一个3 d成骨细胞在体外生物医学材料评价模型

摘要

用于骨治疗的生物医学材料通常采用动物模型进行生物相容性和安全性评估在体外单层细胞培养试验。然而,替代在体外模型可以提供更接近生理反应的受控条件，减少动物试验。在这项工作中，我们开发了一种三维球形细胞培养，具有同时评估物质-细胞和细胞-细胞相互作用的潜力。采用不同细胞密度的小鼠MC3T3-E1前成骨细胞和人原代成骨细胞(HOb)，确定理想的球囊培养方法及其对材料试验的适用性。将细胞接种于96孔琼脂涂布板上，搅拌培养1 ~ 7天。考虑到球体的形状、大小、重复性、处理和稳定性，对骨料形态进行了定性评价。细胞密度越高，产生的球体越稳定，从2 × 10开始处理是合适的⁴细胞。共聚焦显微镜和扫描电镜显示，聚集核心内的大多数细胞是存活的。暴露于阳性对照显示了剂量依赖的细胞死亡，通过XTT测定。在金属和聚合物基生物材料的标准化测试中，聚集体稳定且具有良好的生存能力。因此，成骨细胞球体可能为材料筛选和生物相容性检测提供一种有前景的工具。

1.介绍

目前，有许多产品和工艺与人体组织直接或间接接触，可能对使用者的健康产生影响。在生物材料和移植医疗/牙科设备的情况下，这种风险通常会增加，并可能延伸到保健专业人员和最终用户(患者)[1］．与人体组织有亲密和长期接触的材料包括用于退行性疾病和骨科或颌面骨创伤治疗的材料，这些材料往往需要通过复杂的过程来保存或恢复组织功能，而这些过程面临着对骨替代材料的需求[2］．在这方面，有必要确定适当的方法，以评估旨在生物工程和医疗/牙科生物材料开发的生物技术产品和工艺的质量[3.］．此外，评估生物材料生物相容性的重要性得到了特别国际标准(如ISO 10993-1:2009)的发展和发布的强调。[4］．

在这种背景下,在体外用于评价材料生物相容性的试验，可通过细胞毒性、遗传毒性、和免疫原性5］．然而,在体外材料的生物相容性评价经常是有争议的，因为有无数可用的分析方法，其适用性在很大程度上取决于被评估材料的特性[6］．

二维单分子细胞模型无疑对细胞生理学的理解和基础科学的进步，以及对新型生物相容性材料的测试和筛选带来了重大贡献[7］．然而，这种模型在预测组织反应方面有固有的局限性，因为即使在共培养中，细胞-细胞之间的相互作用也会因其二维细胞分布而受损，这与活组织中的细胞相互作用只有轻微的相关性[8］．这些限制导致三维培养模型(3D)的发展，可以更好地模拟三维组织中的微环境，包括细胞间液中溶解因子的细胞通信，细胞-细胞和细胞-细胞外基质之间的粘附，或组织核心层的机械应力机制[9］．自20世纪70年代以来，三维模型被用于癌症研究，帮助识别细胞培养中的不同环境和导致的细胞生理变化[10，11］．由这些细胞形成的团簇呈现球形形态，被称为多细胞球体[12］．从那时起，球状细胞模型被研究和开发用于多种应用，包括骨治疗和材料测试[13- - - - - -16］．

医疗和牙科用材料评价国际标准(ISO 10993-1:2009;ASTM)推荐使用公认的生物相容性(阴性对照)或众所周知的细胞毒性(细胞毒性阳性对照)的对照材料[17］．此外，ISO 10993-5:2009推荐使用[18在细胞生长的后期进行检测，达到大约80%的汇合。这些标准所推荐的用于确定生物医学材料的细胞毒性的参数可分为以下几类:(i)确定形态变化，通常与细胞粘附、细胞溶解或对膜完整性的影响有关，或(ii)评估对细胞生长、细胞损伤和特定细胞代谢的影响(通过分析细胞数量、总蛋白、减少和重要染料的摄取)[18］．

