镰状细胞病转基因小鼠血管通透性屏障的时空功能障碍

摘要

镰状细胞病(SCD)的特征是慢性血管内溶血，在血液循环中产生过量的无细胞血红蛋白。血红蛋白可导致多种内皮功能障碍，包括血管通透性增加，对血管活性激动剂反应性减弱，白细胞与内皮的黏附增加。虽然SCD与无细胞血红蛋白相关的黏附性和血管舒缩性缺陷已经明确，但血管通透性表型仍未得到充分认识。我们在两种广泛使用和临床相关的SCD小鼠模型中解决了这个问题。我们发现，在年轻人的大多数器官中，内皮屏障是正常的，但随着年龄的增长而恶化，尤其是在肺中。事实上，中年镰刀状小鼠出现了肺水肿，这首次揭示了SCD小鼠和人类肺部慢性通透性表型的相似性。将溶解的红细胞静脉注射到镰状小鼠的血液循环中，可显著增加肺血管通透性，而不影响其他器官的通透性。因此，血管通透性增加是SCD的内皮功能障碍，肺中的屏障可能是最容易发生急性炎症的。

1.导言

镰状细胞疾病（SCD）的特征在于生产红细胞，以增加裂解和粘附的倾向[1］.其临床表现大致可分为溶血和血管阻塞两种亚型[2]SCD中至少30%的溶血是血管内的[3.]，这意味着本病的内皮细胞壁持续暴露于无细胞血红蛋白。内皮细胞是一种半透性屏障，调节血管壁对炎症激动剂的反应。这种反应涉及粘附分子表达的激活、内皮细胞通透性的增加和血管外渗从血液进入间质组织室的液体[4.］.血管通透性增加的原因是内皮细胞与细胞接触部位的缝隙打开。SCD有多个全身炎症指标[5.]此外，还记录了血管炎症的标志物[6.-8.］.伯克利镰刀状小鼠肺内皮细胞中黏附分子表达增加[9.]，尽管这些小鼠的组织学表现出较轻的炎症和缺血性变化，且没有肺炎的迹象[10.］.然而，他们会自发地发展为肺动脉高压[11.]，这是惩教署的主要问题[12.］.肺水肿和急性胸部综合征涉及SCD慢性和急性并发症的血管通透性增加[13.那14.］.尽管如此，目前尚不清楚SCD影响的主要器官的血管通透性表型。

2.材料和方法

2.1。转基因镰刀小鼠

使用埃默里大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议进行实验。伯克利[15.]和汤斯[16.]先前已经描述了使用的转基因SCD小鼠模型。

2.2。血管泄漏和肺水肿

通过静脉注射细胞渗透EVAN的蓝色染料研究了血管泄漏，如几种研究人员广泛描述的。小鼠注射了100 μL 1％的细胞不透气evans蓝色染料（Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo）在PBS中静脉内静脉静脉内静脉。40分钟后，通过I.P麻醉小鼠。注射AVERIN（300mg / kg体重）。为了从循环中除去染料，通过通过心脏的左心室注射含有2mM EDTA的40ml PBS来灌注小鼠，使血液通过穿刺肾动脉而流出。收获器官被收获并在甲酰胺中孵育3天，以提取在620nm处测定的染料和外部。对于水肿分析，将小鼠安乐死，并且使用等距换能器（哈佛装置，霍斯顿，MA）立即取出并立即称重。肺在烘箱中，在含有干燥剂晶体的80℃下干燥24小时，测定干重，并计算比率。

２.３.统计分析

使用GraphPad软件5.0版本。分析血管渗漏和重量的差异-使用Pearson检验进行的测试和相关性研究。

3.结果和讨论

在SCD中，血管系统的粘附性和血管舒缩性缺陷是很明确的[17.-20.]为解决这一知识缺口，成年（3-6个月）和中年（10-13个月）小鼠通过尾静脉注射1%伊文思蓝，并将从循环中漏出的染料量注入检查的各个器官的实质。图1（a）在大脑上表现出没有泄漏与其他器官内皮阻隔崩溃的明确证据相反。血管泄漏的定量表明，内皮屏障通常在镰状小鼠中易于渗透，而不是对照窝组箱（图1（b）和1 (c))事实上，稳态血红蛋白浓度与肺通透性之间存在显著相关性（图1）1 (d)) (那)，提示内皮屏障功能障碍与SCD的一个方面有关。与大多数器官不同的是，中年镰状瘤小鼠肺中的血管通透性明显高于成年小鼠，这突出了年龄在这种疾病过程中的作用。我们将研究范围扩大到5-6周年龄更小的小鼠。值得注意的是，在疾病的早期阶段，心脏和肺的渗透性与大脑的渗透性相同，众所周知，大脑具有高度限制性的屏障(图)1 (e)和1 (f)）.因此，SCD中的内皮屏障在年轻时在大多数器官中是正常的，在成年时变得异常，并随着年龄的增长进一步恶化，特别是在肺中。

