免疫相关因素和替代标记疫苗和免疫治疗的鼠疫为发展中的作用

摘要

在制定对付生物威胁剂的对策方面的困难之一是证明它们在人身上的效力的内在挑战。自FDA首次发布动物规则以来，关于动物模型保护的潜在关联以及它们用于建立对人有效的替代标记的讨论不断增加。后者需要在至少合格(如果没有验证)的测定中相对容易测量，以便对所授予的临床效益进行定量评估。证明安全性和临床效益对于取得监管部门批准不能直接检验临床疗效的对策至关重要，例如生物防御疫苗。鼠疫是一种古老的、严重的传染病，至今仍在现代世界各地区流行，是一种潜在的生物威胁因素。本文讨论了对鼠疫保护的潜在免疫相关因素，从中可能得到疗效的替代标志物，以预测候选的先兆和疗法的临床疗效。

1.鼠疫

鼠疫的古老的疾病仍然存在于现代世界的流行地区，并导致每年[3000左右病例报告1]。鼠疫是一种由革兰氏阴性细菌引起的蚤媒感染鼠疫耶尔森氏菌，潜在的生物威胁剂最初是肠道病原体鼠疫耶尔森氏菌属被认为是从肠道菌素进化而来的y伪[2是一种由跳蚤传播的地方性感染。跳蚤以受感染的啮齿动物为食，然后通过跳蚤的叮咬将细菌传播给易感染的哺乳动物。在这个循环中，人类是一个意外宿主，但如果被咬了，就会感染黑死病，如果在患者出现症状之前没有及时治疗，就会导致严重感染。继发性肺鼠疫可在腺鼠疫患者中发展，这是更令人担忧的，因为鼠疫耶尔森氏菌属细菌以气溶胶的形式在未受保护的密切接触者之间高度传播，有可能流行传播[3]。

2.毒力因素鼠疫

鼠疫耶尔森氏菌属可产生多种抗原和毒力因子，其中三种作为亚单位候选疫苗具有已知的保护效果:f1 -抗原[4],V-antigen [五，以及耶尔森菌分泌因子F (YscF) [6]。这三种蛋白质是毒力因子鼠疫耶尔森氏菌属感染期间。F1抗原是一种荚膜蛋白，具有抗吞噬作用[7]，而V-抗原是由细菌用于获得和对宿主细胞递送其它细胞毒性和抗吞噬耶尔森氏菌外蛋白（Yops）[三型分泌系统（TTS）调节蛋白8]。v抗原既存在于细菌内部，在TTS过程的起始阶段具有一些调节功能，也存在于注射剂的尖端[9]。所述injectisome的柱状结构由YscF [的6]。

许多其他因素已被评估为潜在的候选疫苗，包括纤溶酶原激活剂(plasminogen activator, Pla)，它在感染期间通过降解内皮和结缔组织等物理屏障，促进从受感染的跳蚤向哺乳动物宿主细胞输送血液[10，11]。然而，在小鼠模型中发现Pla的免疫原性很差，对致命鼠疫没有提供保护[11]。YscF的疗效亦已进行评估[6]，作为具有PH6抗原[12和许多Yop的[13，14]。虽然其中一些因素在鼠疫动物模型中给予部分保护，但对鼠疫具有完全保护作用鼠疫耶尔森氏菌属已经与F1-或V抗原只实现并且是最佳时这些抗原组合使用，或者作为遗传融合[15，16]。重组的F1和V (rF1 + rV)亚基对小鼠的保护作用鼠疫耶尔森氏菌属目前已经报道了一些实验室，并在一系列实验动物模型（在[综述17])。使用rF1/V进行免疫接种已被证明可以保护动物模型免受蚤媒鼠疫的感染[18也反对实验暴露于鼠疫耶尔森氏菌属[19，20]。

