肠道微生物组扰动在放化疗反复应激诱导的疲劳中的作用:一项概念研究的证明

摘要

目标. 这项概念验证研究的目的是（a）检查成人直肠癌患者在放化疗（CRT）过程中肠道微生物组的疲劳和多样性的时间变化；（b） 研究CRT中期和末期疲劳和非疲劳参与者的肠道微生物组多样性是否存在差异；和（c）调查CRT中期和末期疲劳和非疲劳参与者在门和属水平上粪便微生物群的相对丰度是否存在差异。方法．在CRT开始前、中间(12-16次治疗后)和结束(24-28次治疗后)收集粪便样本和症状评分。描述性统计和曼-惠特尼U进行了疲劳试验计算。采用QIIME2软件对肠道微生物组数据进行分析。结果．参与者(N年龄从37岁到80岁不等。对总样本而言，CRT结束时的中位数疲劳评分(中位数= 23.0)与开始CRT前的中位数疲劳评分(中位数= 17.0; ）.在CRT中期，疲劳参与者的alpha多样性(操作分类单元丰度)(149.30±53.1)低于非疲劳参与者(189.15±44.18)。t(23) = 2.08, ）.在CRT中期，Shannon和Faith多样性指数也呈现类似趋势。然而，在CRT结束时，疲劳和非疲劳参与者之间的alpha多样性指标没有显著差异。变形菌门，厚壁菌门,拟杆菌疲劳参与者的优势门是什么埃希氏杆菌属，拟杆菌，Faecalibacterium,示波螺旋藻是疲劳参与者中最多的属。结论．crt相关的肠道微生物组紊乱可能导致疲劳。

1.介绍

局部进展期直肠癌(RC)采用伴随化疗和放疗(CRT)治疗，以达到治疗目的[1］.标准RT每周5天，每日1.8戈瑞，总剂量为50.4戈瑞，同时连续服用5天以上的5-氟尿嘧啶(5- fu)或每周5天口服卡培他滨，总剂量为5周。使用标准放疗肿瘤组(RTOG)领域，包括直肠，区域淋巴结和盆腔小肠。尽管CRT改善了RC和生存率的局部控制，但它经常产生破坏性的副作用，如疲劳，对健康相关的生活质量产生负面影响[2］.CRT治疗期间癌症相关性疲劳的病因和相关机制尚不清楚[3.］.然而，有一些证据表明，这表明癌症treatment-induced肠道微生物微扰/失调(肠道菌群的失衡或微生物生活在肠道)有助于inflammation-enabling细菌易位和microbially-mediated代谢物进入体循环和诱导异常激活免疫系统等cytokine-induced (i.e., interleukin-6) inflammatory reaction, which can affect brain function and induce behavioral symptoms such as fatigue [4- - - - - -8］.然而，目前还没有足够的微生物学研究来确定CRT期间肠道菌群的变化与疲劳程度之间的关系。专注于肠道微生物群扰动的疲劳表型可以是更好地理解crt相关疲劳生物学和开发针对表型特征的个性化药物/干预的第一步。

最近的临床证据[9，10]放疗或化疗可引起肠道微生物群落多样性和组成的扰动，如在小鼠研究中看到的[9，11］.一项研究(n= 9)，经盆腔RT治疗的妇科癌症患者Shannon多样性指数(细菌种类多样性)明显下降[12]此外，他们还报告说，在RT期间fusobacterium.显著增加，而门厚壁菌门一项动物研究(使用实时PCR定量细菌)表明，5-FU化疗与减少梭状芽胞杆菌spp。乳酸杆菌spp。,链球菌Spp.和增加埃希氏杆菌属以及大鼠空肠中杯状细胞数量或粘液分泌的减少[13]上述证据表明，接受化疗或放疗的患者的肠道微生物群可能发生显著变化[4，5，9］.然而，这些研究侧重于化疗或放疗，而不是两者都有，具有异质性的组和小样本量，这表明需要更多的研究关于CRT期间肠道微生物的破坏。

