造血干细胞在镰状细胞病的小鼠模型

文摘

之前的研究表明,镰状环境是高纯度的活性氧(ROS)。我们检查了镰状细胞病的氧化作用对造血干细胞功能镰状小鼠模型。在体外克隆形成试验明显下降祖集落形成来源于镰状控制相比骨髓(BM)。镰状BM具有显著降低KSL (c - kit⁺Sca -^{1 +},血统⁻)祖人口和细胞周期分析表明,G KSL细胞较少₀阶段的细胞周期控制。我们发现显著增加脂质过氧化和ROS sickle-derived KSL细胞。在活的有机体内分析表明,正常骨髓细胞灌输与频率增加到老鼠镰状控制老鼠相比。造血祖细胞来源于镰刀老鼠,然而,表明移植的潜在的重要障碍。我们观察到移植的部分恢复n -乙酰半胱氨酸(NAC)治疗前KSL细胞移植。增加细胞内ROS和脂质过氧化作用结合改善移植后NAC治疗表明,镰刀小鼠氧化还原环境的改变影响造血祖细胞和干细胞的功能。

1。介绍

镰状细胞病(SCD)是世界上最常见的一种继承的人。在美国,大约在600年,非裔美国人被诊断出患有SCD (1]。的化合物是一种常染色体隐性遗传疾病引起的替代缬氨酸谷氨酸的血红蛋白β亚基的基因。这种替换导致异常的血红蛋白(哈佛商学院)的生产。缺氧HbS聚合,导致血管内溶血的红细胞和血红蛋白和其他化合物释放到血浆(2]。重复周期的聚合和溶血导致vaso-occlusion和缺血再灌注损伤。固有的这些过程都是炎症反应和氧化剂应激导致病理结果,如急性胸部综合症,肺动脉高压,和中风患者的SCD (3]。

氧化应激是增加产量的结果的活性氧(ROS)结合减少生产或可用性的抗氧化剂。细胞代谢的氧气会导致生产超氧化物阴离子自由基等活性氧,过氧化氢和羟基自由基。活性氧可以影响DNA的本征函数,脂类,蛋白质,碳水化合物(4]。助氧化剂和抗氧化剂的失衡会导致氧化应激的环境,细胞功能障碍,或者细胞死亡。抗氧化剂如一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD),并减少谷胱甘肽(GSH)函数中和过量的活性氧。

有越来越多的证据表明,氧化应激和ROS发挥关键作用在许多疾病的病理生理学包括神经退行性疾病,心血管疾病,癌症,和关节炎(5- - - - - -10]。氧化应激与血管缺陷导致高血压和动脉粥样硬化以及心脏缺陷导致收缩功能障碍和心律失常11]。除了诱导DNA突变的能力,在细胞信号传导和细胞ROS发挥关键作用的监管途径,从而发挥关键作用在肿瘤和恶性肿瘤的发展12- - - - - -16]。

在南加利福尼亚长期在低氧条件下,哈佛商学院聚合导致溶血和显著缩短寿命17]。Hemolysed红血球释放血红蛋白、铁和精氨酸酶进入等离子体导致减少一氧化氮可用性,导致血管内稳态不平衡和氧化应激17- - - - - -19]。镰状红细胞表面产生更多的过氧化物、过氧化氢和脂质氧化产品相比正常红细胞表面(20.]。ROS增加血小板和多形核中性粒细胞减少患者谷胱甘肽水平也被记录在SCD (21]。此外,内皮细胞暴露于镰状红细胞表面成为激活,导致镰状红血球和白血球坚持激活内皮细胞,导致细胞因子的释放和活性氧(6,22,23]。在这项研究中,我们研究了氧化剂和促炎的影响这个环境对造血祖细胞和干细胞在伯克利的镰状细胞病模型。

2。材料和方法

2.1。动物

镰状老鼠,最初由Paszty博士(24),表达人类独有α- - - - - -,β^镰状,γ球蛋白和存在于混合遗传背景(FVB / N, 129, DBA / 2, C57BL / 6,和黑色瑞士)。繁殖和怀孕的镰刀老鼠TestDiet没有。0007573(厂家)。殖民地是由繁殖女半合子的小鼠2份转基因纯合子的雄性老鼠。所得的幼崽半合,表达一个(h)或两(2)份转基因小鼠β球蛋白的一个副本,但没有表达小鼠α球蛋白。纯合子小鼠“镰刀”,只有表达人类γ,α和β^镰状球蛋白很容易区分从野生型和h - 2由血红蛋白电泳(图半合子1)[24,25]。h -老鼠~ 28%镰状血红蛋白和老鼠2 ~ 45%。尽管只有一个副本的镰状血红蛋白转基因小鼠h -血液更严重(图1)。2、C57BL / 6主要是用作控制老鼠的纯合子小鼠。所有饲养和实验过程进行了埃默里大学按照制度动物保健和使用委员会的建议(IACUC)。

