文摘
背景。先天免疫的基本组成部分是由皮肤作为急救免受感染。皮肤的上皮屏障、呼吸道和眼睛直接接触与外部环境增加感染的概率。投机取巧的病原体铜绿假单胞菌引起各种感染免疫功能不全的主机。此外,三分之一的铜绿假单胞菌临床分离耐抗生素三个或更多。最近,很多研究人员专注于嗜盐的微生物由于负担得起的新颖的生物分子。这些生物分子之一,是金属纳米粒子。基于表现出对各种微生物的抗菌功能。在基于SeNPs是最广泛的研究。在这项研究中,嗜盐细菌从太阳能盐场是SeNPs用于生物合成的。目的。本研究旨在评估SeNPs的抗菌特性由嗜盐的合成微生物。结果。NPs是合成了Halomonas eurihalina细胞。产生SeNPs被确定通过各种化验如紫外可见光谱、XRD、DLS,红外光谱,扫描电镜。紫外可见光谱法证实SeNPs的存在。此外,SeNPs的平均粒径为260 nm。红外光谱证实了覆盖剂的存在抑制SeNPs的聚合。同时,合成硒纳米粒子有一个自然的水晶由XRD进行验证。扫描电镜也显示出了球形。此外,SeNPs代表重要的抗菌活性铜绿假单胞菌。结论。根据所得结果,biosynthesized SeNPs证明显著的特征,使其盈利nonantibiotics也减少组织感染相关的发病率和死亡率。
1。介绍
铜绿假单胞菌革兰氏阴性细菌中发现不同的自然栖息地,因为他们可以适应不同的环境。由于快速适应的能力,他们被确定为机会致病菌(1,2]。投机取巧的病原体铜绿假单胞菌引起各种感染免疫功能不全的主机。最重要的有关软组织感染,如燃烧和慢性伤口(3]。先天免疫的基本组成部分是由皮肤作为急救免受感染。激活细胞和体液免疫反应4]。证据表明,铜绿假单胞菌导致上皮损伤(上皮完整性变化的证据铜绿假单胞菌)。此外,它削弱了postinjury上皮修复机制(上皮修复损伤的证据铜绿假单胞菌)。事实上,未感染上皮细胞可以建立一个组织过程的复杂机制恢复postinjury上皮完整性和功能。与此同时,上皮组织的能力充分修复受到约束的存在铜绿假单胞菌导致器官功能改变和持续感染。几项研究已经提出的证据的负面影响铜绿假单胞菌世界上对修复过程和上皮完整性。在这些研究中,不同物种,病态,上皮细胞和器官进行调查。因此,有效维持上皮完整性postinjury修复机制是至关重要的。然而,这些可以恢复上皮完整性不足,治疗过程非常在传染病的情况下。自铜绿假单胞菌皮肤和角膜感染主要引起残疾,住院,世界上和死亡率,他们吸引了特别的关注5]。细菌通常包含在皮肤感染是P。绿脓杆菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,不动杆菌spp。大肠杆菌,coagulase-negative葡萄球菌等葡萄球菌lugdunensis和葡萄球菌epidermidis(4]。不同的器官感染铜绿假单胞菌皮肤、眼睛、耳朵、心脏,软组织,血,或关节和骨骼和呼吸道,消化道,泌尿系统,以及中枢神经系统。皮肤的上皮屏障、呼吸道和眼睛直接接触与外部环境增加感染的概率。因此,角膜、皮肤、肺泡和呼吸道感染应该关心他们的患病率。大多数情况下,皮肤上皮的P。绿脓杆菌伤后感染的发生。因此,慢性皮肤创伤和烧伤患者,患者糖尿病的常见并发症,主要是在更高的风险铜绿假单胞菌感染(1,5]。此外,三分之一的铜绿假单胞菌临床分离耐三个或更多的抗生素,包括第三代头孢菌素和imipenem,抗生素治疗的黄金标准铜绿假单胞菌感染(6,7]。
