胎儿血红蛋白诱导体内由人工合成的γ-珠蛋白锌指激活剂

摘要

镰状细胞病(SCD)和β-地中海贫血患者表型正常，如果他们携带代偿性遗传持久性胎儿血红蛋白(HPFH)突变，导致胎儿血红蛋白水平升高(HbF，γ-珠蛋白链)。因此，研究集中在如何操纵大脑的再激活γ-成人最终红细胞生成过程中的珠蛋白基因表达是治疗这些血红蛋白病最有希望的疗法。人工转录因子（ATF）是一种合成蛋白质，旨在结合特定的DNA序列并调节基因表达。人工锌指gg1-VP64旨在针对−117本区域^一个γ-珠蛋白基因近端启动子并激活该基因的表达。先前的研究表明，HbF水平在小鼠二聚体化学诱导剂(CID)依赖的骨髓细胞携带人增加β-珠蛋白位点酵母人工染色体(β-YAC)转基因和CD34⁺来自正常供体的红系祖细胞β-地中海贫血患者。在此，我们报告gg1-VP64增加γ球蛋白基因表达在活的有机体内来自gg1-VP64的外周血样本β-YAC双转基因（双基因）小鼠。我们的结果表明，ATFs在动物模型中可增加基因表达。因此，这类试剂可能是治疗某些遗传性疾病的有效基因疗法。

1.介绍

人类血红蛋白是由两个分子组成的四聚体分子α-像两个β分别位于16号和11号染色体上。的β类链是由五个功能基因之一(胚胎)的产物组成的ε,胎儿-及-，及成人δ-及β-珠蛋白)，它们按照在基因座排列的顺序在发育过程中表达[1，2].随着人类红系发育的进行，适当的β类珠蛋白基因被激活或抑制，从而产生在整个发育过程中表达的不同血红蛋白链[2］.胎儿血红蛋白转换γ球蛋白成人β-珠蛋白基因表达在出生前不久开始，通常在出生后的前6个月内完成。在某些个体中，血红蛋白转换未完成，导致一种称为胎儿血红蛋白遗传持久性（HPFH）的疾病，其特征是胎儿血红蛋白（HbF）高表达，γ-珠蛋白)在成人最终红细胞生成过程中[1，2］.镰状细胞病(SCD)和β-地中海贫血患者表型正常，如果他们携带导致HPFH的代偿突变[1，2］.这些遗传学研究表明，HbF的增加将有助于缓解与这些血红蛋白病相关的病理生理学，因此，研究集中在阐明参与维持或激活的途径γ-珠蛋白通过药物或基因治疗表达。

药理药物如丁酸盐、地西他滨和羟基脲可有效诱导HbF体外和在活的有机体内［3.］.迄今为止，羟脲，一种核糖核酸还原酶抑制剂，是唯一被批准用于镰状细胞患者临床治疗的药物[3.］.虽然它对儿童患者有效，但该药物也显示了诱导的作用γ-珠蛋白在成年患者中的作用，但对器官损伤、中风和癌变的长期影响仍不确定[3.- - - - - -5］.因此，有必要开发新的、更有效的治疗SCD和SCD的药物β-地中海贫血。

许多研究已经证明了阶段特异性转录因子在血红蛋白转换中的作用，表明这些转录因子有可能用于治疗血红蛋白病[6- - - - - -9］.锌指转录因子BCL11A最近被证明是HbF表达的抑制因子[6］.当红细胞Krüppel-like因子1 (EKLF1, KLF1)时，为成人β-珠蛋白基因特异性锌指转录因子在红系祖细胞CD34中被敲除⁺细胞,γ-珠蛋白表达被诱导[9]DRED（direct repeat Red oid definitive）是一种阻遏复合物，可与细胞内的直接重复（DR）元件结合ε-及γ-珠蛋白基因启动子和该复合物中的两个成分是孤儿核受体TR2和TR4[8］.强制表达的TR2/TR4增加胎儿γ-珠蛋白基因在成人红系细胞中的表达β-YAC转基因小鼠[7]在人源化SCD小鼠的成年红系细胞中也是如此[10］.这些研究清楚地表明，转录因子的操纵有效地重新激活γ-成人终末期红细胞生成过程中的珠蛋白表达。