3.接种疫苗，以防止瘟疫

接种疫苗和暴露后治疗都是保护个人免受暴露的选择鼠疫耶尔森氏菌属。从19世纪末的Haffkine疫苗开始，已经有了一系列针对鼠疫的灭活全细胞疫苗(KWCVs) [21]，通过对由中央血清实验室（CSL），其包括悬挂的产生的当前可用KWCV热灭活鼠疫耶尔森氏菌属(> 10⁹/毫升）。虽然KWCVs反对鼠疫有效，流行病学证据表明，他们有对肺鼠疫一点保护效果[15，20，22，23]。F1似乎是KWCV配方中的关键保护性抗原，因而它也不能防止  Y. pestis[4，五]。与KWCVs不同，rF1-/ v抗原组合已被证明可以保护小鼠和猕猴免受肺鼠疫的侵袭[24-27]，代表候选对策瘟疫感染显著进步。F1 / V的不同的演示已经研究包括DNA疫苗[28]、口头配方[29，以及活疫苗载体表达，例如，沙门氏菌菌株[三十]。

一个自然减毒活疫苗株，EV76，已被证明对肺鼠疫保护小鼠和猕猴模型[31，32]。最近，一股紧张鼠疫耶尔森氏菌属KIM通过突变来刺激接种者的TLR4反应，被认为是一种候选疫苗，保护接种后80%的小鼠不受肺鼠疫的感染[33]。减毒活疫苗和灭活疫苗对肺炎鼠疫的疗效差异，被归因于KWCV配方中缺乏v抗原，而KWCV配方仅含有有效数量的f1抗原[15，26]。通过比较，减毒活疫苗含有两个F1-和V抗原[15]。在非人灵长类动物然而，减毒活疫苗，如EV76，都引起的发病率（NHP）[34，引起了人们对其在人体中的使用的安全担忧。

4.曝光后治疗

抗生素治疗的18-24小时内的早期检测和给药后疑似暴露于鼠疫耶尔森氏菌属而在出现症状之前，对鼠疫的成功治疗至关重要。推荐的抗生素方案包括静脉注射大剂量庆大霉素(5 mg/kg每日一次)或等量的链霉素、环丙沙星、庆大霉素或强力霉素10天[35]。如果怀疑鼠疫脑膜炎，也可使用氯霉素[36]。当病人对治疗有反应时，可能会改变口服首选抗生素的方式。根据培养中的感染菌对抗生素的敏感性来调整抗生素治疗是至关重要的，特别是当怀疑故意使用抗生素耐药菌株时。

在动物模型中，单克隆抗体的管理（MAB的）具有特异性的F1和V，已被证明感染了保护小鼠鼠疫耶尔森氏菌属，即使是在接触后48小时给予单克隆抗体[37]。然而，抗-V的Mab 7.3的保护作用是通过抗TNF的共同施用废止α和抗IFN指示蜂窝炎症反应也有助于保护[38]。在接触后，免疫和抗生素联合治疗是有可能的鼠疫耶尔森氏菌属中，为了缩短抗生素治疗的持续时间需要。

5.非临床和临床之间的桥梁

由于标准的三期临床疗效研究不开展鼠疫等严重的人类疾病，对双方道德和实际理由（太少自然发生的情况以及爆发这是痉挛性）是可行的，它建立满意的动物模型是必不可少的的疾病。这些，反过来，可以用来评估候选疫苗和治疗的功效，并确定保护作用有关。鼠疫感染的鲁棒动物模型，其真正的代表人类疾病综合征是客观和模型已经建立了标准的实验室动物物种（小鼠，大鼠，兔，和猴），以及非标准物种，如黑足鼬（综述[17])。

在RF1 / V组合在小鼠，豚鼠，猕猴和人[有力的免疫原性15，39-41，并已被证明在非临床模型中对任何一种注射药物都有效[15],aerosolised [16，20]，跳蚤矢量[18]，或摄取[42] 接触鼠疫耶尔森氏菌属。从这些非临床研究，有必要确定保护的免疫相关因素，通过临床阶段，以便候选人对策的进展。