纳米技术集中在分子和原子技术的就业安排材料在纳米尺度的物理、化学和生物性质(8]。纳米技术已经广泛的应用,如食品、电子、医药、燃料、化学品、聚合物,和环境卫生9]。纳米粒子构成高反应活性由于表面高,体积小,和表面化学10,11]。此外,由于显著的抗菌效果和低毒性对人类细胞的金属纳米粒子(基于)银(Ag)、铈(Ce)、铁(Fe)、硒(Se)、硅(Si)、钛(Ti)和锌(锌),他们吸引了特别关注11- - - - - -13]。同时,基于表现出抗菌功能对各种微生物(11,13]。在基于SeNPs是最广泛的研究14]。Se获得特殊的宫殿在医学领域(15]。Se纳入一些酶,如谷胱甘肽的结构氧化物酶(GPx) iodothyronine deiodinases,和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)扮演的角色在这个过程中抗氧化作用、解毒和代谢8,15- - - - - -17]。等各种形式的硒oxyanions硒化(SeII),亚硒酸盐(SeIV),或硒酸(SeVI)毒性动物以及人类细胞系而硒(SeO)的基本形式在生物浓度(< 400µg /毫升)没有毒性。在有机硒的存在形式也像硒代半胱氨酸(Secys)和硒代蛋氨酸硒酸(Semet)或无机形式包括 ,硒化(Se2−亚硒酸),(18]。SeNPs证明显著的抗菌活性白色念珠菌(19),变形链球菌(20.),金黄色葡萄球菌(21,22]。此外,SeNPs的生物学特性,包括抗菌、抗病毒和抗氧化活性,具有低毒性对人类细胞在纳米技术方面的研究提出了一个区域(8,14]。
各种生化的方法已经被应用于合成SeNPs [16]。另一方面,NPs采用微生物和植物的合成提供了新的,干净,安全,环保技术(8,10,17,23]。此外,biosynthesized NPs通常限制通过细胞代谢物相关的微生物(9,24]。
在水生环境中不同的细菌以及陆地、富硒或selenium-free土壤,有能力减少亚硒酸盐/硒酸oxyanions。由于工业和城市的不断引入冲模,嗜盐微生物面临有毒金属,包括Se导致持久有毒离子和改变他们枯萎少有毒或纳米粒子18,25,26]。尽管潜在的耐盐细菌还原亚硒酸或硒酸和其他阴离子在高盐浓度相对较少探究16),存在于这些严重的环境就像高盐浓度需要让他们典型的微生物细胞组件(9]。最近,很多研究人员专注于嗜盐的微生物由于承受新的生物分子(27]。因此,嗜盐的微生物有能力在生物技术的应用程序包括生物聚合物、水解酶、生物表面活性剂、生物燃料和生物修复(9]。因此,本研究旨在采用嗜盐菌株合成SeNPs并确定其抗菌性能铜绿假单胞菌。
2。材料和方法
2.1。材料
亚硒酸钠从西格玛奥德里奇购买。在这项研究中使用的所有其他化学物质的分析级。
2.2。隔离和表征的菌株
2.2.1。铜绿假单胞菌
在这项研究中,两种不同的菌株铜绿假单胞菌被使用。这些菌株铜绿假单胞菌写明ATCC 9027和铜绿假单胞菌与溃疡。菌株获得了德黑兰大学的分子识别。
PCR方法,引物9 f - 1541 r,及其序列表所示1。此外,通过NCBI数据库爆炸了。
2.3。嗜盐的细菌
2.3.1。隔离
嗜盐微生物Hoz-e Soltan隔绝区域是一个盐湖位于库姆,伊朗。此外,培养嗜盐的细菌,盐水(SW) 10%。
2.3.2。DNA提取
在第一阶段提取,去除一些殖民地,并将它添加到200μl (Tris-ethylene二胺四乙酸缓冲然后涡完全溶解。这个缓冲区的内容也导致DNA分离和作为螯合剂,导致墙的放松。在第二步中,20μl(1毫克/毫升添加溶菌酶和孵化37分钟37°C。溶菌酶分解细菌壁。第三步,100年μl 1% SDS的解决方案是添加和孵化器的加热30分钟在细胞壁溶解脂肪,消除它。在第四步中,添加100μl 5毫米的氯化钠,把解决方案在65°C 30分钟。盐分解DNA-bound蛋白质更容易。第五步,同样体积的氯仿溶液添加解决方案是离心机在11500 rpm 15分钟3层。单独的上层清液或顶层。三次执行第五步,第六步,异丙醇(冷异丙醇)被添加到解决方案和冷藏24小时。第七步,24小时后,离心机在11500 rpm 15分钟,然后取出上层清液。在第八步骤中,使用70%的乙醇,添加在每升200 - 300微米,溶解在乙醇使用吹,下一步,15分钟离心机在11500 rpm。在第十一步,丢弃局部解决方案,这是乙醇,免得乙醇仍在瓶。在最后一步中,200毫升的TE缓冲被用来存储中提取DNA。