2.2。流式细胞术

骨髓是收获,沾染了以下fluorochrome-conjugated抗体:CD45.1-PE, CD45.2-APC, c-kit-FITC Sca1-PE, Lineage-APC (B220, CD3、CD11b GR-1, Ter119;圣地亚哥BD Pharmingen CA), KSL FACSAria细胞被排序。分析了外周血细胞在不同时间点上一个光敏电阻II流式细胞分析仪(BD生物科学,圣何塞,CA)。Propidium碘用于排除死细胞。160年对于ROS分析,细胞被孵化μM Dichlorodihydrofluorescein二乙酸(H₂DCFDA)(圣路易斯,密苏里州,Sigma-Aldrich)或5μ米N——(fluorescein-5thiocarbamoyl) 1, 2-dihexadecanoyl -sn-glycero-3-phosphoethanolamine triethylammonium盐(DHPE)(卡尔斯巴德,CA,英杰公司)在哈佛商学院15分钟或60分钟,分别在37°C在黑暗中颤抖。细胞被洗,流式细胞术分析。细胞绝对计数进行使用Trucount管(BD生物科学)。

2.3。高压泵试验

镀二万新鲜分离骨髓单核细胞的甲基纤维素中(干细胞技术有限公司、温哥华)含重组细胞因子(100 ng鼠钢因素,1600 u - csf, 75 u IL-3, 5000 u il - 1α、30 ng / mL EGF和30 ng / mL FGF)分析干细胞的克隆形成潜在的骨髓中提取出来的镰刀和控制老鼠。细胞培养10天,使用倒置显微镜和菌落数。

2.4。血红蛋白分析

微分的外周血血红蛋白电泳伯克利镰刀老鼠进行确定异的小鼠和人球蛋白基因的纯合性(海伦娜泰坦三世电泳系统,海伦娜实验室,博蒙特,TX) (26]。如图1C57BL / 6小鼠表达小鼠β球蛋白“单一”等位基因,和h - 2半合子表达人类β的越来越多^镰状球蛋白在小鼠基因表达“扩散”的存在β球蛋白,老鼠和纯合缺失的小鼠βα和β球蛋白只能表达人类^镰状球蛋白。

2.5。移植

2.5.1。接受环境的影响

测试移植到镰状微环境的影响,从C57BL / 6小鼠骨髓细胞(表达CD45.2)移植到纯合子镰状()和B6.SJL-Ptprc^一个Pepc^b/ BoyJ老鼠(;表达CD45.1)没有消融。而镰状和C57BL / 6分享我等位基因H-2K妇幼保健类^b,他们的遗传背景不相同,因此不太可能分享完整的单体型。我们曾表明,t细胞聚集有关封锁促进移植在allo-barriers在这个模型中,因此它是包含在这个协议。具体地说,500年μg的每一个仓鼠antimouse-CD40L (MR1;BioExpress、黎巴嫩、NH)和人类CTLA4-immunoglobulin (c . Larsen博士慷慨的礼物)给予腹腔内天0,2、4、7相对于BMT。

2.5.2。竞争力的重新研究

测试重新能力单个干细胞的数量,三千KSL细胞来源于纯合子2镰状,或B6.SJL-Ptprc^一个Pepc^b/ BoyJ,排序使用FACSAria (BD生物科学,圣何塞,CA)和cotransplanted了竞争来自C57BL / 6小鼠骨髓细胞。由于潜在的背景差异,F1接受者所产生的老鼠繁殖2镰刀老鼠(表达CD45.1) C57BL / 6小鼠(GFP表达β球蛋白启动子和CD45.2)。这些受体小鼠表达GFP +, CD45.1 CD45.2双阳性细胞(F1小鼠)。所有人(每组)与两剂条件550 cGy全身辐照BMT的日子。谷胱甘肽前体的测试能力,以缓解氧化剂压力选择干细胞群体,群体的供体老鼠也治疗4周,0.163 g / L n -乙酰半胱氨酸(NAC)饮用水(新鲜NAC饮用水是每两天)。老鼠12周的年龄和移植骨髓的时候收获。

