伸到附近的最优长度紧张局势发展。在所有的实验中,组织最初平衡1小时之后至少3交替3分钟曝光氯化钾(30更易/ L)每15分钟为了建立可行性和平衡组织。收缩受体激动剂被加入浴解决最后一个1的浓度米去甲肾上腺素(NE)、血管紧张素ⅱ(AngII)或5 -羟色胺(5),100 nM endothelin-1 (ET-1)或2 U /毫升凝血酶。收缩反应监测5分钟,其次是广泛的。在一些实验环与y - 27632(1孵化米)或国内外低频(MCLF 20海里)前1小时和收缩受体激动剂在孵化。高原的收缩,组织是snap-frozen和均质提取可溶性蛋白。

2.4。治疗培养PASMCs

首次通过PASMCs种植在完整的融合生长介质M199补充10%的新生牛血清(nc),然后采用无血清分化为三天。细胞培养与1不同时间M NE, AngII或5 - 100海里ET-1 2 U /毫升凝血酶。在一些实验中,细胞preincubated与y - 27632(1 1小时米)或国内外低频(MCLF 20海里)孵化前收缩受体激动剂。

2.5。总蛋白提取和免疫印迹

总蛋白提取从PA环glass-glass同质化十册里帕缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4,150毫米氯化钠,5毫米EDTA, 0.5% (v / v) NP40, 0.5% (v / v)特里同x - 100, 1毫米氟化钠,1M亮抑酶肽,1M AEBSF)和声波降解法。对待PASMCs与里帕缓冲细胞溶解。总蛋白浓度是由微观BCA蛋白质化验分析工具包(皮尔斯生物技术,罗克福德,生病,美国)。解决了等量的总蛋白sds - page和转移到硝化纤维膜为1小时24 V(精灵记事簿,想法科学公司,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)。30分钟的膜被封锁LI-COR阻断缓冲区(LI-COR, Inc .,林肯,内,美国),同时探测主要单克隆抗体对CF(美国纽约北部的生物技术,普莱西德湖)和一个主兔多克隆抗体P-CF(美国科罗拉多州,丹佛,细胞骨架)稀释在LI-COR缓冲区。删除主要抗体后,膜与两个二次抗体:孵化anti-rabbit,耦合到一个红外荧光标记发射波长为800 nm (IR800罗克兰免疫化学,Pa,美国),和anti-mouse耦合与发射波长的红外荧光标记680海里(Alexa萤石680,分子探针,矿石,美国),稀释在LI-COR缓冲区。双色荧光图像得到的奥德赛扫描仪(LI-COR, Inc .,林肯,内,美国)。免疫反应性的乐队密度P-CF被标准化的免疫反应性的乐队的CF和treatment-dependent变化表示相对于未经处理的控制。

2.6。等电点聚焦电泳(IEF)

IEF凝胶板制作塑料磁带从BioRad购买(美国加州大力神),与凝胶成分推荐的制造商。预测的等电点(π)犬CF是8.07 (Acc。DR105214),因此平等的两性电解质与pH值范围6/8和7/9被添加到混合凝胶的最终浓度1%。总蛋白提取物PA环或培养PASMCs与甘油混合和两性电解质(凝胶成分相同的pH值范围)最终的40%甘油和1%两性电解质的浓度。样本被放置在凝胶,蛋白被逐步解决电压项目(60分钟100 V, 250 V为60分钟,30分钟和500 V)在20毫米氢氧化钠作为阴极缓冲和7毫米磷酸阳极缓冲。垂直无蛋白条(约5毫米宽)切除边缘的每个凝胶和分为1厘米长的段。段被浸泡在100年l蒸馏水的化验pH梯度凝胶中。蛋白质从能源论坛的合作,凝胶转移到硝基在7毫米醋酸的转移缓冲在24 V, 1小时C(精灵记事簿,想法科学公司,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)。膜与CF抗体和免疫反应性的探测图像开发和量化如前一节所述。脱去磷酸CF,我们孵化蛋白质提取与小牛肠碱性磷酸酶作为推荐的制造商(美国威斯康星州麦迪逊Promega Corp .)前凝胶电泳和免疫印迹。