桥接的发展过程中的非临床和临床相之间的间隙为一个对策，可以说是整个R＆d循环的最危险的元件和先前已被称为“死亡谷” [43]。许多候选的预防和治疗方法在这一界面失败，可能是因为很难比较非临床和临床数据集的保护效果。这突出表明，有必要了解达到对这类制剂的保护效力所需的免疫机制，并在动物模型中得出保护的免疫相关性。在适当的动物模型中，基于免疫学读数发现了与保护效力的统计相关性，对后者的识别应导致衍生替代效力标记(图)1)。替代标记需要是可测量的和定量的终点为临床试验志愿者，以预测疗效。如果使用几个替代标记物，这些可以共同用于预测可达到的疗效程度。因此，疗效替代标记的提名有效地弥合了研发的非临床阶段和临床阶段之间的差距。

视乎动物模型与人类感染的相似程度，可能需要多个动物模型提供免疫相关物，即美国食品和药物管理局《动物规则》所载的概念[44]。总之，动物法则要求:（1）有一种公知的病理生理机制的操作和它的预防或由产品显着降低的;（2）这种效应在一种或多种预计会对人类作出反应的动物身上表现出来，除非这种效应在一种动物身上表现出来，而该动物代表了一种具有充分充分特征的动物模型，可以预测人类的反应;（3）动物研究终点显然与人类的生存或预防严重并发症的普遍增强期望的效益;(4)在动物和人类的产品的动力学和药效学的数据或信息，允许在人类的有效剂量的选择。

有保护的标识免疫相关因素，也有以预测的防护等级[推断这些非临床数据，以人的各种数学方法45]。

保护6.免疫相关因素鼠疫

小鼠的免疫用任一[4，五或F1和V蛋白[15，16]对鼠疫具有保护作用，并且特异性抗体的滴度与保护作用相关。而在小鼠中观察到，与这些蛋白相关的IgG滴度的形成与保护作用有关[46]、天竺鼠[39]，非人灵长类动物(NHP) [40]以及从与临床试验血清被动转移研究推断[41]，单独的中和抗体不针对描述本有毒病原体保护的整个机理[17]。来自几个小组的研究人员已经报告了强烈的CMI反应。38，47，48而对于rF1 + rV疫苗的alhydrogel吸附配方，这通常被观察为CD4+ th2偏压CMI反应[46]。然而，rF1 + rV疫苗的替代配方(用不同的佐剂替代了alhydrogel)也被证明在CD4+ th1偏置条件下诱导保护性免疫[49，50]。此外，影响B细胞产生抗体的靶向基因缺失小鼠(MT B细胞敲除或SCID /米色）或包括统计4 / STAT 6敲除和IL4 / IL10敲除进行了研究[在Th细胞应答的性质17，49-51]。rF1 + rV-immunised Stat-4-deficient mice, which have low levels of IFN生产，被发现是缺乏保护的鼠疫耶尔森氏菌属尽管rF1 + rV产生了与完整对照相似的抗体滴度[49]。此外，rF1 + rV疫苗能够在IL4敲除小鼠中诱导保护性免疫，尽管在这些动物中存在th1偏置的环境[50]。事实上，Stat-4介导的Th1应答免疫机制被认为是保护的关键，而Stat- 6/ th2介导的应答则不是[49]。Thus for the rF1 + rV vaccine, the induction of specific antibody neutralising the F1 and V antigens is a significant immune correlate of protection; however the supporting CMI response is not necessarily Th2-polarised and indeed the operation of Th1 mechanisms during infection appears to be essential for full protection and recovery [17]。

