文摘

在这项研究中,我们提出一个有前途的方法的迅速发展,多孔聚二甲基硅氧烷(PDMS)脚手架原型,从设计阶段与外部几何定义,根据传统的形式植入或适应病人的biostructures。制造方法是基于相分离过程中使用铸造获得的材料添加剂快速原型模具。我们包括PDMS海绵进行比较研究,通过不同的简单过程。最后在体外评估使用hMSCs(来源于人类间充质干细胞的骨头),培养到多孔PDMS支架携带aminopropyltriethoxysilane(摘要)和平衡的营养因素中产生的细胞。结果表明,多孔PDMS脚手架原型是优秀的3 d平台hMSCs附着力。此外,这个PDMS-3D利基,播种和hMSCs chondrogenic孵化介质三周期间,显示成功的软骨形成由胶原蛋白II型表达式。因此,结果显示一个通用的方法来产生一个3 d利基软骨和软骨内骨形成解决问题或骨骼组织的临床方法。

1。介绍

组织工程结合生物、物理和工程知识提供人工开发替代品相关组织和器官修复和替代疗法。关键要素参与组织工程过程是细胞外基质或支架上,作为对细胞生长基质或框架,聚合和组织发展(1]。这些必须多孔支架,允许在殖民过程中细胞迁移以及运输营养物质和废物的细胞,他们也必须耐足以承受可能的机械要求,特别是最后支架(或设备)需要植入。此外,细胞能感觉到他们的微环境和衬底结构躺在改变他们的形态、细胞骨架的配置,和内部细胞外信号,增加连续不断的努力集中在先进的设计和制造技术,以生成和修改结构和生物材料的表面。方面,如孔隙度、孔隙大小和表面显微组织促进细胞粘附、迁移,和支架内的扩散,随后分化成相关的细胞类型。因此,组织祖细胞和支架起到根本作用在大多数组织工程策略作为他们的属性可以深深影响全球成功的新组织形成和控制制造支架结构正变得越来越重要的新方法在再生医学(2- - - - - -4]。

大多数过程制造微孔结构组织工程(5)涉及的组合材料在某些步骤的过程和最后阶段分离,获得的固体部分分布的小孔。大多数扩展过程中,气辅注塑是一种工业方法基于注入熔融树脂或热塑性塑料模具型腔,然后应用加压气体量树脂,以帮助填写模具型腔和创建凹陷和毛孔的聚合物。起泡剂的掺入添加剂聚合物还允许制造聚合物部分毛孔。在许多策略包括组织战略,获取三维多孔结构是绝对需要灌溉组织和维护足够的液体动力学。使用porogens也是司空见惯的事;通常情况下,这个过程包括混合液体预聚物与固体颗粒(通常蜡,糖,盐等)。一旦产生聚合,通常由紫外线照射或加热、固体结构,与分散粒子,形成的聚合物网络。最终获得的多孔结构等溶解分散粒子在水或其他溶剂或通过加热。prepolymer-water乳剂也是典型的使用获得polymerizable混合物在热或UV-based聚合高分子网络提供了毛孔根据初始含水量(即。polyHIPEs)。

主要选择,提高控制支架的孔隙大小分布,从设计阶段,是使用微加法制造技术(AMT),通常在分层技术流程,遵循几何图形的帮助下获得了计算机辅助设计(6,7]。电纺的也可以适应“分层技术”制造,用于获取三维多孔结构(8),尽管这个过程不是一样重复微AMT的使用。加法制造技术的进步增加精度,连同他们的改进的多功能性,由于不断增加的材料可用于分层技术加工,大大促进应用程序链接到微,甚至nanomanufacturing复杂的3 d几何图形在几个领域非常创新的医疗解决方案(5]。