2.7。LIMK2免疫沉淀反应和活动分析

总蛋白提取物控制和收缩受体激动剂治疗犬PASMCs事先批准了蛋白质A / G琼脂糖+珠子然后LIMK2与山羊多克隆抗体免疫沉淀反应(C-19,圣克鲁斯生物技术有限公司圣克鲁斯,加州,美国。免疫沉淀反应是冲第一里帕缓冲区,然后与磷酸化缓冲区(50 mM Tris-HCl, pH值7.8,2毫米、0.5毫米EDTA和50 mM氯化钠)。LIMK2活动被磷酸化化验重组CF(美国科罗拉多州,丹佛,细胞骨架,Inc .)在体外的存在(- - - - - -]ATP在C 15分钟。解决了蛋白质sds - page(15%丙烯酰胺),凝胶与考马斯亮蓝染色后(CBB)和鄙视被暴露到phosphorimaging屏幕。CF放射性斑点分子成像可视化个人外汇(美国加州BioRad,大力神)和归一化CBB-stained乐队。Stimulus-specific LIMK2激活的激酶活性表达相对于未经处理的控制。

2.8。统计方法

结果提出了的意思SD。的价值观是指平行实验的数量。成对的学生的学习任务和未配对数据,或者单向方差分析应用于测试不同治疗手段,是适当的。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。评估CF亚型在犬肺动脉平滑肌

总蛋白质的电泳,免疫印迹从刚获得解剖犬肺动脉和培养PASMCs可视化两个强有力的和一个微弱CF-like免疫反应性的乐队(图1)。的一个强有力的免疫反应性的乐队comingrated细菌重组CF (rCF,图1(一)巷3),从而确定为非内源性CF。确定P-CF带我们脱去磷酸内生P-CF孵化与小牛肠碱性磷酸酶(美联社)然后免疫印迹AP-treated以及未经处理的控制蛋白质提取样品。孵化与美联社的密度显著降低第二强大的免疫反应性的乐队,被确认为内生P-CF(图1(一),莱茵2)。pH值测量中提取能源论坛泡合作获得的凝胶段在蒸馏水中,透露了一个线性pH梯度(图1(一),pH值栏)和证明重组细菌CF(磷酸化,用作控制)和内源性磷酸化CF有明显的8.2π。酸性更强的估计πP-CF为7.2(图1(一))。实验CFπ(8.2)和预测是一致的π犬心血管,老鼠和人类CF(8.07π,Acc。DR105214, NM760088 NM005507,职责),估计π值的CF和P-CF其他实验室(28]。

检测磷酸化CF的分数(P-CF)相比,总CF(即。,the P-CF/CF ratio), we used canine freshly dissected pulmonary artery rings and cultured PASMCs differentiated for three days in serum-free culture medium (Figure1 (b))。平均数据从四个平行实验证明P-CF占占总数的% CF在肺动脉和池在分化PASMCs %。

培养PASMCs已经使用在我们先前的研究和其他实验室。检测细胞培养如何影响P-CF的分数,我们比较P-CF / CF分化的比例(0% nc三天)和增殖PASMCs保持在完全培养基(10% nc)。三个平行实验的结果表明,尽管P-CF无关紧要的内容改变,总CF内容增加在增殖PASMCs(图1 (c))。因此,P-CF / CF比率下降在分化PASMCs %在增殖PASMCs %。这些结果表明,尽管CF的总蛋白质含量较高,磷酸化CF是相对较低的分数在增殖分化PASMCs或新鲜解剖肺动脉环。这些结果符合的观念更加动态的肌动蛋白丝重构在增殖PASMCs由更高的CF活动相关联。