虽然总Ig的测量表明免疫应答已经被诱导的候选疫苗，这本身并不能表明保护性免疫已经实现。的诱导的抗体的功能性的测定可以是更有启发。如果保护可以在所选择的动物模型中证明，并与中和抗体应答的存在，然后从人的临床试验的志愿者的血清样品中的相同的中和抗体的识别表示保护性和疗效的潜在替代标记物的免疫相关。因此免疫猕猴[40和人1期试验的志愿者[41血清已被证明在与v抗原固相结合方面可与预防瘟疫的单克隆抗体(Mab 7.3)竞争体外;这些血清(结果未显示)和Mab 7.3保护J774细胞在体外从细胞毒作用的v抗原分泌y伪（数字2）;被动保护，天然小鼠在活的有机体内与挑战鼠疫耶尔森氏菌属。The passive transfer of protective immunity in human serum into mice also correlated significantly with the total IgG titre in the human donors to rF1 + rV at days 21 ()及28 (）41]。

随后然而，竞争性ELISA并没有被证明是作为保护测定的归属关系实验室之间是一致的[52]，可能是由于一个以上的保护性B细胞表位的在V抗原存在[53]。因此朝测定表示相关动物模型和人的需要的免疫学读出之间的相关性的实用方法来采取彻底地测试这样的测定的一致性和效用。

功效7.潜在替代性标志的对策瘟疫

基于这些有关免疫相关性的数据，以及迄今为止发表的对接受rF1/V亚单位疫苗免疫的临床试验志愿者样本的免疫分析数据[41]，它可以识别功效的几个血清学的替代指标。这些可以包括在V-抗原的分泌从细胞毒性人免疫血清的抑制活性假结核菌。来自该分析的定性数据已发表[40，然而，该方法随后得到了改进并进行了定量分析[54]。研究表明，暴露于免疫NHP血清的巨噬细胞中caspase-3活性的降低与NHP的存活增加相关鼠疫耶尔森氏菌属感染。

从志愿者的人血清被动转移的I期临床试验入选已经证明，以防止感染瘟疫幼鼠，在剂量相关的方式[41]。保护性免疫被动转移到小鼠体内也与IgG对rF1和rV的总滴度在第21天显著相关(%;)及28 (%;)。

传统上，细胞替代标志物的有效性测定更具挑战性，特别是在临床环境中，因为它们需要新鲜的全血样本和相对迅速的分析。然而，流式细胞术的最新进展简化了这一点，允许测定t细胞反应和全血淋巴细胞亚群的定量分析。然而，样本量很重要:在rF1V小期临床试验过程中，通过流式细胞术分析外周血单核细胞(PBMC)表面标记物的变化，由于个体之间的反应差异很大，没有显示出任何显著的趋势[41]。细胞召回响应RF1 / V的示范已经报道体外免疫小鼠脾细胞[55]。一个更实际的选择可能是使用ELIspot分析，例如IFN来自脾细胞的分泌被重新刺激在体外与疫苗抗原检测到[48]。更具体地说，已经在小鼠中鉴定出F1和V的CD4+ t细胞表位[56，57和一个H-在F1 -restricted鼠T细胞表位已经被证明在Balb / c小鼠的保护[是必不可少58]。同样，hla限制性t细胞表位已经在F1中被映射[59]并且正在使用HLA转基因小鼠寻求V-抗原。这些数据可能在将来用于人T细胞记忆应答，识别其中通过免疫PBMC可以提供疗效的蜂窝替代标记提供功能的目标。

8.结论

许多工作正在进行，以确定保护的统计学上有效的免疫相关因素鼠疫，特别是由于药效的临床证明是不可能的。这需要非临床模型，其真正的代表了人类感染的发展。尽可能，免疫归属关系应该在一个以上的非临床模型来证明。虽然免疫相关（多个）可能无法描述所有的保护，防止病原体操作免疫机制，他们应该是选择非临床模型和诊所之间的重复性一致，应该是定量的，以评估可能的好处要对接种者授予。与需要计数器致病的和的先天和适应性免疫反应机制的分子基础的理解增加鼠疫耶尔森氏菌属，保护的免疫相关因素被识别和报告，这反过来将加快下一代疫苗和免疫的发展。

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