（一种）

（b）

（C）

(d)

(e)

(f)

（一种）
（b）
（C）
(d)
(e)
(f)

图1

镰刀小鼠的血管屏障功能障碍。（a）用empans蓝色染料在注射后从镰刀小鼠分离的器官的代表性图像，并在甲酰胺中孵育三天。（B，C）成人（3-6个月）和中年（10-13个月）小鼠（杂合子 - HBA）的表明器官中血管渗漏（/）和homozygote镰刀-HBSS（/））和伯克利（Hemizygotes和Sickle）模型。研究的小鼠数量如下：镇上：对于每个基因型和年龄组;伯克利:镰刀成人,中年镰刀；半合子成人,那半合子中年．(d)血管渗漏与血红蛋白相关。数据显示的是伯克利模型中总共30只小鼠(15只镰状体和15只半合子体)的肺血管渗漏。(e)从年轻(4-6周龄)伯克利小鼠注射Evans蓝染料并在甲酰胺中孵育3天的指示器官的典型图像。(f)定量显示幼年镰状小鼠主要器官伊文思蓝渗出的直方图．＊那＊＊和* * *．

肺水肿是SCD中一种常见的死后发现，但它尚未被认为是SCD的一种慢性肺并发症，可能是因为死亡的混杂效应[21.那22.］.然而组织学并没有显示伯克利镰刀状小鼠水肿的证据[10.]，我们使用了一种更敏感的方法来清楚地证明Berkeley和Townes镰刀小鼠肺中的血管通透性增加。我们的结果与最近的一项研究一致，该研究使用相同的方法专门研究了12-16周龄NY1DD镰刀小鼠肺中的通透性[23.].与这些通透性研究结果一致，我们发现中年镰状小鼠的平均湿肺重量显著高于年龄匹配的半合子（0.64 mg±0.04对0.54 mg±0.02；)因此，广泛用于确认肺水肿的湿/干重比明显更高()(图2(一个)）.综上所述，这些结果首次表明中年镰状体小鼠出现肺水肿。我们不能排除慢性心力衰竭导致肺水肿的可能性;然而，用于测量肺重量的伯克利小鼠比那些报告患有心力衰竭的小鼠至少年轻3个月[11.］.重要的是，我们表明肺水肿与镰刀小鼠肺中较高的血管渗透性相关。这种一致性推进了概念和实践研究目标。它表明，小鼠和SCD的人类肺的渗透性表型是相似的，并且首次验证了EVANS蓝插入方法以研究转基因镰刀小鼠的血管渗透性。

（一种）

（b）

（一种）
（b）

图2

小鼠镰状肺血管通透性的慢性和急性变化。(a)通过湿/干体重比测定中年伯克利镰刀状小鼠的肺水肿(）.对照组包括年轻的镰状鼠(）和年轻（)中年()半合子。（b） 静脉注射溶解红细胞的伯克利镰刀小鼠指定器官的血管渗漏。注意，肺中溶解的红细胞显著增加了通透性，但其他器官中没有**．

这里确定的渗透性表型可能反映了单个器官的内在特性，以及内皮细胞类型。例如，内皮细胞连接的异质性导致了独特的通透性[24.[这可能还考虑在此报告的渗透性表型的一些显着差异（例如，脑和肺）。然而，个体器官中的内皮细胞也可能与SCD中发现的屏障扰乱因子不同。在这些因素中，无细胞的血红蛋白是独特的，因为它在急性血管内溶血期间释放出丰富，这是SCD中的每日事件。我们评估了主要血管床在镰刀小鼠中的反应急性溶血。通过重复的冻融循环裂解髓耗尽的填充红细胞，并通过尾静脉静脉内施用于镰刀小鼠。与盐水相比，裂解的红细胞在成人镰刀小鼠的肺部肺部增加了血管渗透性，但对肾脏，脑和心脏产生了适度或可忽略的影响（图2 (b)）.裂解的红细胞引起了伯克利镰刀小鼠的发病率和显着改变的屏障功能表明，这种和其他严重模型的SCD可用于解锁SCD中急性溶血机制。特别是肺内皮屏障对裂解红细胞的脆弱性突出了急性血管内溶血作为急性胸综合征的潜在触发，因为血红蛋白的浓度总是与这种情况相关的[14.］.

总之，SCD的特征似乎是内皮屏障减弱，这使某些器官(如肺)容易出现屏障功能的急性丧失，令人想起急性胸综合征。正在进行的研究重点是阐明SCD急性溶血和内皮屏障之间的关系。

作者的贡献

S. Ghosh设计并完成了大部分实验。F. Tan对转基因小鼠进行了表征和研究。S. F. Ofori-Acquah设计了这项研究，并全面监督了这些项目。

致谢

作者感谢阿拉巴马大学伯明翰分校的Townes博士对SCD基因敲除转基因小鼠和伯克利伯克利小鼠的阿切尔博士，这项工作得到了SoFA授予的R01HL07769的支持。

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