3所示。统计数据

所有统计比较进行使用GraphPad棱镜软件利用单向方差分析与图基后续测试分析,除非另有说明(*;* *;* * *)。

4所示。结果

4.1。干细胞数量和功能

细胞绝对计数进行干细胞/祖细胞,成熟的造血细胞为阴性标记(t细胞、CD3;b细胞,B220;红细胞,ter - 119;髓细胞,GR-1 / Mac-1),而阳性c - kit,本来(KSL,图2(一个))。镰状小鼠干细胞明显少于控制老鼠。我们进一步量化人口定义的造血干细胞(HSC);KSL / CD150 + / CD48因子−)[27]。这些细胞在纯合子小鼠相比也明显减少了控制(t以及,图2 (b))。有更少的干细胞在骨髓,我们调查的细胞周期状态HSC静止细胞的数量的减少(G₀细胞周期)与动员有关HSC在正常组织和肝星状细胞是在镰状细胞动员患者(28]。图2 (c)显示了一个减少自行车KSL细胞的数量表明减少静止在骨髓中干细胞的数量。然后我们测试的功能能力KSL细胞使用在体外高增殖潜能(HPP)测定。Sickle-derived干细胞形成殖民地控制(相比明显减少,图2 (d))。

4.2。氧化剂破坏骨骨髓来源的细胞

使用流仪分析和DCF和DHPE染料,我们测量细胞内活性氧含量和脂质过氧化反应,分别在KSL细胞。H₂DCFDA成为细胞内酯酶脱去乙酰基,它穿过细胞膜,变得明亮荧光曾经被活性氧氧化生产DCF (29日]。与过氧化自由基(DHPE失去它的荧光反应29日]。Sickle-derived KSL细胞表现出显著增加脂质过氧化和ROS相比来自正常小鼠和半合(,数据2 (e)- - - - - -2 (f))。重要的是,在上述所有化验,半合的老鼠显示中间表型相关血液学的缺陷。

4.3。镰状微环境的移植

然后我们解决的问题是否镰刀骨髓环境更有利于移植的供体细胞。比较骨髓细胞的移植效率控制(C57BL / 6)和纯合子镰刀老鼠(镰状),我们移植1×10⁷控制男性骨髓细胞在小鼠接受只有聚集有关的封锁。早在移植后4周,有一个显著增加道捐赠者镰状细胞小鼠相比控制老鼠(,图3(一个))。这种级别的移植是非凡的考虑nonablative协议,随着时间不断增加表明,供者细胞生存或增殖优势镰状的环境。外围还显示修正镰状红细胞标记血液学控制水平指示正常镰状红细胞(人物的生存优势3 (b)- - - - - -3 (d))[30.]。

4.4。镰状的造血干细胞移植能力

然后KSL细胞的移植可能来源于控制相比,半合,纯合子镰状的老鼠在一个竞争的重新分析来确定sickle-derived KSL细胞功能受损。首先,我们培育男性半合镰状老鼠女性C57BL / 6小鼠生成老鼠表达CD45.1 +和CD45.2 +表面抗原的细胞(F1)让我们区分捐赠者和主机KSL以及捐赠者BM竞争者细胞。通过高效液相色谱法,我们确认主机F1小鼠进行人类的一个副本β镰状球蛋白基因,以及小鼠α和β球蛋白(数据没有显示)。对于每一个实验,KSL细胞来源于未经处理,以及NAC治疗,控制、半合(2),和纯合子小鼠和移植到致命辐照F1小鼠。外周血分析4、8、12、16、24周后移植(图4(一))。在两个独立的实验中,纯合子sickle-derived KSL细胞表现出显著降低移植功能控制老鼠相比。NAC治疗改善纯合子镰状KSL细胞移植,但没有完全正确的缺陷(图4 (b))。

5。讨论

尽管羟基脲的好处,SCD患者治疗方案有限剩下唯一的治疗治疗造血干细胞移植(HSCT)。虽然孩子接受移植的数量继续增长,现在总数百人,绝大多数仍执行与骨髓条件(最近了31日])。这些移植的结果与高水平的孩子一般都好无病生存。然而[32),有明显的担心长期毒性和并发症的制备方案,特别是对持续的中枢神经系统并发症和性腺的毒性(33]。