几个支架微结构制造使用不同的RP技术控制,如选择性激光烧结(9],分层hydrospinning [10)、激光有限元(11)、数字光投影(12)或双光子光刻技术(13),和不同的材料包括水凝胶(14),明胶(7],钛合金[15,16),一些光敏聚合物(17),和陶瓷18]。然而,在体外这种快速原型的验证支架并不常见,因为大多数工艺/材料不提供一个适当的结合促进生物相容性和在许多情况下生成有毒的组件。然而,一些非常有趣的研究已经发表,包括在体外验证和毒性评估(19,20.]。在生物医学领域的进步聚合物(19- - - - - -21)与化学/物理气沉积的可能性(CVD-PVD)涂层的生物相容性增强[11)这一领域带来了新的可能性,尽管访问这样的材料和技术并不容易,因为其中一些正在发展。

在任何情况下,显然,一个普遍的方法为组织工程支架发展还没有可用的,首先由于生物材料和系统的复杂性,也由于所有可能的设计资源,制造技术,及相关材料,其结果并没有系统地比较。例如,加法制造技术允许精确地控制从设计阶段最终的几何图形;然而,这样的设计通常是通过结合基于欧几里得几何图形(简单的)和最终结果不充分模仿生物的复杂性。另一方面,支架通过相分离和更多的“传统”流程通常导致更多的仿生海绵,即使他们最后的外部形式和可重复性更困难比使用计算机辅助控制策略与快速原型使用添加剂的过程。

因此,还需要进一步的研究来解决不同技术相结合的优势(22制造业增强,甚至个性化,为组织工程支架的研究和细胞外基质与全球(外部)定义几何图形作为组织修复的植入物。此外,越来越多的数据表明,祖cell-niche形成绝对需要组织发展和修复(23]。事实上,利基组成和3 d结构发挥重要作用在干细胞状态和命运。利基市场是由营养因素的特定组合产生的祖细胞保持组织修复和再生能力和特定的细胞外基质。最近的研究突出了极端的相关性将足够的生长因子,在支架内,促进生物调控、细胞分化、血管生成以及最终的组织能力(24- - - - - -26]。

术语“足够的生长因子”借鉴chondrogenic介质,提出了实验室的阿诺德。卡普兰谁创造了这个词间充质干细胞,如材料部分所述。这样的生物化学效应,来自公司的足够的生长因子,增加了一些额外的不确定性已经复杂的理解之间的交互支架的结构、形态和力学性能。因此,研究解决这些有趣的细胞外基质和生长因子之间的协同效应及其对最终影响组织生存能力是必须的,在寻求上述对多才多艺的普遍方法和成功的组织工程支架的发展。

在这项研究中,我们展示了一个方法的迅速发展,多孔聚二甲硅氧烷(PDMS-3D)脚手架原型,与通用的外部几何定义从设计阶段,根据不同的组织策略,传统的形式植入甚至适应病人的biostructures。制造方法是基于相分离过程中使用铸造获得的部分添加剂快速原型模具。我们包括PDMS海绵进行比较研究,通过不同的简单流程,包括糖浸出后聚合,聚合后水萃取PDMS-water乳剂,和水一起提取糖浸出后的聚合PDMS-sugar-water混合物。通过改变这些代理的比例,最终脚手架的主要力学性能可以调整和适应一些软组织的典型的密度和刚度。不同多孔annuloplasty戒指也获得,通过例子,以显示这些生产过程的潜力,对自由的多孔体和支架组织替代和修复。

结果表明,PDMS支架携带营养因素由hMSCs从骨髓中分离成为PDMS-3D适合细胞粘附和软骨形成。此外,携带了成为一个优秀的适合的PDMS hMSCs软骨形成,增加如果PDMS-APTS结构与营养因素在播种前hMSCs治疗。由于描述过程中,支架成为埋葬的胶原蛋白II型,即使是在材料的多孔结构。因此,我们建议这些支架软骨和软骨内骨形成/维修策略。