肠道微生物的扰动与骨盆RT期间疲劳的恶化有关[8，14］.一项小型队列研究发现，疲劳症状与全身炎症标志物(触珠蛋白)、微生物多样性、丰富度和炎症因子呈正相关厚壁菌门/拟杆菌在随后出现腹泻、疲劳明显恶化的患者中，盆腔放疗前的比例显著改变[14］.CRT如何在减少微生物多样性和增加病原体繁殖中发挥作用，从而影响全身炎症反应并产生相应的行为效应，这是一个新兴的兴趣[4，5，8，14］.这项试验研究与这种兴趣一致。因此，这种概念研究证明的目标是：（a）在具有RC的成人CRT的过程中，检查疲劳评分的时间变化和肠道微生物组的多样性;（b）调查在CRT的中间和末端的疲劳和非申请参与者之间的肠道微生物多样性是否存在差异;（c）调查在CRT的中间和末端的酸痛和非申请参与者之间是否存在粪便微生物的相对丰度存在差异。进一步的研究可能指出可能的微生物签名，可识别有风险的RC患者，以发展急性CRT相关的疲劳。此外，更好地分层风险患者可能优化临床护理，并提高患者和家庭的生活质量和健康状况。

2.材料和方法

2．1.研究人群

本研究招募了计划接受CRT的新诊断RC患者。排除标准包括进展或不稳定的任何身体系统疾病，导致临床显著疲劳;过去5年内有严重抑郁症病史;以及未矫正的甲状腺功能减退或贫血。在任何样本采集事件发生前一个月内服用抗生素、益生元、益生菌、类固醇和/或免疫抑制剂的患者也被排除在外。数据收集时间为2017年9月至2018年4月。研究参与者的招募和数据收集是在三家流动癌症治疗机构进行的:两家在美国东南部，一家在波多黎各的圣胡安。东南医学学术中心和波多黎各大学医学科学校区的人体受试者委员会在数据收集之前批准了这项研究。在涉及人类参与者的研究中执行的所有程序都符合机构和/或国家研究委员会的道德标准，并符合1964年《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案或类似的道德标准。所有参与研究的个体均获得了书面知情同意。

２.２.人口统计资料，临床信息和疲劳评估

在获得知情同意后，参与者完成两份纸质表格:人口统计信息和7项患者报告结局测量信息系统疲劳(promise -f)。表格在对照表前、中间(12至16次对照表处理后)和最后(24至28次对照表处理后)给予。人口学表格收集了受访者的年龄、婚姻状况、职业状况和教育水平。主要研究人员从病历中获得了以下临床信息:癌症分期、治疗前血红蛋白(Hgb)水平、处方和自用药物、放疗分数数和总放疗剂量。

由7项组成的成人promise - f表格评估过去一周疲劳的影响和体验[15］.例如，其中一项是“在过去的七天里，你多久感到疲劳一次?”每个项目都由李克特类型的5分量表进行锚定(1 =从不到5 =总是)。分数在7到35之间，高分意味着更疲劳。总分是通过汇总各项目的分数计算出来的。由7个条目组成的promise - f，西班牙语和英语版本已被广泛用于评估癌症相关的疲劳，其有效性和可靠性已得到充分证明[15- - - - - -17］.本研究promise - f的内部一致性为0.90。此外，我们在癌症患者研究中使用推荐的原始评分有意义重要差异(MIDs)范围比较了平均原始评分，这表明7项promise - f的原始评分估计范围在2-3 [17］.为了优化研究参与者的疲劳表型特征，我们根据CRT结束前、中间和结束前promise - f评分的3点变化对参与者进行分组分析;疲劳参与者的promise - f评分增加≥3分，非疲劳参与者的疲劳评分变化<3分。

２.３.粪便样本集合

在疲劳评估的同一天(在CRT之前、中间和结束时)，每个参与者在三个研究时间点使用无菌塑料容器收集大约5克粪便。参与者将粪便样本储存在家里的冰箱里，并在24小时内亲自交给研究团队。在批量DNA提取前，250 mg粪便样品立即在−80°C下保存约30天。

