Thalassemic dna中血红细胞受到氧化应激

文摘

我们研究的本质阐明红血球含有残余DNA, Howell-Jolly (HJ)红血球和网织红细胞(retics) thalassemic循环中出现的典型的病人,尤其是脾切除术后。用流式细胞术方法,我们测量患者的这些细胞的氧化状态参数β地中海贫血。在每个病人的研究中,这些细胞活性氧含量较高和磷脂酰丝氨酸暴露相比已经没有dna的细胞。这些结果表明,氧化应激在thalassemic发展中红细胞前体细胞,通过DNA-breakage,生成氧化应激的HJ-retics HJ-RBCs和外化的磷脂酰丝氨酸参与清除这些细胞从循环的脾脏,清除衰老的机制类似于红细胞表面。

1。介绍

红细胞(红血球)的发展从他们的祖细胞在骨髓中包括摘出术的过程中有核的最后阶段红细胞前体(正色的正常红细胞)驱逐他们的核产生无核的网织红细胞(retics),离开骨髓和成熟成红血球(1]。红细胞表面通常有核(正常红细胞)是检测不到的循环,但在一些血液疾病(例如地中海贫血和镰状细胞病)他们可以在大量1]。这些疾病也具有成熟的红细胞表面和retics包含DNA残留,这被称为Howell-Jolly (HJ)身体1]。这些细胞的频率很低,量化使用流式细胞仪技术(2- - - - - -4]。

脾脏是主要的网状内皮系统衰老红细胞表面的他们的寿命被erythrophagocytosis [5]。它还从循环正常红细胞和HJ-cells删除;因此,在地中海贫血和镰状细胞病,这些细胞的数量在脾切除术后的患者的循环大大增加(1]。

清除衰老红细胞表面被归因于各种机制(5),包括接触(外部化)磷脂酰丝氨酸(PS)表面(6]。网状内皮系统携带的巨噬细胞表面受体,特别是结合PS,他们内化衰老红细胞表面(7]。的机制正常红细胞和HJ-cells从流通中删除是未知的。

我们曾表明,溶血性贫血,包括地中海贫血和镰状细胞病,红细胞表面受到氧化应激(8],他们产生更多的活性氧(ROS)和减少谷胱甘肽含有低于正常红细胞表面,导致膜脂质过氧化和外化的PS等变化。

使用流式细胞仪,在目前的研究中我们证明HJ-RBCs retics受到氧化应激和携带暴露PS,可能存在触发器被巨噬细胞吞噬作用和切除脾脏。

2。材料和方法

血液样本
外周血(PB)样本获得正常的捐助者和splenectomized nonsplenectomized患者β地中海贫血中间体和专业。从计算获得样本瓶毕竟诊断实验室测试完成。这项研究是通过人体实验hebrew大学医学中心审查委员会。病人的突变和一些相关临床参数(例如,输血和螯合疗法,脾切除术)以前总结(9]。polytransfused患者,血液样本得到输血之前,也就是说,至少3周后,以前的输血。知情同意是在所有情况下获得的。

流式细胞仪测量氧化应激的标记
细胞被染为transferrin-receptor酝酿了5μL APC-conjugated抗体(Ab)在4°C CD71 30分钟。样本洗,然后分成两个整除:一个整除是彩色的ROS 2′7′二乙酸-dichlorofluorescin (DCFH,σ,圣路易,密苏里州),在最后的0.1毫米的浓度,在37°C 15分钟,然后用Ca洗了三次^{+ +}- - - Mg^{+ +}无杜尔贝科phosphate-buffered-saline (PBS)(生物产业、Beit-HaEmek、以色列)。20毫米的原液制备光纤甲醇(生物实验室,耶路撒冷,以色列)。另一能整除的是彩色外部磷脂酰丝氨酸(PS), 100年通过悬浮细胞μL的钙缓冲区((10毫米玫瑰,140毫米CaCl氯化钠和2.5毫米₂(pH值7.4))和2μL (FITC-conjugated Annexin-V(智商的产品,格罗宁根、荷兰)。15分钟后在室温下,在黑暗中,这些细胞被洗了三次缓冲钙和resuspended 0.5毫升的相同的缓冲区。

对于每个试验,2μL propidium碘(π,Mallinckrodt化工厂,圣路易斯,密苏里州),添加了柠檬酸钠溶解在0.1%,之前的分析。细胞仅沾anti-CD71 Ab,沾anti-CD71 Ab和annexin-V,或细胞染色anti-CD71 Ab和DCF被用作控制设置薪酬水平。上述治疗后,分析了细胞的荧光激活细胞分选仪(FACS-calibur,正欲Immunofluorometry系统,山景,CA)。仪器校准和设置进行使用CaliBRITE-3珠子(正)。细胞通过~ 1000每秒的速度,使用生理盐水作为鞘液。使用488 nm氩激光激发。阈值设置了光散射(FSC)排除血小板和细胞碎片。盖茨是红血球,HJ-RBCs、retics HJ-retics,正常红细胞和白细胞。细胞标记和DCF annexin-V FL-1 PMT检测到的,和细胞贴上APC-conjugated anti - cd - 71 Ab和πFL-4 FL-2 PMT,检测到的分别。所有pmt对数放大。 The Mean Fluorescence Intensities (MFIs) and the percentages of positive cells were calculated using the FACS-equipped CellQuest software (Becton-Dickinson). The results are expressed as the average ± standard deviation (SD) and compared using the two-sample Student’st以及不同的意思。