2.3.3。聚合酶链反应
对DNA进行PCR提取瓶,我们添加的材料表2为了和地点在PCR机器。已经没有dna,这也是一个细胞瓶,我们测试作为一个消极的控制。使用的引物所需的序列也列在表中3。
2.3.4。16 srrna测序
样本被送到Pishgam公司以及16 srrna测序引物。测序后16 srrna基因的扩增片段,分离株与基因库中的其他序列在NCBI站点使用爆炸软件(28]。
2.3.5。系统发生的树
在本节中,所需的菌株具有类似的相似性是第一个获得。为此,序列由ChromasPro编辑软件是与序列在NCBI注册和EZTAXON数据库。所需的序列被保存在FASTA格式的系统发育树。在接下来的步骤中,系统发育分析所需的应变和相似的菌株使用Mega7执行软件。最大的流动性的方法也被用来画这个菌株的系统发育树。画树中的分支的有效性检查使用引导分析算法和采样1000次。
2.4。生物合成的SeNPs
2.4.1。细胞内的
细胞内合成,200毫升SW10%接种分离菌株和亚硒酸钠(5毫米的最终浓度)过滤是通过0.2微米过滤器。的混合是在40°C的环境中24小时。同时,未经变质处理的SW10%与亚硒酸钠用作控制(9]。
2.4.2。细胞外
对于这种方法,细菌在200毫升无菌SW10%首次接种培养基,然后在150 rpm 48小时在一个孵化器孵化瓶。在第二步中,接种培养基是离心20分钟,每分钟4000转,上层清液分离。获得的上层清液通过一个0.22微米过滤器,在下一步,5毫米过滤亚硒酸钠添加到它。混合物是放置在一个高压釜20分钟1大气压力在121°C (9]。
2.5。净化SeNPs
净化SeNPs,收获了细菌细胞在4000转离心20分钟。然后,裂解缓冲(SDS1%和溶菌酶)被添加到收获细胞。此外,该混合物用20分钟。1-Octanol添加到混合物和孵化一夜之间在4°C。通过氯仿沉积物被收集和清洗,绝对乙醇,乙醇70%,分别和蒸馏水(9]。
2.6。表征SeNPs
2.6.1。视觉观察
改变的黄色文化媒体通过视觉观察证实了代SeNPs [9]。
2.6.2。紫外可见光谱
SeNPs溶解在蒸馏水通过声波降解法(20分钟,110 W)。1毫升的分散NPs是添加到垂涎。然后,SeNPs 200至800海里的吸光度是岛津制作所指出的uv - 1601,也为空白,使用蒸馏水。此外,亚硒酸钠溶解在水中被用作控制(9]。
2.6.3。动态光散射(DLS)
1毫升的溶解在水中SeNPs被送到德黑兰大学中心实验室测量粒子的大小和分布与利用HORIBA。
2.6.4。x射线衍射(XRD)
这个试验确定晶体的形状SeNPs [9]。辐射源被记录的XRD方法(40 kV / 40 mA, 10°- 80°,步长为0.04秒)(29日]。
2.6.5。傅里叶变换红外光谱(FTIR)
识别功能化学组的外部区域SeNPs [9),这个试验。样品测试使用张量通过KBr 27粒方法如Nakamoto所述30.在400 - 4000厘米的范围−14厘米的决议−1(9]。
2.6.6。扫描电子显微镜
SeNPs是固定和稳定在2%的戊二醛2小时27°C,然后脱水,还涂上了黄金。通过MIRA3固定SeNPs观察确定SeNPs的形态特征(31日]。
2.7。抗菌活性
2.7.1。好扩散分析
两井培养基是由巴斯德吸管。然后,新文化的细菌是由无菌拭子。0.0932 gr SeNPs分散在500毫升水。100µ最终浓度是装载在一个井。第二,被认为是一个标准的好,100µ文化媒体没有细菌和SeNPs被添加。
2.7.2。抗生素敏感性