持续的愿望能够提供更大的选择的病人移植,包括成人,已经让一些试验利用各种是非协议[34-36]。大多数人没有持续的移植,但谢长廷等人成功移植一小群成人动员外周血从匹配的同胞捐助者37]。这些有限的成功,继续posttransplantation免疫抑制的问题,并且数量有限的hla捐助者将推动替代移植协议和技术与基因疗法纠正自体的细胞。

这些类似的发现在小鼠模型的共济失调毛细血管扩张(ATM),这也证明了干细胞的重要障碍人群至少部分由于ROS和氧化应激(38,39]。共济失调毛细血管扩张是一种罕见的,隐性遗传性疾病,神经变性。的自动取款机基因控制DNA修复、细胞周期和氧化还原内稳态。伊藤等人发现骨骨髓来源干细胞自动取款机淘汰赛老鼠拥有增加活性氧和活性p38 MAPK导致KSL的减少数量,减少克隆形成潜力,静止的损失,和有缺陷的自我更新能力38]。同样,镰刀骨髓减少了克隆形成的潜力,和更少的镰状肝星状细胞是在G₀这表明干细胞动员。这是符合高外周白细胞计数在老鼠和人类和先前的报道SCD的动员。

小鼠镰刀HSC的氧化剂破坏进一步转化为功能性缺陷减少活动竞争的重新分析。有趣的是,半合子和该受到影响。抗氧化治疗NAC的形式提供了部分校正的表现型。ATM模型中也发现类似的结果在6周的治疗与南汽或抗氧化剂过氧化氢酶恢复ATM^−−/HSC CFU接近正常水平的能力(38]。在活的有机体内满HSC移植只是取得收件人老鼠也用NAC治疗。Oxidant-mediated HSC功能障碍是常见的许多其他模型系统包括Fanconi贫血(Fancc^−−/),ROS Fancc导致细胞凋亡^−−/细胞(40]。缺乏FoxO家庭成员也会导致活性氧的增加和减少都HSC数量和调整能力(41]。在这两个模型中,抗氧化治疗NAC能逆转或改善的缺陷。氧化剂介导的干细胞损伤并不局限于造血细胞,例如,金姆和黄了atm的oxidant-mediated缺陷^−−/神经干细胞能顺应NAC (42]。有趣的是推测,高水平的氧化剂压力可能影响其他瀑特异性干细胞数量,而这可能是一个重要的因素进行修复的sickle-related器官病理学。HSC缺陷时还应考虑设计基因治疗协议,可能会有一个可用的肝星状细胞数量减少收集和第二步骤有一个减少移植潜在之前体外操纵。

临床上严重镰状疾病患者,将会是一个理想的目标人群HSCT,移植期间可能遇到更多的并发症是由于持续的疾病病理学和炎症。然而,成功的免疫调节策略我们的数据表明,移植的HSC镰刀环境本身应该是成功的,和供体细胞可能有一个比较优势。这可能是特别重要的,如果设计方法基于已成功地用于混合造血嵌合小鼠模型系统(30.,43]。

所有主要的病理后果SCD的红细胞裂解,内皮细胞激活,vaso-occlusion诱发或加剧ROS的产生后续影响是可能进一步导致病理过程(最近了3,4])。因此,许多研究者研究了在镜头分割使用的抗氧化剂,主要注重于红细胞的影响。维生素C和E和南京都被证明能减少ROS和增加谷胱甘肽在镰状红细胞、中性粒细胞的水平在体外(21]。NAC治疗减少密集的红细胞的形成和细胞内谷胱甘肽的水平增加红细胞的SCD患者;重要的是这与疾患的数量的减少危机在治疗期间(44]。同样,NAC治疗6周减少磷脂酰丝氨酸暴露在镰状红细胞的膜和游离血红蛋白的水平45]表明口服抗氧化剂的细胞效应。

总之,我们描述的影响sickle-mediated氧化剂对骨髓环境压力和造血干细胞和祖细胞和细节缺陷在HSC函数,提高重要的问题在设计未来的干细胞治疗镰状细胞病。

确认

流式细胞术进行流式细胞术Emory-Children的儿科研究中心核心。部分支持来自HL073307 (d·r·阿切尔)。

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