２.４.16s RNA基因测序微生物组分析

从粪便细菌中提取DNA(从以前(n= 29)，在中间(n= 26)，最后(n采用Power Soil DNA Isolation kit (MoBio, Carlsbad, CA)程序进行16S RNA扩增，并作为PCR扩增模板。每个时间点粪便标本数量的差异是由于缺少粪便标本或在采集时使用了抗生素或益生菌。使用Qubit 3.0荧光仪(Life Technologies;Thermo Scientific, Wilmington, DE)。将5µl DNA放在1%琼脂糖凝胶上，用溴化乙锭染色，以评价DNA的完整性。根据Illumina协议，在MiSeq Illumina平台上进行微生物测序[18］.采用Illumina标准引物扩增16S细菌rDNA的V3/V4区。反向引物包括一个12碱基对(bp)的核苷酸条形码，以便于85个样本在一个300 bp的对端MiSeq运行(V3试剂盒)上进行多重测序。所有通过初始质量控制的读取都将保留以供进一步分析，并删除适配器和条形码序列。使用对端读合并(PEAR)合并两个读端，最小重叠为20 bp，显著性为0.001 [19]。我们总共获得14430624次读取，每个样本的平均读取量为169773次。

使用Qiime (Quantitative Insights into microbial Ecology) version 2软件进行多样性测量和微生物分类。遵循Qiime管道，使用DADA2对高质量的Illumina读取进行修剪和去噪[20.]，然后使用Mafft对剩余序列进行对齐[21].建立系统发育树以计算α多样性指标：香农多样性指数（说明现有物种的丰度和均匀度）、观察到的操作分类单元（OTU）数量、Pielou的均匀度和Faith系统发育多样性指数（微生物群落均匀度的估计器）此外，使用Greengenes 16S数据库和用于选择V3-V4区域的扩增引物，使用qiime2特征分类器插件在门和属水平上进行分类。利用所有多样性指标和相对丰度来研究CRT对肠道微生物组及其相关组的影响由于疲劳而疲劳。

2．5．统计分析

对样本的人口统计学特征和疾病特征进行描述性统计，包括频率、百分比、平均值和标准偏差(SDs)。此外，还计算了整个样本和疲劳组类别的promise - f的描述性统计数据，包括平均值、SDs和中位数。因为直方图显示promise - f数据不是正态分布，非参数(Mann-WhitneyU试验）统计测试用于评估前后在CRT之前和前部之间的差异。We used a Chi-squared test or Spearman’s correlation to investigate the possible association between fatigue and (a) infusion chemotherapy vs. oral chemotherapy, (b) stage, (c) gender, (d) age, (3) BMI (body mass index), and (f) before treatment Hgb levels. The data were analyzed using Statistics Package for Social Sciences SPSS, version 24.0 for windows, and/or the R statistical software.

采用夏皮罗试验评估肠道微生物组变量(多样性和相对丰度)的正常性，显著性阈值为 ．我们使用混合效应回归分析来研究CRT过程中肠道微生物群落多样性指标的差异，同时调整重复测量。我们用了双尾t-测试或曼-惠特尼U检验，以显著性水平≤0.05评估各组间CRT中段和末端疲劳状态的统计学差异。为了检验CRT前的微生物组变量(多样性和分类学)是否可以预测治疗后的疲劳状态，我们使用了随机森林分类。我们使用平衡准确性评估分类性能，平衡准确性定义为敏感性(正确识别的疲劳个体比例)和特异性(正确识别的非疲劳个体比例)之间的平均值。使用基尼指数的平均下降来评估分类的变量重要性。