易感性的孤立和标准株抗生素包括克林霉素,Nitrocefin,磺胺嘧啶和甲氧苄氨嘧啶,Sulphamethoxazole /甲氧苄氨嘧啶、氨苄西林/ sulbactam Temocillin,青霉素、头孢他啶、两性霉素B、庆大霉素、环丙沙星、吡哌酸/ tazobactam、复方磺胺甲基异恶唑,阿米卡星,Imipenem,四环素,洁霉素评估通过磁盘扩散方法根据临床和实验室标准协会(CLSI)。执行这个实验中,一个新的文化的应变准备,抗生素磁盘添加到每个板块和孵化24小时30ºC。
3所示。结果
3.1。分离的菌株的特性
3.1.1。铜绿假单胞菌
显微观察代表革兰氏阴性杆菌形态的压力。此外,分子实验的结果提出了下表(表4)。
3.2。嗜盐的细菌
3.2.1之上。16 srrna测序
结果表明分离菌株显示98/30%相似Halomonas eurihalina。这是第一个报告SeNPs的生物合成h . eurihalina。此外,结果见表5。
3.2.2。系统发生的树
此外,序列,通过大型系统发生的树进行如图71。
3.2.3。生物合成的SeNPs
这嗜盐菌株能够产生SeNPs通过细胞内的方法。在接下来的部分,biosynthesized SeNPs准备进一步分析。
3.3。表征SeNPs
3.3.1。视觉观察
为代表的文化媒体红砖色的颜色过渡的形成SeNPs如图所示2。
3.3.2。紫外可见光谱
主要确认,紫外可见分光光度法。尖锐的吸收峰出现在275 nm,可能是与表面等离子体振动。但是,没有顶点是控制样品(见图3)。
3.3.3。动态光散射(DLS)
Biosynthesized NPs规模在200 - 400海里,而且,平均大小(Z-average) 260海里。此外,多分散性指数为0.2(图4)。
3.3.4。x射线衍射(XRD)
在图5,在2θ图的轴,5峰属于23.2°,29.5°,45.5°,55.5°,和59.8°对应(100),(101),(111),(113)和(202)。此外,该试验代表伟大的山峰都在整个频谱20到80不等。
3.3.5。傅里叶变换红外光谱(FTIR)
第一和第二高峰,626.21到681.88厘米−1,C-Cl相关债券振动。第三个峰值波长厘米−1865.61相关切断。第四峰波长厘米−1是996.92,另一个峰值波长厘米吗−11393.16由于碳氢键的存在。1637.60厘米−1波长对应于第六高峰是第一种希望由于羰基的存在酰胺债券的蛋白质。的波长2175.12厘米−1第七峰,是由于炔烃的振动(碳碳三键)。此外,第八峰波长为2917.78厘米−1与不对称拉伸振动的碳氢键组。最后相关峰值波长3237.12厘米−1可与地组。这些根抑制SeNPs的聚合,使他们更加稳定。所有的结果都显示在图6。
3.3.6。扫描电子显微镜
结果显示尺寸和粒子的分散也表明,生物合成的纳米粒子有球面(图7)。
3.3.7。良好的扩散
结果表明标准菌株的抑制区直径2.5厘米,2厘米应变与伤口。此外,结果已经在下图(图表示8)。
3.3.8。抗生素敏感性
基于对磁盘,菌株分为两组敏感和耐药。在这项研究中,孤立的伤口和尿收集菌株都对所有类型的抗生素磁盘。此外,呼吸菌株对阿米卡星敏感和吡哌酸/ tazobactam和其他抗生素产生抗药性,而且,对复方磺胺甲恶唑标准菌株是敏感,阿米卡星,Temocillin,吡哌酸/ tazobactam。表6演示结果。
4所示。讨论
在烧伤创面细菌感染的并发症是最高的挑战之一燃烧诊所。它可能会导致更严重的败血症等疾病。由耐药微生物的挑战是缺乏进一步升级的新抗菌素,尤其是antibiofilm代理治疗烧伤伤口感染。各种动物模型用于概括临床烧伤创面感染的特点和协助开发新抗菌治疗。猪、老鼠和老鼠是烧伤伤口感染的三个最常见的模型在活的有机体内。最好的代替人类皮肤是猪模型。然而,高成本和伦理问题阻碍他们的用法筛选图书馆庞大的抗菌素。老鼠出现的最高范围优势描述方面的主机对烧伤感染的反应,基因突变体。然而,他们往往局限于急性(少于48 h postinoculation)烧伤伤口感染快速出现败血症和死亡前,可能由于需要注入的更高的燃烧焦痂下细菌培养液诱导烧伤感染。制定生物聚合物矩阵中的病原体还包括驾驶感染更慢性biofilm-like状态(32]。