3.2。调制的CF磷酸化受体激动剂在犬肺动脉收缩带和培养PASMCs

测试是否平滑肌收缩P-CF与变化相关联,我们刚孵化解剖肺动脉带与NE和最大振幅我们snap-froze组织。然后我们提取并解决总蛋白,sds - page和化验CF和P-CF同时使用CF和P-CF抗体免疫印迹,分别。NE-induced收缩与磷酸化的CF(增加数据2(一个)和2 (c))。孵化的PA环Rho-kinase抑制剂y - 27632孵化之前,不减毒NE-induced收缩反应(图2 (b))和P-CF NE-mediated增加(图2 (c))。减少NE-stimulated机械响应的y - 27632是Rho-kinase-dependent激活的抑制的结果肌球蛋白轻链(多层陶瓷),在以前的研究报告(17,29日]。减少P-CF内容,另一方面,是抑制的结果LIMK [Rho-kinase-mediated激活的30.]。因此,肾上腺素能受体的激活是激活ρgtpase耦合,Rho-kinase, LIMK(图2 (d))。

不健康的主要受体激动剂收缩血管;然而PASMCs也暴露于其他内生收缩受体激动剂。测试其他收缩受体激动剂如何影响P-CF,我们与ET-1孵化PA戒指,AngII 5 ht,凝血酶,然后化验P-CF / CF比率通过免疫印迹。类似于NE,这些受体激动剂引起的收缩反应和最大收缩部分抑制了y - 27632(没有显示)。然而,这些受体激动剂对P-CF / CF比率有明显的影响:ET-1和thrombin-mediated收缩与P-CF / CF比率的增加约2倍,5 -刺激增加了1.7倍,而AngII CF磷酸化的没有变化(图引起的3(一个))。

我们还在PASMCs化验P-CF / CF比无血清培养基上培养4天前与ET-1孵化,AngII, 5、凝血酶。总的来说,P-CF / CF比率的模式在培养PASMCs让人想起PA环(图中的模式3 (b))。这些结果表明,增加的CF磷酸化并不是所有收缩受体激动剂的共同特征。减少机械响应的y - 27632表明Rho-kinase-mediated信号调节收缩收缩剂。因此,信号转导机制导致的变化P-CF可能游离于Rho-kinase下游,或取决于激活备用通路抵消Rho-kinase-LIMK-mediated CF的磷酸化。

3.3。受体激动剂激活LIMK2收缩

LIMK2表达在肺动脉平滑肌细胞(27和是Rho-kinases的直接目标31日]。因为受体激动剂激活Rho-kinase收缩测试,很可能他们也激活LIMK2。测试这种可能性,我们与NE犬PASMCs孵化,ET-1, AngII,凝血酶、5 -然后免疫沉淀反应LIMK2从细胞总蛋白提取。磷酸化的激酶活性是化验CF体外重组的存在(- - - - - -ATP。所有受体激动剂激活LIMK2收缩,ET-1是最强的(%)和AngII最弱的活化剂(在这些浓度(图%)4)。激活的LIMK2 ET-1, NE、5 -,以及凝血酶相似的agonist-induced增加CF磷酸化,表明激活LIMK2直接耦合到CF磷酸化(见图3)。然而,AngII-mediated激活LIMK2(图4)无关紧要的变化导致P-CF分数(图3),这表明除了LIMK2的激活,CF的磷酸化状态AngII-treated细胞可能取决于其他途径。

3.4。PP2A参与Cofilin AngII-Mediated磷酸化

AngII-mediated增加P-CF是微不足道的NE相比,ET-1, 5,凝血酶;因此,我们测试了AngII激活CF磷酸酶的可能性。自从PP2A脱去磷酸CF (12,32),我们孵化犬PASMCs PP2A抑制剂,对国内外低频(MCLF 20海里)1小时5分钟前孵化AngII和5 -(积极的控制)。孵化与MCLF单独造成的P-CF内容略有增加% ()表明PP2A活性调节CF的磷酸化水平。此外,MCLF强AngII-stimulated CF磷酸化% (AngII控制,)% (AngII + MCLF,,)(图5(一个))。5-HT-treated组,孵化MCLF没有显著加强5-HT-mediated增加P-CF(图5 (b))。这些结果表明,激活PP2A AngII受体与激活,这可能会导致CF AngII-treated组脱磷酸化。然而,激活PP2A扮演一个次要角色5-HT-mediated磷酸化的CF。