2。材料和方法

2.1。材料

微孔PDMS已经被提议作为细胞培养的功能性材料,高度的孔隙度需要提高细胞存活率和功能。取得了PDMS海绵使用前体(纳米乳27,28)和其他进程基于粒子(通常是盐或糖)浸出(29日]。PMDS-sugar-water混合物,促进多尺度,不太常见。此外,porogen大小和内容通常作为主要控制参数的调整最终的机械性能,尽管评估这样的机械性能不是很常见的30.,31日]。在这项研究中,我们试图对这些特殊的混合物,提供额外的细节考虑的比例不同的代理和它们对密度的影响,硬度,抗拉强度,为额外的与软组织修复的潜在替代。

获取的PDMS海绵,我们使用一个商业Neukasil RTV-20预聚物,连同Neukasil A2交联,他们两人从Altropol Kunststoff GmbH (Stockelsdorf Rudolf-Diesel-Strasse卖地,d - 23617年,德国)。根据制造商的组件都是混合数据表,介绍了真空室,在聚合的开始,足够的脱气。完成聚合反应在室温(25°C)持续24小时左右,这有助于操纵混合物与足够的时间足够的成型。作为porogen材料我们使用本地有机糖(Balbo组、巴西),以不同的比例混合与PDMS和PDMS-water乳剂。的混合物分析本研究包括以下重量分布:50:50 PDMS /水,33.3:33.3:33.3 PDMS /水/糖,50:50 PDMS /糖、40:60 PDMS /糖,33.3:66.6 PDMS /糖,和28.5:71.5 PDMS /糖,导致典型的疏密度与支架用于组织工程和研究发展。总结不同的成分和形态研究,获得粒子浸出和干燥后(参见下面的流程描述),包括在图中3简短的总结。

环氧树脂射门角度60 (3 D系统,333 3 D系统循环,岩石山,SC,美国)作为基材的快速模具,随后用于铸造PDMS-sugar-water混合物和获取外部几何形状控制从设计阶段,由于限制激光有限元原型过程用于这样的模具,如下详细。

2.2。设计和原型设计流程

一些先进的植入物,旨在组织修复有圆形或quasicircular环的几何图形,从人工括约肌annuloplasty环心脏瓣膜(通常是二尖瓣)组织强化。这些植入物可以大大受益于控制孔隙度和力学性能,随着毛孔可以帮助促进药物洗脱方法减少手术后的风险,以及允许scaffold-based组织工程策略。例如,最近的研究强调了快速原型的潜力为心脏组织工程多孔支架(32)和适应不同的心脏假肢,如强化阀环;即使使用个性化的设计(33)几乎是直接的。

作为研究工作的情况下,我们选择了一个圆环,强化组织周围不同的括约肌,和几个二尖瓣annuloplasty环(一个封闭的和一个开放的)潜在的瓣膜组织,强化修复治疗二尖瓣闭锁不全。这些设计旨在验证获得PDMS海绵的可能性,以控制外部几何图形,通过铸造成快速原型模具不同的乳剂和混合物包括PDMS、糖和水。

不同的植入环和相关模具的几何图形,如图1的帮助下,设计计算机辅助设计软件固体边缘v。20.(Siemens Product Lifecycle Management Software Inc.) and are saved as stl files for subsequent communication with prototyping machines. The stl files with the 3D virtual CAD geometry of the mold designs are transferred to a laser stereolithography SLA-3500 machine (3D Systems, 333 Three D Systems Circle, Rock Hill, SC, USA) for subsequent rapid mold manufacture and casting of the PDMS mixtures (see also Figure4)。这个过程是基于一个添加剂逐层光聚合的环氧树脂整体物理三维部分的结束。sla - 3500系统可用其产品开发实验室允许我们生产细节约150μm,尽管最近microstereolithography的发展的研究逐渐增加其精度submicrometric尺度(NanoScribe GmbH),尽管极大地限制最后一部分大小只有几毫米³。

