文摘

客观的。调查我的协同效应κBα超表达和聚(lactic-co-glycolic酸)姜黄素纳米粒(PLGA-Cur-NPs)在前列腺癌(PC)和揭示合作姜黄素引起的敏化作用的潜在机制。方法。增殖和凋亡率κBα过表达和PLGA-Cur-NPs-treated PC细胞检测到麻省理工和流式细胞术分析。我的表达水平κBα、apoptosis-related和信号蛋白免疫印迹试验测定。结果。PC细胞增殖显著抑制过度的我κBα。PC细胞的细胞凋亡率显著增加在高浓度的姜黄素,同时激活NF -κB途径明显抑制。此外,PLGA-Cur-NPs治疗增效和我κBα超表达增强的PC细胞的凋亡抑制NF -κB途径激活。结论。我κBα超表达协同PLGA-Cur-NPs可以明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,并抑制NF -的激活κB通路在PC细胞。这些发现可能提供一个实验的基础上建立肿瘤基因治疗结合中药治疗,从而促进肿瘤基因治疗的临床应用和抗肿瘤中药。

1。介绍

到目前为止,前列腺癌(PC)的发病率逐渐增加。值得注意的是,先进的电脑的临床治疗面临的挑战是在PC雄激素抵抗细胞,这将导致损失的抗雄激素治疗。因此,它是非常迫切需要开发新的治疗方法(1- - - - - -3]。阳离子聚lactic-co-glycolic酸纳米颗粒(PLGA-NPs)是一种新粒子涂有阳离子型表面活性剂和调和剂基因纳米颗粒。多个研究表明阳离子PLGA-NP载体在基因方面的优势,核酸保护,转染效率,和目标基因的表达。作为一种新型的药物载体,PLGA-NPs可以提高药物的水溶性和控制药物释放速率通过封装药物,提高药物的生物利用度,减少药品不良反应(4- - - - - -8]。PLGA-NPs被批准作为载体携带药物对人类实验研究由于其生物降解,无毒性。

核转录因子(核转录因子κB、NF -κB)证明中发挥重要作用,在许多人类肿瘤的发生和发展,包括PC, PC细胞的凋亡的过程和参与(9,10]。寻找一个方法来抑制NF -κB激活可能是电脑的有效治疗。在大多数的细胞,NF -κB具体结合的家庭成员我抑制蛋白κBα(NF -的抑制剂κB),主要存在于细胞质中作为一个不活跃的复杂(11]。鉴于前面我36的N末端氨基酸κBα只有我参与调解κBα降解而非功能要求区域(12),在我36 n端氨基酸的损失κBα仍然保留的功能抑制NF -κB没有退化。因此,我的超表达κBα可以用来抑制NF -目标κB。

姜黄素(坏蛋)的中医疗法在肿瘤发生和发展的不同阶段(初始、晋升和演进)吸引了注意力。之前的研究表明,坏蛋可以直接杀死PC细胞和正常细胞无毒。然而,不溶性成水,容易氧化代谢,频繁的政府,和体内生物利用度低限制了临床应用的坏蛋。因此,在本研究中,我们构建了PLGA-Cur-NPs和验证自己的效应和协同效应与我κBα超表达在PC细胞体外,从而揭示PC治疗可能的治疗策略。

2。方法和材料

2.1。PLGA-Cur-NPs合成

乙醇提取,石油醚脱脂的硅胶柱层析法,坏蛋复杂[坏蛋我(0.1%)、铜二世(0.1%),和坏蛋三世(99%)]活性单体提取和分离。在接下来的实验中,单体是用来构造PLGA-Cur-NPs Cur三世活跃。nanoprecipitation Cur-NPs的脂质体合成的方法。简而言之,我们重处方量(10毫克/毫升)的大豆卵磷脂和Cur-NPs准确(_{soybeanlecithin}:_{curcumin-nano}= 10:1)和溶解在甲醇作为有机相。此外,我们重辅助稳定剂的处方量(1%)(188年泊咯沙姆)准确、水相溶解在水中。有机相的体积比的水相是1:10。磁力搅拌下以一定的速度(1000转/分钟),有机相是掉进冰浴的水相(0 - 2°C)以恒定速率(5毫升/分钟)通过使用显微镜下注射泵。添加了有机相后,准备被转移到室温(25°C)和搅拌挥发有机溶剂准备Cur-NPs脂质体。Cur-NPs稳定的脂质体通过使用高效液相色谱法测定。封装效率(%)和加载的效率(%)Cur-NPs脂质体为90.36±1.37%和3.82±0.07%,分别。聚乳酸/羟基乙酸(PLGA, LA: GA = 75: 25日10 kDa)从勃林格殷格翰集团购买。纳米颗粒的表面电荷测试下Zetasizer NanoZS仪器(英国莫尔文有限公司)。PLGA溶解,注入DSPEmPEG2000乳化剂,大功率超声发生器和严格乳化。