4所示。讨论

这项研究表明暴露肺动脉平滑肌受体激动剂与不同收缩stimulus-specific CF的磷酸化状态的变化。CF功能主要在细胞皮层下区和调节周围肌动蛋白结构的重塑和细胞对细胞外刺激的反应。在平滑肌收缩,例如,磷酸化和失活的CF可以减少外围的离解肌动蛋白丝,因此稳定应力纤维对粘着斑复合物(30.,31日]。最终,这可能促进一个更高效的拉力和最大收缩加强细胞缩短和发展。这个场景符合P-CF含量增加新鲜PA环解剖和NE分化PASMCs暴露,ET-1, 5、凝血酶。它也与之前的研究一致表明凝血酶(33),5 - [34,35)、NE和ET-1 [34,36)激活ρgtpase然后Rho-kinase LIMK。令人惊讶的是,然而,PA的收缩反应P-CF AngII发达没有相应增加的内容,虽然AngII-induced Rho-kinase收缩与激活有关。我们还证实,AngII ET-1, NE,凝血酶,和5 -激活LIMK2系统,从而排除这样一种可能性,即缺乏P-CF内容的变化是由于缺乏激活LIMK AngII。因此,CF的磷酸化AngII-treated肺动脉似乎依赖于其他机制。

的角色AngII激活ρGTPase一直存在争议。Sakurada et al .,例如,报道缺乏激活ρ兔主动脉平滑肌(34),然而,AngII激活ρ在鼠肾小动脉(37,38]。这些研究表明,AngII-mediatedρGTPase——Rho-kinase-LIMK-CF通路的激活可能不同物种间和/或血管床。这些差异可能会强调表达的相对差异的两个主要AngII受体类型,也就是说,I型(AT1R)和II型(AT2R),或在postreceptor机制。例如,先前的研究已经表明,激活AT2R可能负调控RhoA和多层陶瓷磷酸化39]。其他研究已经表明,AT2R耦合的激活蛋白磷酸酶PP2A [40,41),也参与了CF(脱磷酸化12,32]。因此,AngII对CF的磷酸化的影响PA平滑肌的相对表达和激活可能取决于AT1R和AT2R反映之间的平衡AT1R-mediated Rho-Rho-kinase-LIMK通路的激活和AT2R-mediated抑制PP2A Rho-Rho-kinase-LIMK信号和/或激活。我们的研究结果是一致的的概念AngII调解双方受体的激活Rho-kinase CF磷酸酶如PP2A和激活。最近的研究指出,弹弓作为主要的CF磷酸酶(42,43),然而,AngII受体之间的联系和弹弓仍是未定义的。

关于cofilin的功能作用在血管平滑肌收缩,我们的结果符合以下猜测。首先,CF磷酸化和失活扮演配角的,如果有的话,角色不收缩反应,ET-1,凝血酶和5,尤其是AngII。这个结论并不排除这种可能性CF磷酸化的抑制可能降低最大收缩NE, ET-1,凝血酶,和5,或者抑制CF磷酸酶可能增加AngII最大收缩。然而,解决这些可能需要特定的药理催化剂和抑制剂的发展CF激酶(即。LIMK TESK)或CF磷酸酶(即。,Slingshot) for use in whole tissue preparations. Secondly, the P-CF content increases from a resting level of about 23% to 42% in thrombin-treated, and to about 50% in NE or ET-1-trated PA rings. Such accumulation of inactive P-CF has been shown to induce the formation of stress fibers and focal adhesions in HeLa cells [31日]。同样,PA P-CF / CF比率的增加平滑肌有可能稳定周边肌动蛋白网络和局部粘连,并有利于平滑肌细胞的收缩反应。

确认

这项工作是NCRR P 15581 rr赠款支持中情局Yamboliev NIH HL60031 v . n . Mutafova-Yambolieva。

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