文摘
今天,各种生物的方法被用来对抗牙菌斑生物膜。在当前的研究中,我们旨在比较细菌素提取的影响和裂解性噬菌体生物膜相关的基因的表达变形链球菌。变形链球菌从斑块的蛀牙和孤立存在的gtfs基因PCR证实了。在前两个益生菌乳酸杆菌细菌素提取、分离与传统食物,然后细菌素被部分提取净化方法,和sds - page用于评估其分子量。以前提取的裂解性噬菌体从原始城市污水是用来对付变形链球菌。最后,孤立的细菌素的影响和噬菌体gtfs基因表达水平是衡量实时PCR。81牙菌斑样本,32例(39.5%)变形链球菌菌株被孤立。基因的频率如下:gtfD32 (100%)、gtfB 17(53.12%),和gtfC 19 (53.37%)。120年传统的食物样本(牛奶、酸奶、泡菜和咸泡菜)进行评估为乳酸菌的隔离。三种菌株乳酸菌酵母和四个乳杆菌益生菌的潜在活动被孤立。两种类型的细菌素乳酸菌酵母和一个单一类型的细菌素乳杆菌提取,其分子量是60,58岁的分别和70 kDa。在我们之前的研究中,两个属于Siphoviridae噬菌体和Tectiviridae家庭分离。实时PCR结果表明,细菌素和噬菌体减少的影响gtfs基因的表达。不同的方式在我们的研究中对细菌素的影响和噬菌体显示,他们都有很好的潜力,适当选择抗牙菌斑生物膜、和噬菌体显示更强的降低效果。
1。介绍
蛀牙是世界上的主要问题之一,始于牙菌斑的形成。后牙菌斑的形成,蛀牙是由把糖酸的口腔细菌,导致口腔疾病(1]。变形链球菌启动龋齿的主要病因学的因素,重要的毒力因子与龋齿的发病机制有关。GTFs的关键酶变形链球菌将蔗糖转化为粘性,细胞外多糖可以附着在牙齿表面,形成斑块。变形链球菌产生三个独立Gtfs合成水不溶物和可溶性葡聚糖(2]。GTFs的有效作用,吸收其他口腔细菌形成口腔生物膜。生物膜会导致不断增加的抗生素耐药性的细菌和宿主炎性细胞无法吞噬细胞生物膜(3]。生物方法是用来对抗牙菌斑生物膜。利用微生物来促进人类健康和控制致病菌有很长历史的4]。益生菌是一种有益的微生物能够产生细菌素。细菌素蛋白质化合物有抗菌性,防止敏感菌株的生长。这些蛋白质分子量较低,耐热,分为4组。有些细菌素是目前商业用来抑制病原菌的生长在鱼类等食品,乳制品和肉类产品(5]。另一种新方法用于战斗和控制细菌生物被膜是使用一个特定的噬菌体对细菌。噬菌体是一种攻击和杀死细菌的病毒(6]。这些病毒是特定于细菌和真核生物不能攻击。它们比细菌小大约50倍(20 - 200 nm)和无所不在。由于噬菌体的尺寸都很小,他们有一个相当大的能力穿透生物膜层(7]。噬菌体感染目标细菌细胞而不影响正常菌群和自然被根除细菌细胞(8]。很少有报告基因水平的细菌素的影响变形链球菌但没有任何研究噬菌体的影响,所以我们在这项研究旨在比较细菌素提取的影响和裂解性噬菌体生物膜相关的基因的表达变形链球菌。
2。材料和方法
2.1。隔离和确认变异链球菌
八十一份牙菌斑样本被牙医从患者龋齿称为德黑兰大学医学科学院的牙科诊所。嗨肉汤(默克公司、德国)和Mitis-Salivarius琼脂(QueLab、加拿大)被用来隔离变形链球菌。怀疑殖民地变形链球菌获得纯培养和生物型确认被过氧化氢酶等测试之后,碳水化合物发酵,尿素水解(9]。变形链球菌ATCC35866被视为积极的控制。
2.2。PCR鉴定分离变异链球菌基因
起初,DNA提取分离链球菌变形链球菌是紧随其后的是描述方法Hoshino et al。10]。纳米降设备(热)是用来测量获得的适当浓度的DNA。寡核苷酸引物序列和毒力基因的PCR扩增是显示在表中1。放大进行了热循环(peQlab)。介绍了PCR产品1%琼脂糖凝胶电泳。
2.3。隔离和益生菌的分子确认乳酸菌酵母和乳杆菌
传统的一百二十个样本准备牛奶、酸奶、泡菜和咸泡菜收集(30他们每个人)从2021年1月到2021年6月。隔离的乳酸菌菌株是由FDA协议使用浓缩汤夫人和太太琼脂培养。适当的生化测试被用于识别孤立的菌株。益生菌的潜在活动孤立的乳酸杆菌被酸和胆汁电阻测量。验证表型菌株被确定为乳酸菌,我们使用16 srdna基因测序的乳酸杆菌(27 f: CTCGTTGCGGGACTTAA 1522 r: GCAGCAGTAGGGAATCTTC)的PCR方法。执行一个分子反应,我们使用Antonsson等人合作协议做了一些调整。纯粹的文化乳酸菌隔离是夫人准备琼脂培养基和2到3殖民地被溶解在50μl (STE的解决方案。暂停是放置在ben-marie (96°C) 10分钟(沸腾的方法)。暂停在13000 RPM离心5分钟,和上层清液用于PCR (12]。