然而,三维模型基于细胞球状体不容易被这些标准适合的建议,因为他们的细胞形态不允许融合的分析,不知道是否这些模型使染料均匀分布或其洗脱整个细胞的屏障,传统测试可能会低估或高估毒性。此外，文献缺乏对这些模型的详细描述，包括易于操作、一致性和结果重复性等参数，以确保这种新方法作为医疗材料临床成功的标准化预测工具的有效性。因此，在这项初步工作中，我们的目标是发展一个在体外三维球形成骨细胞模型用于评价骨治疗材料的生物学特性，确保其更好的疗效和安全性，采用的条件更接近于材料的实际生理暴露。

2.材料和方法

2．1．材料

在本研究中，我们使用了临床广泛使用和公认的细胞相容性或细胞毒性的材料，以规范和验证球体的使用。作为阴性、生物相容性对照的代表，我们采用光滑表面加工的钛(SIN植入物，巴西)和高密度聚苯乙烯珠(INT，巴西)。商业上获得的琥珀乳胶管被用作阳性对照，因为它们以增加细胞毒性而闻名[17］．

2．2.细胞培养

为了研究球状细胞培养的充分性与不同的细胞模型,我们采用细胞的小鼠preosteoblast血统MC3T3-E1或人工骨细胞在初级文化(滚刀),# 4通道,从集合中大学医院的临床研究单位安东尼奥·佩德罗风浪(UPC-HUAP-UFF)。这些细胞在DMEM (Dulbecco改良恩格斯培养基)中培养，DMEM中添加10%胎牛血清(FBS)、2 mM l -谷氨酰胺、0.1%非必需氨基酸和1%链霉素/青霉素，并在5% CO中培养₂,在37°C。

2．3.细胞球体的发展

为了产生球形细胞，将单层培养的细胞胰酶化，用血球计计数，并采用不同的细胞密度(5、10、20、30、40、50、75、90和110 × 10)^3.细胞/孔)，200粒μL培养基中添加10%胎牛血清，96个圆底微孔板，预涂40μL无菌琼脂(2% DMEM)，在微孔板搅拌器(Genie, Scientific Industries, USA)的帮助下搅拌7天，直到形成聚集物。椭球的形态和大小由相衬显微镜分析，并用Axio A1观察显微镜(Zeiss，德国)记录。

2．4．总质量评估

用琼脂法(避免粘附在培养皿上)和搅拌(确保球体形状)生产的球形细胞进行定性评估，以确定与细胞簇处理和质量相关的不同参数的最佳细胞密度(表)1)．

2．5．超微结构分析

扫描电镜(SEM):在卡诺夫斯基固定液中固定30分钟，然后在卡可酯缓冲液中洗涤3次，5分钟。固定后的样品在一系列乙醇溶液(15%-100%)中脱水，用1:1乙醇和六甲基二硅烷(HMDS)处理10分钟，然后用纯HMDS处理10分钟。在样品完全干燥后，将球体安装在铝棒上，并涂上20 nm厚的金层。样品用JEOL 5310扫描电子显微镜(日本JEOL)检查。

使用CellEvent Caspase 3/7 Green Probes和Hoechst 33342 (1:5 00) (Life Technologies, USA)对整个聚集物进行凋亡染色。直接在含有活团聚体的6孔板中孵育30分钟，条件与维持团聚体培养的条件相同。聚集物收集到15ml试管中，用PBS洗涤3次，去除游离荧光团，在4°C下固定在4%的多聚甲醛中15分钟。聚集物在4°C的PBS中保存，并在荧光共聚焦显微镜(DMI 6000，徕卡，美国)上观察。

2．6．细胞相容性试验条件培养基的研制

提取物按ISO 10993- 12:08所述制备[19，确定了试验材料与提取培养基(无添加培养基，DMEM)的质量比和体积。提取介质以200 mg/mL的比例暴露于每个样品，并在5% CO下孵育24小时₂, 37°C。