合成锌指转录激活剂的使用，旨在与特定的DNA序列相互作用，并激活基因表达已被充分证明[11- - - - - -14］.事实上，来自细胞系研究的数据表明，合成的激活剂针对的是近端启动子-珠蛋白基因已成功诱导γ-珠蛋白基因表达[11- - - - - -15]人工锌指gg1-VP64设计用于与−117本区域-珠蛋白基因近端启动子[12］.增加了7 - 16倍γ在稳定转染gg1-VP64的K562细胞中观察到-珠蛋白表达[12].增加γ将gg1-VP64构建物转染人骨髓细胞后，也观察到-珠蛋白基因表达β-珠蛋白位点酵母人工染色体(β-YAC）转基因小鼠[11].最近，据报道gg1-VP64激活剂可显著增加CD34中的HbF水平⁺来自正常人类捐赠者的红细胞祖细胞β地中海贫血患者(14，15].在本研究中，我们证明gg1-VP64增加γ-成人终末期红细胞生成过程中珠蛋白基因的表达β-YAC转基因小鼠。

2.材料和方法

2.1.gg1-VP64构造

通过将gg1-VP64-HA融合蛋白克隆到独特的载体中，获得gg1-VP64-HA融合蛋白的强制红系特异性表达，该融合蛋白由gg1锌指部分、VP64激活剂和用于检测该蛋白融合的HA标签组成Bgl二、pμLCR -β公关,Bgl二世,βInt2-enh，一种载体，以前被证明能使红细胞/巨核细胞限制性表达在连接基因上[11，12].A 0.8 KbApa我-后III gg1-VP64片段做成钝端连接Bglii切割，钝端，磷酸酯pμLCR -β公关,Bgl二世,β如前所述，产生int2 enh.转基因小鼠[16，17］.这些老鼠被杂交β-YAC转基因小鼠[16]产生四条带有gg1-VP64结构和β-YAC reporter（2、7、10和18）。使用以下引物序列，采用PCR对转基因系进行基因分型：β-YAC:胡ε球蛋白,5“-TTCTTGGAAAAGGAGAATGGGAGAGAT-3”;胡ε-globin reverse, 5 ' -GCAGTAAAATGCACCATGATGCCAGGC-3 ' and gg1-VP64: tf - 3,5 ' - ttctcccgcagcgatcc -3 ' and tf - 4,5 ' -CCAAAGCACCTGGGTCTGA-3 ' [12］.

2.2.苯肼对小鼠的治疗

成人bigenic gg1-VP64β-YAC与单转基因β≥6周龄的-YAC小鼠给予苯肼60 mg (10 mg/mL磷酸盐缓冲盐水;p - 6926;(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)连续3天腹腔注射每公斤体重[18］.处理后第4天处死小鼠，取脾脏、肝脏和血液进行总RNA提取和细胞裂解液制备。

２．３．逆转录酶PCR (RT-PCR)和实时定量PCR (qPCR)

使用GenElute哺乳动物总RNA纯化试剂盒（美国密苏里州圣路易斯市西格玛·奥尔德里奇）从成人血液和组织裂解物制备总RNA。 使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）合成cDNA。使用gg1-VP64特异性引物TF-3，5′-TTCTCCCGATCAC-3′和TF-4，5′-CCAAGCACCTGTCTGA-3′进行RT-PCR[12］.

采用SYBR Green染料，使用MiniOpticon或CFX96仪器(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)进行qPCR分析。的表达γ-及β-如前所述，使用相对定量方法计算珠蛋白[19，20.]，使用β-YAC转基因作为对照。用于表达研究的PCR引物序列为：Hu-γ1,5′-GACCGTTTTGGCAATCCATTC-3′；胡-γ2、5“-GTATTGCTTGCAGAATAAAGCC-3”;β-珠蛋白FWD，5′-GAGAAGGTGCCGTTATGCC-3′；β-珠蛋白REV，5′-CCGAGCTTTCGCCATGA-3′；Mo-Gapdh-FWD，5′-aggtgtctcctgcgactca-3′；Mo Gapdh版本，5′-CCAGGAATGAGCTGACAAG-3′；钼-α-珠蛋白FWD，5′-GATTCTGCAGACTCAGAAC-3′；钼-α球蛋白牧师5“-CCTTTCCAGGGCTTCAGCTCCATAT-3”。生成三组重复数据集，qPCR结果归一化到小鼠Gapdh或Gapdhα球蛋白基因。

2.4. 蛋白质印迹分析

二聚反应(CID)依赖的化学诱导剂β-骨髓细胞[11和依赖cid的gg1-VP64β-YAC骨髓细胞裂解物制备如下[21，22］.用Bradford分光光度法测定蛋白质浓度。15μg细胞裂解液与负载染料(50 mM Tris pH 6.8, 100 mM DTT, 2% SDS, 0.1%溴酚蓝，10%甘油)混合，在95℃加热5分钟，然后在10% SDS-12%聚丙烯酰胺凝胶中用Tris-甘氨酸缓冲液分离。如前所述进行Western blotting [22]，根据标准程序[21］.