2.4。从益生菌细菌素的提取乳酸菌酵母和乳杆菌
为了提取的细菌素乳酸菌,这些细菌集中和部分由硫酸铵沉淀纯化。为此,经过培养的乳酸菌酵母和乳杆菌中和酸的影响,隔离细菌素产生的微生物质量被执行,然后与硫酸铵沉淀,降水集中。集中细菌素透析,其活性测定。sds - page技术和生物Rad设备(小凝胶)被用来评估提取细菌素的分子量(13]。
2.5。取样、分离和纯化噬菌体
我们使用提取裂解性噬菌体从我们之前的研究14),但简要描述如下。
提供了从德黑兰城市废水未经处理的污水,隔夜后,10毫升的未经处理的污水在6000 g离心10分钟4°C。0.22上层清液是通过一个过滤器μm。1毫升的过滤液体添加一个包含5毫升的BHI肉汤管变形链球菌(106 CFU /毫升)和孵化24 h在37°C。管于6000年再次离心10分钟g在4°C和上层清液透过0.22μm过滤器。双层方法(软琼脂)是用来证实噬菌体裂解性噬菌体的存在和次斑块出现为了净化噬菌体;板表面是由SM冲洗缓冲和转移到无菌管。空斑减少无菌和添加到管重复上述方法直到纯和的孤立斑块分开。SM缓冲甘油20%被用来保存噬菌体。宿主特异性、pH值和温度公差孤立的噬菌体也测量。最后,噬菌体形态,研究了利用TEM (14]。
2.6。实时定量rt - pcr
生物膜的制备细胞微量滴定板有无细菌素和噬菌体(3)复制RNA提取是根据高纯RNA RNA抽提过程罗氏公司(德国)的隔离设备。互补脱氧核糖核酸合成的装备(热科学恢复援助),提取的RNA是转换为互补。实时PCR反应(2μl cDNA、1μl两个正向和反向引物,7.5μl SYBR绿色PCR反应混合液,5.5μl DEPC Rotor-Gene水)进行问(Qiagene - 6000)仪器和SYBR绿色PCR反应混合液(Qiagene)。16 srdna基因作为看家基因。
3所示。结果
隔离的变形链球菌81年,牙菌斑样本,32例(39.5%)有积极的结果。分子分析gtfD gtfB, gtfC基因变形链球菌显示所有隔离gtfD基因。研究基因的频率如下:gtfB17(53/12%)和gtfC19(53/37%)(数据1(一)- - - - - -1 (c))。120个样本的牛奶、酸奶、泡菜,和咸泡菜从不同的地区在德黑兰,153的隔离乳酸菌得到和证实了测序16 srdna(图1 (d))基因。18(11/76%)菌株包括4 (22/22%)乳杆菌和3 (16/66%)乳酸菌酵母益生菌的潜在活动。最孤立的乳酸杆菌从牛奶67 (43/79%)。
(一)
(b)
(c)
(d)
结果细菌素的提取和部分纯化的益生菌菌株乳酸菌酵母和乳杆菌如图2。两种益生菌的分离乳酸菌酵母和一个孤立的乳杆菌有可能产生细菌素。细菌素隔绝乳酸菌酵母60的分子量和58 kDa,分别和细菌素孤立乳杆菌有一个70 kDa分子量。
实时的结果表明,在噬菌体的存在,使用基因的表达高度降低。图垫prism9软件被用于统计分析的数据。由于数据的常态,ANOVA-one方式测试选择比较的手段( )(图3)。
(一)
(b)
(c)
4所示。结论
口腔环境是一个庞大而多样化的避难所的细菌微生物的数量被认为是植物。有超过700种细菌在口腔的40种属于引起龋齿。变形链球菌被认为是最重要的病因之一,蛀牙(15]。在这项研究中,32例(39.5%)变形链球菌是孤立的。龋齿和有显著关系变形链球菌( )。各种研究已经表现之间的关系变形链球菌和蛀牙指数,特别是在伊朗和国外学龄前儿童。七巧板等人的研究结果。16),Bezerra et al。17),Babaeekhu et al。18],Bashirian et al。19)表明,变形链球菌是龋齿的主要病原体和频率的细菌比其他口腔链球菌在许多情况下,尤其是在7岁以下的儿童。在这项研究中,所有的隔离控制变异链球菌特殊技能gtfD(图1(一)),因为它是特定的链球菌变形链球菌。Gharakhani 2019年通过研究61年牙菌斑样本与不同年龄的人报道19隔离与gtfB基因(41.7%),8例(4.1%)与gtfC基因(20.]。然而,gtfS基因表达之间的关系和项目的数量产生不同的临床孤立变形链球菌。在正常情况下,各种酶的存在会影响生物膜形成相关基因的表达和活动变形链球菌。