2.7。细胞毒性检测

为了评估细胞毒性，用微管收集球形细胞，体积为10微升，分别转移到含有190微升每种提取物或未暴露培养基的孔中(对照)。细胞暴露24小时(5% CO₂存活率通过XTT测定(In Cytotox, Xenometrix, Germany)。它包括添加XTT试剂(2,3-bis-(2-甲氧基-4-硝基-5-硫苯基)- 2h -四唑-5-羧基苯胺)，孵育和使用Microplate Reader (Synergy II Biotek Inst.， USA)在480 nm下测量可溶甲醛盐的光密度(OD)。理想的孵育时间是通过每30分钟进行一次后续读数来确定的，直到达到最大稳定读数。对于球样培养，在加入XTT后3小时达到。此外，在井中有无球体的情况下进行读数，没有观察到任何变化。

2.8。统计分析

对细胞毒性试验的结果进行正态性检验，并对所有实验组进行Dunn后验进行Kruskal-Wallis非参数方差分析，alpha误差为5%。使用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, USA)软件进行分析。

3.结果与讨论

用于骨治疗的生物医学材料通常采用动物模型进行生物相容性和安全性评估在体外单层细胞培养试验[20.］．然而,替代在体外模型可以提供比单胺反应更接近生理反应的受控条件在体外系统。在这项工作中，我们开发了一种3D球形细胞培养，有可能用于生物医学用途材料的细胞相容性评估。

聚合体生产有许多不同的方法，包括使用微流体、旋转和颗粒培养，以及悬挂滴技术[21］．在本研究中，简单的方法提出使用琼脂包衣，避免细胞在培养板底部粘附，为细胞聚集提供条件。事实上，人们认为成骨细胞的分化和存活依赖于细胞通过整合素与细胞外基质(ECM)的粘附，在没有接触的情况下，细胞通常进入缺失状态[22］．然而，一般来说，细胞聚集形成的一个基本概念是，通过e-cadherins细胞相互作用可以抑制细胞对anoikis的敏感性[23］．因此，如果我们快速诱导成骨前细胞之间的近似和相互作用，在一个相同的细胞不优先连接的环境中(例如，琼脂)，我们可能支持那些能够聚集和通过钙粘蛋白建立细胞-细胞接触的细胞的生存，随后在聚合体内产生基质蛋白。

然而，一些培养参数可能会影响球形形成的结果，如每个孔上播种的初始细胞密度。在这方面，图1结果表明，虽然初始密度较低，形成时间较短，但大多数群体在播种后第2 ~ 3天已经形成团聚体。更高的密度会形成更稳定的球体，也就是说，在解体和细胞分离之前的持续时间更长。在密度等于或大于30,000个细胞的情况下，这种处理(通过易于看到和从一个培养皿移动到另一个培养皿的能力来衡量)被认为是理想的。

还观察到，当密度超过75,000个细胞时，大多数球形细胞都呈现不规则图案，同一井中多个球形细胞的数量也在增加。从定性分析的结果可以得出结论，如表所示2， 30 000个细胞的密度是进行进一步试验的理想条件，因为在这种条件下生产的球形细胞在所有主要项目上的表现相对较好。

当用原代培养获得的球体进行评估时，观察到一个有趣的现象:形成球体的实验时间较高，表明激活和细胞对细胞粘附的过程较慢，可能原代细胞本身并没有转化/不朽。然而，在电镀后7天，球状体的形成是一致的，其平均稳定性较好，在培养近30天的时间内保持连接。表格3.显示原代培养和鼠系球型形成的平均时间。重要的是要注意，转化细胞通常比原发细胞更容易聚集，正如一些癌症研究的工作所描述的[24，25］．因此，可以预期，正如在本工作中观察到的，永生化细胞系应该较少受到诸如anoikis等现象的影响，并且可能需要更低的球型培养时间，正如本研究结果所证实的那样。