2．5．抗体

反β-actin (sc-21757 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)和抗ha探针(Y-11, sc-805, Santa Cruz Biotechnology)、山羊抗兔HRP (sc-2030, Santa Cruz Biotechnology)和山羊抗小鼠HRP (sc-2031, Santa Cruz Biotechnology)抗体进行western blotting。

2.6。流式细胞术检测HbF

通过流式细胞术分析检测HbF（F细胞）。简单地说，从肝素化毛细管的尾静脉收集小鼠血液。10μL全血在PBS中洗涤并固定在1 mL 4%新鲜多聚甲醛（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市）。离心细胞，丢弃上清液，并在1小时内重新悬浮颗粒 毫升冷丙酮 : 甲醇（4 : 1） 1分钟。细胞在冰冷的PBS/0.1%BSA中洗涤两次，并在800中重新悬浮 μL PBS/0.1% BSA/0.1% Triton X-100 (PBT)。一个μg羊抗人血红蛋白f - fitc偶联抗体(A80-136F, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA)加入100μ在室温下培养40分钟。细胞用1.5%乙醇洗涤两次 mL冰冷PBS/0.1%BSA，并将微丸重新悬浮在200℃下 μPBS的L。细胞分析使用BD LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)，带有530/30 nm发射滤波器(FITC/GFP)。使用BD FACSDiva软件(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)采集30000个事件的数据进行分析。

3.结果

３．１．建立gg1-VP64β-YAC转基因线

目的:评价合成锌指gg1-VP64对肿瘤的影响γ-珠蛋白基因在成体最终红细胞生成过程中的表达，产生gg1-VP64转基因品系并育成β-YAC转基因小鼠[16，17，23］.四个gg1-VP64β获得-YAC双生品系(品系2、7、10和18)，本研究利用这些品系的样本。从gg1-VP64结构的一个特定区域扩增出的PCR产物证实了gg1-VP64结构的存在。此外，人类的存在β-珠蛋白位点经人PCR扩增证实ε-珠蛋白基因，以确认β-YAC转基因（见材料和方法部分）。gg1-VP64在gg1-VP64成年血样中的表达β-YAC双基因系的mRNA水平通过RT-PCR得到证实(图1(一)).仅在含有gg1-VP64结构的样品中观察到gg1-VP64片段的扩增。

为了进一步证明gg1-VP64融合蛋白在蛋白水平上的表达，我们从gg1-VP64中获得了依赖cid的BMCsβ-YAC生殖小鼠如前所述[11］.这些细胞保持了与成年转基因小鼠相同的珠蛋白基因表达模式。使用抗HA标签抗体进行Western blotting，该抗体特异性识别用于产生转基因株系的gg1-VP64构建中的HA标签[12］.gg1-VP64中检测到与ha标记的gg1-VP64片段相对应的29 KDa片段β-YAC CID bmc，但不在β-YAC CID BMCs缺少gg1-VP64作为对照(图21 (b))总之，这些数据证实了gg1-VP64中gg1-VP64锌指结构在蛋白质水平上的表达β-YAC bigenic线。

3.2.胎儿血红蛋白在gg1-VP64中的表达β-YAC小鼠成体最终红细胞生成

测试gg1-VP64的存在是否诱导γ-珠蛋白在成人红细胞生成中的表达β-YAC转基因小鼠，人β-用qPCR法检测了F₂或F_3.一代成年小鼠。小鼠α-珠蛋白和Gapdh作为内控物定量人β类珠蛋白转基因表达水平。所有值都归一化到这些内参，并根据转基因和内源性基因拷贝数进行校正。增加了5倍γ在gg1-VP64的外周血标本中观察到-globin基因的表达β-YAC双生系与野生型比较β-YAC小鼠（图2(一个)）.成年人的表情β在来自gg1-VP64的成人血液样本中，-珠蛋白基因被证明有轻微的增加β-YAC双生系，但增幅不显著(图2 (b)）.