乳酸杆菌是一个杂合的乳酸菌和尤其重要,因为对改善健康的重要性,比如防止殖民的肠道致病菌和生产代谢产物能够抑制病原菌的生长(21]。乳酸杆菌也见于多种发酵食品。细菌素是实验室的主要代谢物的细菌之一,商业生产和在食品工业中用作食品防腐剂(22]。探讨细菌素对gtf基因的表达水平的影响,首先我们孤立乳酸菌酵母和乳杆菌从120年传统食物(牛奶、酸奶、泡菜和咸泡菜),通常是常见的食品消费的人。
的120个样本,153的隔离乳酸菌了,其中三个隔离乳酸菌酵母和四个隔离被检测到乳杆菌通过益生菌潜在的活动。
在伊朗SoltanDallal泡菜和咸泡菜(23Yu),在中国从传统的四川泡菜(24在越南,阮从传统发酵蔬菜(25在伊朗,Parsaeimehr从传统酸奶(26],Yeshambel从牛奶和奶制品27),隔离大量的益生菌,其中大部分是属于实验室。由于文化的差异,地理,和植物,益生菌菌株的频率绝对是不同,但所有的数据引用其中的有益影响致病菌的抑制和打击。在当前的研究中,我们分离两个细菌素乳酸菌酵母分子量的60和58 kDa,分别和细菌素孤立乳杆菌有一个70 kDa的分子量。2013年Adebayo提取细菌素分子量70 kDa乳酸菌酵母通过硫酸铵沉淀,透析28]。唱2013年观察到的78 kDa提取细菌素乳酸菌酵母通过sds - page方法。乳杆菌在春研究3.5 kDa和4.7 kDa分子量Tris-Tricine sds - page方法(29日]。由于本机的菌株的差异和差异产生细菌素的能力,细菌素的分子量之间的差别当然似乎是正常的。
噬菌体疗法被认为是一种可行的替代治疗和控制致病菌的30.]。在这项研究中,我们测试了两个提取噬菌体的能力从我们之前的研究(提取噬菌体属于Siphoviridae和Tectiviridae家族的病毒)(14)减少的表达基因首次参与生物膜。同时,我们努力调查gtfD孤立的细菌素和噬菌体的影响,同时gtfB, gtfC基因表达水平。我们的研究结果表明,裂解性噬菌体和细菌素相比有很强的抑制作用在减少基因的表达在这项研究中使用。细菌素的总效应和噬菌体在一起,与单独使用细菌素的效果相比,在接下来的订单减少的效果。在孤立的细菌素,细菌素的提取乳酸菌酵母1有更多的削减效应相比,另外两个细菌素。在2011年Tahmourespour之前(31日2017年),统治(322014年],艾哈迈德(152017年,Wasfi [33]显示孤立的益生菌乳酸杆菌的减少效果等乳酸菌酵母,乳杆菌,嗜酸乳杆菌,干酪乳杆菌gtfs基因在变形链球菌这是按照我们当前研究的结果,表明细菌素小抗菌肽是益生菌的最重要的一个要素在对抗病原体,特别是吗变形链球菌。然而,没有另一个研究噬菌体的影响在减少相关的基因的表达变形链球菌生物膜研究的隔离变形链球菌裂解性噬菌体在其生物膜的形成及其抑制作用非常有限,而结果讨论部分中提到我们的先前的研究。然而,结果显示一个非常有效的噬菌体的生长抑制作用和抑制作用变形链球菌生物膜。
尽管许多医疗和牙科行业的进步,蛀牙仍然是一个主要问题。我们的研究结果和其他先前的研究表明,传统食品可以被视为良好的益生菌生物来源。适当的益生菌菌株的选择可以选择最有效的方法之一来对抗生物膜,减少牙菌斑的形成。噬菌体疗法是另一种解决问题的方式对抗生素耐药性和抗生物膜的形成,帮助治疗和杀死所需的细菌和更有效的降低生物膜与合成抗生素抗菌素治疗。根据获得的结果,他们在未来可以作为组件的口腔健康产业。
数据可用性
支持本研究使用的数据都包含在论文发表。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Zahra Rajabi和Rouha Kermanshahi负责研究和设计概念。萨拉Rajabi Rouha Kermanshahi,默罕默德·迈赫迪Soltan的宽干谷是负责数据采集。Mohammad Reza Afradi和Donya Alinejad准备样品。Zahra Rajabi,尤瑟夫Erfani Reza Ranjbar分析和解释数据。Zahra Rajabi和Reza Ranjbar起草了手稿。最后,本文由Reza Ranjbar修订。
确认
作者要感谢学院联合德黑兰大学医学科学院的医学科学,给我们这个机会,我们实验室的研究项目。我们还要感谢指导和建议的临床研究开发单位Baqiyatallah医院,德黑兰,伊朗。