另一个重要的观察结果是，当细胞密度从3万到5万时，初级细胞球体具有很大的均匀性和低多样性，而当细胞密度大于7.5万时，定性分析中评估的所有主要参数都发生了强烈的改变(图)2)．原代细胞的多样性明显高于鼠系球型细胞。

扫描电子显微镜(SEM)观察，30000个细胞处的骨细胞球体表面非常规则，致密，如图所示3(一个)．在更高放大率下成像(图3 (b))证实了外层细胞之间的强烈相互作用，其细长的形态与之前关于成骨细胞聚集的报道非常相似[13］．还可以观察到，尽管球体的致密性，但某些空间可能用于将营养物质输送到团聚体的内层，这可能有助于细胞团核心的细胞存活。

事实上，在三维模型的研究中，分子和营养物质从介质到团聚体最内层的运输减少的可能性是特别关注的问题[13，14］．的确，3D模型有助于理解细胞在三维生理环境中如何对空间组织、增殖和存活等参数作出反应，包括可能的凋亡途径[26］．

数字4通过共聚焦显微镜观察，显示聚集物内层细胞活力的评估。caspase 3/7探针显示弥漫性凋亡细胞被活细胞包围。虽然在本文研究的实验次数中，它还不足以在球体核上形成空心，但它可能有助于降低团聚体的平均大小，类似于之前关于分化间充质干细胞团聚体的研究[14］．它还可能对骨细胞球体的最大可存活尺寸施加限制，范围为300-400微米，这是本研究的大多数聚集物所涉及的范围。此外，一些作者提出并研究了在胶原蛋白支架上与内皮细胞共培养产生聚集物用于细胞治疗(而不是材料测试，如本文所提出的)，旨在促进血管化，并有有趣的结果[27］．

为了评估生产的小鼠小球在医用材料细胞毒性测试中的适用性，我们根据ISO 10993-5:2009进行了一项测定，使用了代谢活性参数(XTT试验)。虽然这种方法不足以完全理解骨细胞对一种新材料的生物反应，但这种基于提取液(条件培养基)的检测方法对应于新生物相容性材料筛选的第一步，是初始阶段最常见的做法之一在体外评估医疗材料，通常为规管目的而接受/建议[4］．因此，为了验证所提出的聚合体在材料测试中是否符合预期和适当的行为，我们选择了这种方法，因为它简单，可重复，标准化，广泛应用，在文献中有众所周知的结果。

数字5(一个)如预期一样，证实手术级钛和聚苯乙烯被检测为无细胞毒性，而乳胶显示出高细胞毒性，且呈剂量依赖性，如预期一样。然而，我们可以看到，阳性对照观察到的毒性水平远低于通常在二维培养中观察到的水平，在相同条件下，MC3T3-E1细胞的细胞毒性大约高3倍[17］．这种较低的毒性可能反映了在离诊所更近的地方产生的结果，在那里，当与粉末无关时，乳胶手套、止血带、探针和导管经常与患者的身体直接接触，而不会导致坏死或相关慢性毒性或过敏的实际水平[28，29］．

结果还表明，球的灵敏度可能受到细胞模型和初始细胞密度的影响。当用人体球体重复这个测试时(图5 (b))，我们意识到100%乳胶提取物的细胞毒性要小得多，尽管与聚苯乙烯和对照组有显著差异()．此外，还观察到检验的标准偏差增加。这种较低的毒性可能与表面/体积比的改变有关。随着体积3和表面积2的倍数的增加，较大的球体在细胞团内受保护区域的细胞比例增加。因此，内层细胞的代谢活动可能超过可能因毒物暴露而死亡的外层细胞。