2.2。向量构造

PC细胞系LNCaP购买从写明ATCC(美国式的文化集合)。在rpmi - 1640细胞培养介质(Gibco)含15%胎牛血清(的边后卫)5%的股份有限公司₂在湿润孵化器。向量的DNA与我κBα基因是由four-plasmid磷酸钙瞬时转染方法如前所[13]。剩余质粒DNA后丢弃处理Benzonase (Novagen、圣地亚哥、钙、美国)。后的细胞被播种到6-well板的密度5×10⁵细胞/好,我κBα超表达载体(我κBαoe)或Blank-vector(负控制、数控)与绿色荧光蛋白(GFP)转染细胞系LNCaP。GFP表达96 h后评估使用荧光显微镜(奥林巴斯IX71)。

2.3。MTT试验

nanocurcumin在不同浓度的细胞毒性试验是通过MTT试验检查。1×10⁵每口井的细胞培养在96孔板为24小时37°C。随后,5μ克/毫升的MTT添加到每个细胞,这些细胞被培养为4 h。100年之后,μL DMSO(北京Solarbio科技有限公司)是补充道。每个孔的吸光度检测的微型板块bio-reader(北京Potenov科技有限公司)在波长560纳米。

2.4。流式细胞术

流式细胞术对细胞凋亡测定FC500 MPL系统上执行(贝克曼库尔特)使用膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测设备(Solarbio,北京)。细胞接种在12-well板的密度2×10⁴细胞每对72 h。细胞被离心机和resuspended膜联蛋白V绑定缓冲,这些细胞被沾膜联蛋白V-PI(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)在室温下15分钟。与500年resuspended后μl (PBS,至少1×10⁴细胞用流式细胞分析仪进行测试。FlowJo软件进行数据分析。

2.5。免疫印迹

总蛋白质从细胞中提取使用里帕蛋白质溶解产物。接下来,蛋白质浓度由BCA检测化验设备(Beyotime,中国)。蛋白质样品(30μg) 12% sds - page分离和转移到PVDF膜。这些蛋白质膜被封锁在室温下以5%脱脂奶粉1 h和孵化主要抗体κBα(1:1000;ab126605;Abcam), Bcl-xl (1: 20000;ab178844;Abcam)、bcl - 2 (1: 1000;ab32124;Abcam), NF -κB p65 (1: 1000;ab32536;Abcam), LamB1 (1: 1000;ab108536;Abcam), GAPDH (1: 5000;ab9485;Abcam),β肌动蛋白(1:2000;ab8227;一夜之间Abcam)在4°C。然后,膜与辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体(1:3000;ab6877;Abcam)在室温下2 h。墨迹与TBST洗3次,乐队是可视化使用ECL工具包(美国Billerica的微孔,MA)和蛋白质分析了灰度值图像J软件(国家卫生研究院博士)。

2.6。Caspase-3比色测定

Caspase-3活动检测到凋亡Capase-3比色测定试剂盒(MBL)严格按照制造商的说明。简而言之,对数期的细胞与胰蛋白酶消化,在1000 g离心5分钟,然后resuspended细胞溶解产物。细胞的上清液与DEVD-p-NA孵化基质(最终浓度,200µM)在室温下1 h。一个自动标(分子设备)测量了细胞在400纳米波长的吸光度,以反映Caspase-3活动。

2.7。统计分析

所有数据都表示为平均数±标准差。借助SPSS13.0统计软件进行分析的数据统计软件SPSS Inc .)、芝加哥,美国)。单向方差分析(ANOVA)是用来比较多个组的样本均值。学生的t以及或成对的学生的t以及进行比较两组的样本均值。P< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。验证PLGA-Cur-NPs准备和向量

在图1(一)高效液相色谱法测定显示,坏蛋复杂的提取和分离活性单体。PLGA-Cur-NPs被显示在图的特点1 (b)和1 (c)。

3.2。向量验证和PLAG-Cur-NPs在PC细胞增殖的影响

如图2(一个),GFP转染PC细胞检测,表明载体的转染效率。免疫印迹试验的结果表明,与我转染κBα超表达载体能显著增加我的蛋白表达κBα相比,NC组(图2 (b), )。在图2 (c),超表达的我κBα显著抑制细胞增殖时间的方式( )。

3.3。PLAG-Cur-NPs的影响在PC细胞增殖和NF-kB信号

图3(一个)显示PLAG-Cur-NPs剂量依赖性地抑制细胞增殖( )。免疫印迹结果表明PLAG-Cur-NPs治疗我的蛋白质含量显著提高κBα和减少的水平P65(图3 (b))。