几项研究表明,细胞在伤口边缘受伤气道上皮细胞和裸露的基底膜更容易绑定铜绿假单胞菌。更具体地说,它已被证明铜绿假单胞菌奉行更频繁地将坏死细胞粘液和挤压/基底以及迁移与板状伪足扁平细胞。氨基酸基于传感器的趋化性和flagella-driven游泳的机制铜绿假单胞菌达到气道上皮细胞的细胞在伤口边缘。最后,纤连蛋白,asialoGM1,α5β1整合素可能调解铜绿假单胞菌绑定到气道上皮细胞(5]。
获得的结果显示分子的识别16 srrna序列,获得的菌株98/30%h . eurihalina,这是独立于卢特荒漠,也biosynthesize硒纳米颗粒细胞的能力。
证实纳米颗粒的合成,首先定性地通过改变培养基的颜色从黄色到红色砖的颜色,这是由于亚硒酸转换成硒元素,随着时间的推移,亚硒酸钠培养基的改变颜色为红色(15,23]。这表明元素硒亚硒酸的减少,同时,创建独特的红色表明硒纳米颗粒的表面等离子体激元的共振。略,最大光吸收250海里。在穆罕默德Amoozgar博士和他的同事们进行的一项研究,硒纳米颗粒的光吸收紫外吸收法是294海里(18]。在另一篇论文,一群科学家合成硒纳米粒子由微生物分离的不同部分沙特阿拉伯,与所选菌株有吸收峰290海里的33]。2015年另一个实验进行硒的合成纳米颗粒的细菌Ralstonia eutropha。这个合成纳米颗粒的吸收峰在270 nm (34]。各种研究证明合成硒纳米粒子的共振峰在200 - 300海里。然而,这种吸收峰还取决于各种因素如颗粒大小、形状、材料组成、孤立的环境所需的应变(35]。此外,还有大量的研究硒纳米颗粒的形成,这表明不同的吸收峰的存在硒纳米粒(36]。
生物合成的纳米颗粒的大小来衡量DLS测试在这个实验中平均为260纳米,而振幅紫外可见吸收峰的测试也证明了分散的纳米颗粒的大小。此外,分散指数或π是0.2。在另一项实验中,斯利瓦斯塔瓦等人对硒的合成纳米颗粒的细菌,平均粒径为70.9 nm (34]。另一个实验中合成硒纳米粒子从细菌的来源表明,170 - 160 nm大小(37]。已经证明散射指数小于0.5时,纳米颗粒稳定性高和纳米粒子聚合速率较低38]。
此外,研究表明,硒纳米粒子合成了细菌涂布等各种生物分子或大分子蛋白质和多糖。事实上,减少金属盐对金属纳米粒子可能是由于碳水化合物和蛋白质。红外光谱分析可以提供有用的半定量的结果与生物化合物纳米涂料层的存在及其相关内容的官能团的振动(蛋白质和碳水化合物)的纳米颗粒39]。测试结果证明蛋白质和多糖的存在。
根据XRD实验的结果,合成硒纳米粒子有一种天然的水晶性质。在另一项研究中,XRD结果表明,合成硒纳米晶体,这是一个自然的形式(40]。然而,在其他的实验,结果表明,合成硒纳米粒子没有任何特定的晶体结构,和无效等位基因被认为(28,41]。
此外,基于SEM测试结果,合成纳米颗粒分散在大小。这种分散可能是由于纳米颗粒的累积。同时,基于形态学结果所示,可以看出获得粒子有一个球面。在2018年的一组研究人员进行的一项实验,合成硒纳米粒子也有一个球形28,41]。2016年,SEM分析的结果也表明,生物合成SeNPs铜绿假单胞菌有一个球面(42]。
5。结论
关于各种分析的结果,得出的结论是由嗜盐细菌生物合成SeNPs表示合适的特征具有抗菌特性对最常见的致病菌。因此,得出生物合成SeNPs可以被看作是一个候选人对传统抗生素减少使用抗生素的副作用,也增加了治疗的效率。另一方面,进一步分析和体内测试需求找出这些NPs用人的各个方面。
数据可用性
期间产生的所有数据或分析本研究包括在发表的这篇文章,同时,分析了数据集来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。