3.结果

３．１．病人的特点

我们接洽了36名可能参与这项研究的男性和女性;33人同意参加，但只有29人符合条件并获得同意。研究参与者的平均年龄为61岁(SD 11.4);绝大多数人已婚或有伴侣(96%)，受过良好教育(85%)，退休(69%)。大多数参与者是男性(近61%)，非西班牙裔白人(48%)，其次是西班牙裔(30%)。表格1描述参与者的临床特征。20名患者临床分期为T3(69%)， 9名患者为2期RC。患者接受3 d技术标准协议的45 Gy骨盆25分数,包括后盆腔节点,直肠,和直肠系膜1椎间盘空间,然后6到8 Gy提升(51 - 53 Gy)在3或4分数原发肿瘤体积的1.5厘米。共17例(53%)患者同时持续输注5-FU 225mg /m²超过24小时，12例患者接受口服卡培他滨825 mg/m²每天两次，每周5天，共5周。治疗前，Hgb水平在参考范围内（表1）1）.

３．２．crt相关疲劳的严重程度

与开始CRT前的中位评分相比，CRT结束时的疲劳严重程度有显著差异(得分越高说明越严重)( ）(表2）.一半的参与者疲劳（n= 13;中位数疲劳= 19）在CRT中间，一半（n = 13、 中位疲劳 = 20） 此外，在CRT结束时，大多数参与者都在疲劳组(n= 15;中位疲劳= 24)，7例为非疲劳组(中位疲劳= 18)。无论是在治疗中期还是结束时，疲劳状态与输注化疗和口服化疗之间均无统计学关联(χ 2， ）.同样，疲劳状态与性别之间也没有显著关联( ）在任何时候。此外，虽然在治疗，年龄，BMI，治疗次数或治疗HGB水平之前没有疲劳分数之间没有疲劳分数之间的关联（ ）,治疗前的疲劳评分较高(rho = 0.50， ）在治疗的中间(rho = 0.45， ）分别与更高阶段的疾病相关

3.3.在CRT过程中，总样本读数的肠道微生物组多样性的时间变化，每个样本的平均读数

表格3.为计算得到的alpha多样性指数的中值，即(a) Shannon的多样性;(b)观测otu数目;(c)群落均匀性的估计(Faith和Pielou)。使用混合效应回归分析对alpha多样性进行进一步的比较分析表明，Shannon的多样性在中间显著降低( ）及CRT课程结束时( ）与处理前相比，整个样本(图1(一)）.同样，在中间的otu丰度也明显较低( ）在治疗结束时发现( ）与治疗前otu比较(图1 (b))与开始治疗前相比，CRT中期的Pielou均匀度指数也有降低的趋势（图1）1 (d)）.在CRT中期和末期，5-FU输注组与口服卡培他滨组在任何多样性指标上均无显著差异，这表明两组在化疗方面是相同的(S1．表)。

3．4．在治疗过程中疲劳和非疲劳参与者之间的阿尔法多样性指数的差异

我们比较了疲劳和非疲劳参与者在CRT中间和结束时的alpha多样性指数。后续测试使用Welch 'st-检验显示疲劳患者和非疲劳患者在治疗中间有显著差异(图2 (b)）.疲劳患者OTUs的平均丰度(149.30±53.1)低于非疲劳患者(189.15±44.18)。t(23) = 2.08, ）.在CRT中间，Shannon和Faith多样性指数也有类似的趋势(图)2(一个)和2 (c)）.然而，在CRT结束时，疲劳患者和非疲劳患者之间的alpha多样性指标没有显著差异，这可能是由于本探索性研究样本量较小(S2．表)。

3．5．在治疗过程中疲劳和非疲劳参与者之间最常见门的相对丰度的差异

与分类分析,厚壁菌门和拟杆菌是疲劳和非疲劳参与者在CRT中间和结束时分别最大的两个门(表4）.在治疗过程中，相对丰度显著降低拟杆菌疲劳参与者与非疲劳参与者的差异(U= 124, ）(表4在CRT的中期，在疲劳的参与者中观察到类似的趋势，与未疲劳的参与者相比，FiMICUTE /拟杆菌比率增加，在治疗结束时，有显著的较高相对丰度。拟杆菌疲劳参与者与非疲劳参与者的差异(U= 16, ）.还有一种趋势是，食物的丰度越来越低厚壁菌门/拟杆菌门比和厚壁菌门疲劳的参与者与不疲劳的参与者之间的比较