3所示。结果与讨论

PB细胞同时沾一个anti-CD71 Ab和π,和贴现或annexin-V。anti-CD71 Ab是转铁蛋白受体,π核酸含量。评估的贡献RNA(尤其是retics含有少量的残余RNA) PI染色,PB细胞被沾染了π核糖核酸酶的存在与否(0.4毫克/毫升,表达载体,卡尔斯巴德,CA)。没有区别是在这些样本之间的π染色的模式。染色过程识别红细胞表面细胞(CD71-PI -), HJ-RBCs (CD71-PI +),白细胞(CD71-PI + +), retics (CD71 +π-),HJ-retics (CD71 +π+)和正常红细胞(CD71 +π+ +)。图1(一)显示了流式细胞术dot-plot(π与CD71)分析血液样本来自splenectomized代表β-thalassemic病人,表明不同的细胞群。每个细胞群的荧光分布直方图DCF-fluorescence,表明代ROS和膜联蛋白V-fluorescence,表明暴露PS,小额信贷机构,如图1 (b)和1 (c),分别。结果显示较高的活性氧和PS retics比成熟的红细胞表面,而且,更关键的是,与non-HJ同行相比,HJ-cells:在实验中呈现在图1 (b),显示ROS的结果,HJ-RBCs MFI的2.3倍高于红细胞表面,和MFI HJ-retics比retics高出2.4倍。在图1 (c)PS的结果,显示HJ-RBCs MFI的15.3倍高于红细胞表面,和MFI HJ-retics比retics高出12.1倍。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图1

β 流式细胞术分析ROS和PS的血细胞。从splenectomized血细胞- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -thalassemic病人同时染色anti-CD71抗体和propidium碘(π)和DCF ROS的测量或annexin-V测量外部PS。(a) CD71和πdot-plot识别细胞红血球(CD71-PI -), HJ-RBCs (CD71-PI +),白细胞(CD71-PI + +), retics (CD71 +π-),HJ-retics (CD71 +π+)和正常红细胞(CD71 +π+ +)。((b) - (c))荧光分布直方图的每一个细胞群对活性氧(b)和PS (c)。结果表示为平均荧光指数(MFI)给出了每个细胞群。

图2(一个)描述HJ-RBCs的频率在正常献血者的PB和thalassemic病人。结果显示正常没有HJ-RBCs捐赠者和更高频率的HJ-RBCs splenectomized患者相比nonsplenectomized病人。数据2 (b)- - - - - -2 (c),总结PS-exposing的平均比例ROS生成和细胞,显示参数都明显高于HJ-RBCs与红血球和HJ-retics与retics。结果还表明,参数都是高细胞splenectomized与nonsplenectomized病人,表明脾脏移除受损的细胞。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图2

1(一) HJ-cells及其氧化状态的频率在正常捐赠者和thalassemic病人。细胞从正常的血液捐赠者和splenectomized nonsplenectomized thalassemic患者(在每组)染色,分析在传奇人物。(一)HJ-RBCs的频率。(b) ROS生成。(c) PS曝光。结果表示为(a),红细胞的人口比例平均±S。D的意思是DCF-fluorescence指数(MFI) ROS (b)和细胞的百分比积极沾annexin-V PS (c)。

虽然来自发展中红细胞前体细胞的核驱逐的过程已经被广泛的研究(10,11的原因),核(HJ-bodies)剩下的残余阐明retics和红血球在某些疾病尚未研究。我们现在报告β地中海贫血ROS的生成和PS的外化,这两个参数的氧化应激,HJ-retics升高,HJ-RBCs而no-HJ-containing同行。ROS可能HJ形成的原因。他们是导致DNA断裂(12在不同的细胞类型中可能产生微核13),包括淋巴细胞和中性粒细胞。微核的出现已经用作生物标记细胞遗传学损伤(14,15]。这些微核相当于HJ红血球的尸体。沪江的身体形成的机制必须发生在核驱逐。我们以前证明thalassemic红细胞前体细胞,包括正色的正常红细胞,比正常的同行在较高的氧化状态(9]。可能是假设/核DNA断裂引起的氧化应激可能导致不完整的核材料的驱逐,导致核残留物留在retics和成熟的红细胞表面。

几项研究[16),包括我们自己的(9),表明ROS刺激红血球PS外化。暴露PS建议,除了其他机制,如减少表达CD47 [17)和绑定的自体免疫球蛋白和调理素(18,19)信号erythrophagocytosis和清除衰老红细胞表面的循环。据我们所知,吞噬和清除外周血正常红细胞的信号或HJ-cells尚未研究。我们的发现加强接触的PS HJ-cells可能表明暴露PS可能参与清除这些细胞的脾脏,虽然不能排除其他信号。

总之,本研究的结果表明,氧化应激在发展中红细胞前体可能产生HJ-retics HJ-RBCs和氧化应激外化的PS可能参与他们的去除由脾循环,去除老化的机制类似于红细胞表面(衰老)。

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