成型过程中,多孔PDMS支架制造探测器或多孔PDMS植入物的发展,包括几个简单的步骤进一步详细示意图见图2。首先,Neukasil RTV-20预聚物和Neukasil A2交联是混合和镇静,制造商的指示后,正如前面解释道。随后,PDMS-water乳液或PDMS-sugar或PDMS-water-sugar混合物的帮助下获得1200 r.p.m金牛座立式混合机旋转。在一分钟前铸造。

打开和关闭模具都可以被使用,以及大气和真空铸造,取决于所需的最终的详细程度(真空铸造有助于填补模具和促进复制质量)。在我们的例子中,这种混合物是铸造成快速乐高模具和快速原型环氧模具在24小时在室温下聚合。一旦PDMS混合物聚合,demolding完成获取所需的移植或探针机械测试,经过适当的削减。粒子浸出是通过水浸和系统化的挤压的材料,调查和原型。最终干燥导致所需的调查(见图3)和植入物(见图4)。

2.3。机械特性

机械特性是通过拉伸试验使用MTS 835阻尼测试系统(MTS 14000技术驱动,伊甸草原,锰、美国),应用抗压的能力,拉伸和疲劳周期(机器和实验设置如图5)。在我们的示例中,不同毫米³多孔PDMS探测器获得的拉伸试验,直到提交故障(见详细视图的图5等)和不同的应力-应变曲线,造成牵引测试,在图表示6为进一步讨论。最初的30毫米探针长度之间夹和拉伸测试进行的速度10毫米/分钟。

材料加工的影响和不同比例的组件,在最终的物理属性的PDMS海绵,下面小节详细介绍和比较分析,常见的软组织的力学性能。

2.4。细胞培养过程和成像技术

的具体成分足够chondrogenic增长因素,相比与其他成骨的或脂肪形成的,是由Pittenger et al。34),用于一些引用也旨在chondrogenic分化(35- - - - - -37]。在我们的例子中,2 - 4毫升的人类健康的捐赠者提供的骨髓样本从Fundacion Jimenez-Diaz博士本杰明·费尔南德斯。的文化扩张hMSCs,如前所述[35,36]。

细胞被镀和孵化使用DMEM-L + 10%的边后卫选择批次。收集的细胞治疗trypsin-EDTA 0.25%。细胞培养基是由分子生物学的研究服务中心“维罗奥乔亚”(CSIC-UAM)。hMSCs准备的丰富营养因素中我们使用8 - 10岁入文化板块为每一批80%的融合。细胞被洗PBS和匮乏的边后卫在24小时。后来,培养基是由离心收集和清洗任何漂浮的细胞在1.500 rpm台离心机在5分钟。清洁上层清液是在冰上冷却30分钟期间,离心机Sorvall删除过盐降雨,并保持在2毫升整除−30°C到使用。我们避免任何样品反复冻融。

立方的多孔PDMS支架紫外线辐照,单独放置在25毫升猎鹰管,并得到了以下治疗:(i)使用0.5毫升PBS和彻底清洗5分钟离心直到多孔PDMS浮动停止;(2)治疗2 M乙酸在20分钟,然后迅速中和和PBS洗;(3)治疗hMSC营养介质在24小时或DMEM-LG因素控制;和(iv)种子支架150.000 hMSCs 0.5毫升chondrogenic或控制介质在三个星期37°C公司5%₂早表示(34- - - - - -37]。当PDMS海绵携带了它曾在乙醇浓度为0.025%。chondrogenic介质是DMEM-LG (6.25μ6.25 g / mL胰岛素μ6.25 g / mL转移,μg / mL亚硒酸)(合作研究),1毫米丙酮酸(Gibco), 37.5μ0.1 g / mL抗坏血酸盐(韦科)μM地塞米松(Decadran,默克公司)和0.06 ng TGF -(研发系统)。