3.4。PC细胞的凋亡和NF-kB信号后PLAG-Cur-NPs治疗

在图4(一),PLAG-Cur-NPs治疗显著诱导细胞凋亡( )。免疫印迹结果表明PLAG-Cur-NPs我的治疗增加蛋白质含量κBα和减少的水平P65、Bcl-xL和bcl - 2(图4 (b))。Caspase-3活动PLAG-Cur-NPs-treated细胞显著调节(图4 (c), )。这些结果表明,PLAG-Cur-NPs诱导PC细胞的凋亡。

3.5。我的协同效应κBαoe和PLAG-Cur-NPs

确定我是否κBα超表达可以诱导细胞凋亡与PLAG-Cur-NPs共同作用,PC细胞转染和我κBαoe或数控向量。在图5(一个),PLAG-Cur-NPs治疗可以显著抑制NF -的激活κB信号通路,减少凋亡bcl - 2蛋白的水平,增加了在PC细胞凋亡蛋白Bcl-xL。此外,当PC细胞过表达我κBα与此同时,那些PLAG-Cur-NPs治疗效果更加明显。MTT测定显示,增殖的抑制率升高co-treated和我κBαoe向量和PLAG-Cur-NPs集团相比数控+ PLAG-Cur-NPs组(图5 (b), )。在图5 (c),在PC细胞凋亡率的结果符合Bcl-xL的变化( )。

4所示。讨论

由于缺乏理想的肿瘤抑制基因和转基因向量,肿瘤抑制的影响在PC细胞的增生不明显。目标基因的转染效率不满意,这使得它无法引入相应的靶基因肿瘤细胞,从而限制了基因疗法的疗效。阳离子PLGA纳米粒是一种新型的gene-carrying纳米颗粒可以改善基因嵌入率和细胞转染率通过电荷吸引和积极的修改7,8]。此外,PLGA-NPs有助于药物输送到肿瘤部位,体积小和优秀的释放效率。基于以上研究,我们调查的影响PLGA-Cur-NPs在PC细胞,有可靠的生物毒性(可以看到我们实验的流程图如图6)。

核转录因子(核转录因子κB、NF -κB)中扮演一个重要的角色在个人电脑的过程,参与PC细胞的凋亡效应。NF -κB被认为是肿瘤治疗的目标,我绑定κBα将增强释放NF -κB从DNA网站(14- - - - - -18]。因此,我κBα可能的标志NF -κ通过控制保留NF - B通路κB (19]。以前的研究已经表明NF -的激活κB可能刺激PC细胞的分裂和增殖20.]。此外,金兹堡等人报道,抑制NF -κB活性降低PC细胞的入侵能力(21]。因此,我们选择了我κBα的抑制剂NF -κB为研究调节电脑的发展的目标。近年来,中药已广泛应用于治疗各种肿瘤,包括电脑,由于其温和的疗效和减少不良反应。Yallapu等人已经开发出一种新型Cur药物输送系统(22),表明PLGA-Cur-NPs表现出优良的抗癌活性在电脑23]。因此,我们怀疑Cur可以抑制PC细胞的增殖,促进我的表达κBα在PC细胞,诱导细胞凋亡。在我们的研究中,我们发现PLGA-Cur-NPs治疗可以抑制PC细胞增殖剂量依赖性的方式。此外,我κBαoe也可以抑制PC细胞的增殖。当PC细胞被co-treated与我κBαoe和PLGA-Cur-NPs,细胞增殖抑制更加明显。我的协同效应κBαoe和PLGA-Cur-NPs细胞凋亡与细胞增殖是一致的。

众所周知,NF -κB /我κBα在氧化应激激活反应(24]。最近的一项研究表明,IκBαOE促进了对顺铂的敏感性nonsmall细胞肺癌治疗(25]。在我们的研究中,我们发现PLGA-Cur-NPs治疗或加上我κBαoe可以抑制NF -的激活κB信号通路通过减少P65蛋白水平和提高我的水平κBα,这表明我κBαoe或PLGA-Cur-NPs治疗可能在PC促进药物的敏感性。

总之,过度的我κBα可以在PC细胞抑制增殖和诱导细胞凋亡。纳米载体是一种新的基因载体系统由于其anti-tumorigenicity,基因转移效率高,延长时间,慢的降解。NPs与其他载体系统有无可比拟的优势,将为基因治疗提供一个新的交付系统。鉴于此,本研究建议PLGA-Cur-NPs协同与我κBα希望oe在PC细胞是肿瘤治疗的临床应用。然而,在未来仍需要进一步的研究。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突声明。

确认

这项工作是由上海交通大学“医疗工程交叉基金”项目(YG2015MS13)。