3.6。在治疗过程中疲劳和非疲劳参与者选择属相对丰度的差异

3.6.1。疲劳参与者的粪便微生物生态学

在整个治疗过程中，疲劳和非疲劳参与者的粪便微生物组成在属水平上也存在显著差异(图)3.）.更具体地说，我们观察到在治疗的中间，疲劳的参与者的微生物群显着富集埃希氏杆菌属属于门的属变形菌门与未疲劳的参与者相比（很少或没有这种属的代表性）( ）(图3 (d)）.在治疗结束时，疲劳参与者的菌群明显从属中富集拟杆菌(图3 (f))，属于拟杆菌门，和成员厚壁菌门门,包括Faecalibacterium和示波螺旋藻与不疲劳的参与者相比( ）(数据3 (e)和3 (g)）.

操作。非疲劳参与者的粪便微生物生态学

在治疗过程中，我们观察到非疲劳参与者的微生物菌群显著丰富，其中一个成员属于疣微菌门门,Akkermansia属（图3 (b))，并由委员会成员厚壁菌门门，包括Ruminococcaceae亲情如归瘤胃球菌属和示波螺旋藻属(图3(一个)和3 (c))与疲劳参与者的微生物群( ）.在治疗结束时，我们观察到非疲劳参与者的微生物菌群明显丰富厚壁菌门门，包括乳杆菌科家庭等乳酸杆菌属( ）(图3（h））.

3.6.3.测试CRT前的微生物组变量（多样性和分类）是否可能预测CRT期间的疲劳状态

我们进行了随机森林分类，使用基线微生物组变量作为预测因素，治疗中间和结束时的疲劳状态分别作为结果(图)4）.微生物组变量包括Shannon多样性指数、OTUs、Pielou均匀度指数、Faith系统发育多样性指数、9个门水平分类分配(变形菌门，放线菌门，拟杆菌，厚壁菌门,Verrucomicrobia，Fusobacteria，Tenericutes，TM7,Synergistetes),厚壁菌门/拟杆菌门比率。在中间点，我们预测有和没有疲劳的参与者的准确性为63%，敏感性为70%，特异性为57%。在治疗结束时，我们预测有疲劳和没有疲劳的参与者的准确性为49%，敏感性为73%，特异性为25%。

4.讨论

我们的发现和讨论必须被视为初步的，并应谨慎解释，因为下面讨论了几个局限性。尽管如此，疲劳经常被报道为癌症患者在治疗过程中面临的最痛苦的症状之一。事实上，来自横断面研究的证据表明，癌症患者的患病率f约67%的患者在非转移性RC的新辅助CRT期间出现严重疲劳[22]， 85%的患者抱怨crt后出现持续疲劳[23];然而，现有的纵向研究有限。这项探索性研究的结果显示，从CRT开始到结束，疲劳明显恶化( ）.在接受CRT的头颈部癌症患者中也有类似的发现[24］.有趣的是，我们没有发现疲劳与化疗类型、性别、年龄、BMI以及治疗前的血红蛋白水平有关。这些发现与其他报告一致，其中性别、年龄和放疗总剂量均不能预测不同癌症诊断患者在放疗期间的疲劳程度[25］.类似地，Gurren等人[26结果显示，RC新辅助放疗期间，疲劳评分与Hgb水平之间无相关性。相反的是，在为控制症状而入院的晚期癌症患者样本中，一般疲劳与Hgb水平相关[27］.尽管如此，考虑到肿瘤分期与疲劳的高相关性，临床医生需要意识到肿瘤分期高的患者疲劳恶化的可能性。这些发现还表明，临床医生需要持续评估、计划和管理CRT的疲劳和其他潜在副作用，以改善这一未被研究人群的治疗结果[2］.预防和管理crt诱发疲劳的一个主要缺口是其生物学机制尚未确定。尽管如此，对肠道-脑轴的重新关注和高维测序技术/数据的显著进展表明，在crt相关疲劳的病理生物学中，crt诱导的肠道微生物扰动/生态失调的作用[4，5，8，9，14];然而，对这一临床人群进行全面的微生物学研究还很少见。