球型培养的成骨细胞可以间接地(如本研究中所评估的)与生物材料接触，也可以直接通过从琼脂上去除并沉积或在材料表面播种控制数量的聚集物。外层的细胞可能提供关于细胞表面直接相互作用的信息，如粘附，或焦点接触的存在，而与内层的细胞-细胞相互作用可能有助于了解材料对三维环境的影响，如生物组织，甚至评估释放的毒物渗入材料的影响。值得注意的是，球体除了能够像任何其他细胞培养一样与附着表面结合外，还能够融合在一起，允许在用于进一步研究的材料表面形成“器官型”骨细胞层。这种相互作用可能在未来的研究中观察到，如共聚焦荧光显微镜技术。

如今，材料科学基础研究产生的知识的适用性已经得到了极大的重视，为重大的治疗进展提供了资源。这意味着寻找材料生物学评价的新工具将直接影响骨生物学领域的生物技术进展[3.］．在此背景下，本研究结果表明，发展三维成骨细胞培养的原代人和转化小鼠细胞系的生物相容性是可行的。还需要进行更多的研究，以确保基于这些3D模型的工具的开发，这可能会对提高结果的质量产生影响在体外生物医学材料的测试，实现其潜力，提供更接近材料暴露的生理真实条件的测试模型。

4.结论

当用于金属和聚合物基生物材料的标准化测试时，来自人类原代细胞和动物系细胞培养的聚集物都是稳定的，并表现出良好的活力。因此，成骨细胞球体可能为材料筛选和生物相容性检测提供一种有前景的工具。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项工作得到了巴西机构CNPq、FAPERJ、CAPES和PROPPi-UFF的资助。