然后,样本处理分析利用免疫荧光技术,如前所述[37,38),做了一些调整。短暂,立方支架单独放置在M24组织菜肴,减少片,与冰冷的PBS冲洗,固定在3.7%甲醛在PBS RT 30分钟,并在PBS洗。细胞被孵化与可视化Triton 0.5%埋头缓冲区包含10毫米管道、MgCl pH值6.8,3毫米₂100毫米氯化钠,EGTA 1毫米,0.3 M蔗糖,1毫米PMSF 30分钟在冰上。治疗后,样品被清洗和固定在PBS 3.7%甲醛和平衡。胶原蛋白II型免疫检测、脚手架准备被封锁的非特定的抗体绑定孵化一个小时期间3% bsa - 0.1% Triton x - 100在PBS (PBSA)在RT或一夜之间在4°C。作为主要抗体anti-collagen II型1:200被使用,二次抗体从分子探针Alexa594-conjugated,尤金,或者,在1/500稀释。核与DAPI染色(CALBIOCHEM)。免疫染色测定细胞的准备与一个反向IX81奥林巴斯DP72数码相机。

3所示。结果与讨论

结果从图4,显示植入几何图形与脚手架多孔结构,验证了设计和快速制造过程,为相关任务对系统程序自由的发展,多孔,仿生支架(以及其他(微)植入)组织工程和维修。术语“仿生”在这种情况下不仅引用了外观,机械性能也引用,下面讨论。较低的形象图5探针崩溃后,在拉伸试验过程中,有助于展示三维互连微孔网络和浸出过程的效率,因为所有糖粒子已经消失了。图6包括获得的PDMS海绵的力学性能比较和最有趣的值(抗拉强度和杨氏模量),连同密度,总结在表1,除了有趣的数据关于不同典型软组织额外的反射。

根据最初的预期,增加porogen加载(探针I-IV)导致支架密度低,抗拉强度和杨氏模量的降低值。PDMS-water乳液(探针1)导致的密度和杨氏模量与探测四世,而其抗拉强度相当高。我们解释这种差异的抗拉强度的小孔隙大小和更均匀的孔隙分布调查1,这有助于减少应力集中的影响在孔隙之间的连接。

然而,相分离获得的孔隙大小,PDMS-water乳液聚合后,直径大约有30到60微米,直径小于100 - 200微米的毛孔得到粒子浸出。较小的孔隙大小,在我们的案例中,防止形成的三维网络连通孔隙,为适当的支架是必要的。这样相互连通的孔隙网络探针I-IV获得,以惊人的结果在第四探测器,我们为最终找到最恰当的在体外验证通过细胞培养。探针2,使用PDMS-sugar-water混合物通过一个综合的方法,可用于多尺度方法,得到不同的孔隙大小,虽然有些毛孔达到300 - 400微米直径导致更低的杨氏模量。

在任何情况下,有趣的是突出的可能性调整支架密度、刚度、和力量,几乎特设,通过加入不同量和水的混合物,糖,和water-sugar PDMS。先前的研究已经证实支架刚度的影响在hMSCs分化和最终命运,表明软支架导致柔软组织和硬组织支架导致困难。在我们的研究中,支架开发显示广泛的年轻的模,可以适应一些软组织的要求,从软骨到食道,薄壁组织,和动脉,如表所示1。

关于在体外通过细胞培养评价,结果三周后(总结在图7)表明,细胞连接到支架,甚至已经渗透到多孔结构,形成一个相互关联的毛孔内的三维网络。细胞培养的过程中,我们已经使用探针IV,作为软组织修复通常支架制造工艺追求低密度、高疏。图中显示的细节细胞连接到周围的脚手架和填充不同的毛孔。也是相关的注意,在细胞培养中,细胞发达的胶原蛋白,帮助显示潜在的组织修复的方法。