进一步证明了这一点γ-globin mRNA在gg1-VP64中的表达β-YAC双生系与含hbf细胞的百分比增加相关，使用抗人血红蛋白f - fitc偶联抗体进行流式细胞术分析。的gg1-VP64β-YAC大鼠的F细胞分别增加了8.8%和7.6%(图)3（c）和3（d）)与野生型相比β-YAC转基因对照(0.8% F细胞;数字3（a））.阳性对照包括先前描述的−117希腊HPFHβ-YAC小鼠（32.4%F细胞；图3（b））.我们还对gg1-VP64进行了染色β-具有相同抗体的YAC双基因小鼠外周血细胞纺锤体（图4)，表明F细胞在gg1-VP64中呈异细胞分布β-YAC动物(数据4（c）和4（d）)，相比于−117希腊语HPFH的pancell分布β-YAC小鼠（图4（b）; [23]).尽管图中的每个面板中仅显示了一个具有代表性的显微镜场4与野生型相比，阳性染色细胞的数量大约高出10倍β-YAC转基因小鼠(图4（a）；数据未显示）。

从苯肼处理过的gg1-VP64脾脏提取的RNA样本中也评估了gg1-VP64的作用β-YAC bigenic老鼠。苯肼处理会引起高浓度的γ由溶血性贫血引起的网状细胞增多引起的-珠蛋白基因表达[18］.对gg1-VP64 RNA样本进行qPCR检测β-YAC line 7，并增加了100倍γ-珠蛋白表达与苯肼处理比较β-YAC对照小鼠（图5）.我们的数据表明锌指gg1-VP64结构增加γ球蛋白基因表达在活的有机体内在成人最终红细胞生成过程中。

4.讨论

利用合成的基因靶向转录因子结合特定的DNA序列来调节内源性基因的表达是一个新兴的领域。基因工程锌指转录因子，其中锌指基序耦合到一个激活域提供新的治疗场所，以增强基因表达和治疗疾病，如血红蛋白病[14，15，24- - - - - -26］.

转录因子gg1-VP64是一种六聚锌指状DNA结合结构域，专门设计与18碱基对靶DNA序列在近端启动子的−117核苷酸相互作用-珠蛋白基因[12].我们的研究表明γ-珠蛋白基因在mRNA和蛋白水平的表达在活的有机体内在gg1-VP64的成人最终红细胞生成期间β-YAC转基因小鼠。我们的数据证实了之前发表的数据γ-在依赖CID的K562细胞中，珠蛋白基因表达增加β-YAC bmc和人红细胞CD34⁺转染gg1-VP64构建物后的祖细胞[11- - - - - -15］.- 117位G-to-A突变-珠蛋白基因与希腊人口中胎儿血红蛋白水平高相关(希腊遗传持久性胎儿血红蛋白或HPFH) [27］.这种突变改变了直接重复元素(DR1)珠蛋白基因启动子[7，8，28]有趣的是，一种叫做DRED（direct repeat Red oid definitive）的复合物结合了这个相同的区域，使胎儿基因沉默γ-珠蛋白基因[7］.

许多研究已经在携带人类基因的转基因小鼠模型上进行β-珠蛋白基因座结构[16，29- - - - - -31］.与人类不同，老鼠没有胚胎期特异性血红蛋白。然而,人类的-globin基因在小鼠中作为胎儿基因，HPFH表型在−117、−175、−195或−566转基因小鼠中重演-珠蛋白HPFH点突变珠蛋白构建或β-YACs ([23，27，32- - - - - -34),未公开的数据)。这些模型已被广泛地用于理解的功能独联体表演元素和反式-环境中的作用因素γ-珠蛋白位点，包括其在恢复中的潜在作用γ-成人红细胞生成中的珠蛋白表达[23，27，32- - - - - -34］.最近，强制的表达反式-作用因子TR2/TR4孤儿核受体显示增加γ-人源化SCD小鼠模型成年红系细胞珠蛋白基因的表达[10].在另一项研究中，基因敲除BCL11A在SCD小鼠中显示出增加γ-珠蛋白表达和红细胞存活，从而纠正SCD表型[35］.总之，这些研究证明了小鼠模型在筛选可重新激活HbF的转录因子方面的实用性在活的有机体内．最后，本研究提供的数据表明，一个合成的转录因子可以诱导表达γ-珠蛋白基因表达与HbF在活的有机体内在成年转基因小鼠最终红细胞生成过程中，支持使用这些结构作为治疗镰状细胞病和其他血红蛋白病的潜在新疗法。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院DK081290和HL067336给K.R.P.的资助

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