参考文献

1. J. M. Morais, F. Papadimitrakopoulos，和D. J. Burgess，《生物材料/组织相互作用:克服异物反应的可能解决方案》，aap日报，第12卷，第2期2，页188-196,2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. P. C. Salgado, P. C. Sathler, H. C. Castro等人，“骨重塑、生物材料和技术应用:重温基本概念”，生物材料与纳米生物技术杂志，第2卷，第2期3，页318 - 328,2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. W. F. Zambuzzi, P. G. Coelho, G. G. Alves，和J. M. Granjeiro，“细胞内信号转导作为骨组织工程‘智能’生物材料发展中的一个因素”，生物技术和生物工程，第108卷，第108号6, pp. 1246 - 1250,2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. 国际标准化组织，"医疗器械的生物学评价第1部分:风险管理过程中的评价和试验，"ISO10993-1:2009，国际标准化组织，2009。视图:谷歌学者
5. C. T. Hanks, J. C. Wataha, Z. Sun，“生物相容性的体外模型:综述”，牙科材料，第12卷，第2期3，页186-193,1996。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. j.a. Cortês, E. Mavropoulos, M. Hausen, A. Rossi, J. M. Granjeiro，和G. G. Alves，“直接与生物陶瓷表面接触的细胞相容性定量研究的方法学意义”，主要工程材料， vol. 493-494, pp. 325 - 330,2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. P. Torricelli, M. Fini, G. Giavaresi，和R. Giardino，“体外模型测试骨科生物材料在骨质疏松症骨的临床应用，”国际人造器官杂志第27卷第2期8，页658-663,2004。视图:谷歌学者
8. F. Pampaloni, E. G. Reynaud和E. H. K. Stelzer，“第三维度架起了细胞培养和活组织之间的桥梁，”《自然评论分子细胞生物学》，第8卷，第2期10，第839-845页，2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. N. T. Elliott和F. Yuan，“药物发现和转运研究的三维体外组织模型综述”，制药科学杂志号，第100卷。1，页59-74,2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. C. M. Nelson和M. J. Bissell，“建模动态互惠:乳房结构、功能和肿瘤转化的工程三维培养模型”，癌症生物学研讨会，第15卷，第5期。5，页342 - 352,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. R. M. Sutherland，“肿瘤微区细胞与环境的相互作用:多细胞球体模型”，科学，第239卷，第2期第2页，第2 - 4页，1988。视图:谷歌学者
12. R. M. Sutherland, J. a . McCredie和W. R. Inch，“组织培养中多细胞球形细胞的生长作为结节性癌的模型”，国家癌症研究所杂志第46卷，第46期1，第113-120页，1971年。视图:谷歌学者
13. J. Neunzehn, S. Heinemann，和H. P. Wiesmann，“3d成骨细胞培养用于生物材料测试”，发育生物学与组织工程杂志，第5卷，第5期。1, pp. 7-12, 2013。视图:谷歌学者
14. A.-C。“三维人类间充质干细胞聚集物的压缩、融合和功能激活”，组织工程A部分第21卷第2期9-10, pp. 1705-1719, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. J. S. Burns, P. L. Rasmussen, K. H. Larsen, H. D. Schrøder, M. Kassem，“在骨传导支架上生长的端粒化人类间充质(基质)干细胞的三维骨球参数预测体内成骨潜能，”组织工程学部分，第16卷，第5期。7，第2331-2342页，2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. W. Wang, K. Itaka, S. Ohba等，“微模式基质上的3D球形培养系统用于提高多能间充质干细胞的分化效率，”生物材料，第30卷，第2期14, pp. 2705-2715, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. E. S. Lourenço, J. Côrtes, J. Costa, a . Linhares，和G. Alves，“商业乳胶作为阳性对照的评估在体外生物陶瓷的测试”,主要工程材料， vol. 631, pp. 357-362, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. 国际标准化组织，第5部分:体外细胞毒性试验，国际标准化组织，2009。
19. EN-ISO-10993-12， "医疗器械的生物学评价第12部分:样品制备和标准材料"ISO10993-12:20 2008，第3卷，2008。视图:谷歌学者
20. P. E. Murray, C. García Godoy和F. García Godoy，“牙科生物材料的生物相容性是如何评估的?”Medicina Oral, Patología Oral y Cirugía bual，第12卷，第2期3，页。e258 - 26,2007。视图:谷歌学者
21. T.-M。阿奇利，J.迈耶和J. R.摩根，《多细胞球体的形成、使用和理解的进展》，生物治疗专家意见，第12卷，第2期10, pp. 1347-1360, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. m .狱吏M.-C。Serrano, J. Roman等，“通过互连大孔纳米碳化羟基磷灰石/琼脂糖支架的胶原蛋白涂层抑制anoikis，”生物医学材料研究学报第95卷第1期3，页793 - 800,2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. J. L. Luebke-Wheeler, G. Nedredal, L. Yee, B. P. Amiot, and S. L. Nyberg，“E-cadherin通过caspase独立机制保护原代肝细胞球形细胞免于死亡，”细胞移植第18卷第2期12，第1281-1287页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. x张L.-H。Xu, and Q. Yu，“细胞聚集诱导PECAM-1和Pyk2磷酸化并促进肿瘤细胞锚定非依赖性生长”，分子癌症， 2010年第9卷第7条。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. A. F. Steuer和R. C. Ting，“转化细胞形成更大的细胞聚集:细胞转化的体外指数，”国家癌症研究所杂志第56期6，第1279-1280页，1976。视图:谷歌学者
26. N.查希尔和V. M.韦弗，《第三维度的死亡:细胞凋亡调控和组织结构》，《遗传学与发展的最新观点》第14卷第2期1，页71-80,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. a . Stahl, X. Wu, a . Wenger, M. Klagsbrun, P. Kurschat，“在球状培养物中发芽的内皮祖细胞能够抵抗成骨细胞的抑制:骨替代移植的模型，”2月的信，第579卷，第5期。24, pp. 5338-5342, 2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
28. L. Cormio, K. Turjanmaa, M. Talja, L. C. Andersson，和M. Ruutu，“乳胶手套的毒性和直接过敏性”，临床和实验过敏，第23卷，第2期。7，第618-623页，1993。视图:出版商的网站|谷歌学者
29. B. L. Charous, C. Blanco, S. Tarlo等人，“天然橡胶乳胶过敏12年后:建议和展望，”过敏与临床免疫学杂志，第109卷，第2期。1，第31-34页，2002。视图:出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2015 Luciana Restle et al。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。