支架的孔隙度,通过毛细管作用,帮助生长因子来填补三维互连多孔结构,是积极促进细胞支架的内腔。营养因素的结合由hMSCs从骨髓中分离是至关重要的细胞粘附和最终的成功PDMS-3D利基。此外,探测器IV的刚度,作为支架材料,非常类似于软骨刚度和软骨突出其大量的细胞外基质,主要由胶原纤维组成。

事实上,PDMS-3D利基,去籽hMSCs和孵化chondrogenic介质三周期间,意识到软骨形成过程表达胶原蛋白II型验证新方法获得一个优秀的脚手架,至少,软骨和软骨内骨形成/修复策略。因此,我们相信,我们的支架的刚度可能有相关影响hMSCs生长和胶原蛋白生成,因此具有潜在的足够促进软骨形成和软骨修复。

重要的是要强调msc在悬挂附着细胞迅速死亡。因此,模拟细胞外基质是绝对需要假肢发展和组织修复生物材料。然而,细胞通常不进入生物材料,除非使用一对抗原抗体作为受体识别系统。为此特定激光治疗通常是用于获取生物材料内部的反应。我们的新方法显示一个沟通因素促进MSC粘附的生物材料,即使在毛孔。此外,在孵化常规chondrogenic媒介,表达细胞的胶原蛋白II型和大多数细胞(核大红点,如图所示7)仍埋在胶原蛋白(红色所示图的图像7)。

结合快速原型提供的设计和制造过程,控制支架的外部几何,和相分离过程,促进多孔仿生结构,对最终的支架和植入组织修复所需的物理性质和预定义的几何图形。这样过程构成一个替代或补充方法最近其他解决方案组织工程支架的发展,完全基于添加剂过程,而由于脱颖而出的可能性控制从设计阶段最终的几何图形,虽然基于cad几何图形通常是简单的(典型的旺火结构),软,没有特别的仿生。详细的过程也可以补充或不干扰是结合高度有趣的3 d重建基于医学成像(45]。未来比较利基市场直接获得的添加剂生产与porogens铸造获得的医学图像和快速模具对将来的应用程序还将提供额外的信息。

由于获得的结果,我们建议这些支架软骨和软骨内骨形成/维修策略。我们预见有关应用程序在多个领域,如生物医学和组织工程,也就是说,不同的发展(微)植入和脚手架结构,主要为软组织替换和修复。个性化的方法也是可行的,由于医学成像和医学软件资源的结合计算机辅助设计的能力和添加剂快速原型,构成一个相关的优势领域包括美容整形手术。

4所示。结论

在这项研究中,我们提出了一种非常有前途的方法的迅速发展,多孔聚二甲基硅氧烷(PDMS)脚手架原型,从设计阶段与外部几何定义,根据传统的形式植入或适应病人的biostructures。制造方法是基于相分离过程中使用铸造获得的部分添加剂快速原型模具。我们有包括比较研究的PDMS海绵通过不同的简单过程涉及PDMS-sugar-water混合物。通过改变这些代理的比例,最终脚手架的主要力学性能可以调整和适应一些软组织的典型的密度和硬度,之前已经详细。

不同多孔annuloplasty戒指也已经获得,通过示例中,为了强调生产过程的潜在的对自由的多孔体和支架组织替代和修复。最后在体外评估进行了使用hMSCs(来源于人类间充质干细胞的骨头),培养到多孔PDMS支架携带了与营养因素和平衡介质产生的细胞。结果表明,多孔PDMS脚手架原型是优秀的3 d平台hMSCs附着力。此外,这个PDMS-3D利基,播种和hMSCs chondrogenic孵化介质三周期间,显示成功的软骨形成由胶原蛋白II型表达式。因此,结果显示一个通用的方法来产生一个3 d领域进一步研究问题软骨和软骨内骨形成或骨骼组织的临床方法。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作进行的支持下公司芬欧汇川集团的技术产品开发实验室和计数佩德罗Ortego先生的帮助下快速原型的任务。作者承认评论家的积极改进的意见和建议,这有助于提高论文质量和最终结果。