我们对探索性研究的发现表明，CRT等各种因素导致肠道微生物组合物的扰动。更具体地，本研究中的肠道微生物扰动的特征在于，在CRT的中间和末端的样品中，与在治疗之前的Shannon多样性指数和观察到的物种/ otus的治疗中的样品中的样品降低。仅在接受化疗或骨盆RT的患者中报道了类似的结果。一项研究使用454高通量的焦点测定数据发现，与在治疗前收集的样品相比，在非霍奇金淋巴瘤的化疗中收集的15个粪便样品中的α多样性指数（信仰的系统发育多样性和观察物种）均显着降低[28］.同样，一项小型研究(n= 11)在混合盆腔癌患者中，采用454高通量焦糖测序，发现盆腔放疗后的Shannon多样性指数较放疗前显著降低[14］.有趣的是，一项横断面研究比较了33名健康个体、17名结直肠癌(CRC)患者治疗前、14名接受化疗的CRC患者和5名手术后的粪便微生物群，但发现组间alpha多样性指标无显著差异[29］.尽管如此，我们的研究结果表明，肠道中的细菌群体的全球平衡响应于遗传毒性压力，例如CRT。

我们对细菌多样性随时间变化的调查揭示了一个新的发现:在CRT的中间，疲劳参与者中观察到的OTUS多样性低于非疲劳参与者。如前所述，一项初步研究表明，接受盆腔放疗的癌症患者的肠道微生物紊乱/生态失调可能预测腹泻和疲劳恶化[14］.其他作者试图证明在其他疲劳条件下(如肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合征(ME/CFS))微生物多样性与行为症状之间的关系[30.］.例如，一项研究报告称，ME/CFS患者与健康人相比，肠道微生物组的多样性减少，组成改变[30.］.进一步的纵向研究应该确定肠道微生物多样性的减少或治疗期间的时间是否是crt相关性疲劳的最重要驱动因素。

我们的初步类群分析结果发现，在CRT的中间，疲劳参与者肠道中存在的大多数细菌为变形菌门从埃希氏杆菌属属，可能包括潜在的病原体，如大肠杆菌．大肠杆菌和沙门氏菌通常在发烧的住院癌症患者的血液培养中增殖[31］.的一些压力大肠杆菌特别是在免疫功能低下的癌症患者中，它们与潜在的严重和危及生命的感染(如UTI)有关[32]，包括急性和慢性腹泻(如肠致病性和肠出血性)大肠杆菌腹泻(33，或血液感染)[34］.例如，一项研究(使用实时荧光定量PCR来量化细菌)观察到，大多数化疗引起的腹泻患者的菌群组成增加大肠杆菌减少了乳酸杆菌种虫害和拟杆菌与健康志愿者相比[33］.此外，一些菌株大肠杆菌与结直肠癌肿瘤大小呈正相关[35］.此外，一些证据表明大肠杆菌非酒精性脂肪性肝病中肠屏障完整性受损、炎症和潜在肝毒性事件[36］.这是值得注意的，因为也许我们的数据支持疲劳组中存在促炎环境的假设，这被显著较高的相对丰度所证明拟杆菌门和属拟杆菌与CRT结束时不疲劳的参与者相比。在门水平，增加拟杆菌在肠易激综合症等肠道炎症性疾病中有报道[37]及非酒精性脂肪性肝病[36］.有趣的是,拟杆菌属可能包括潜在的病原体，如脆弱拟杆菌．事实上，最近的一篇文献综述表明，肠毒素菌株脆弱拟杆菌不仅与结直肠癌相关，还与菌血症、结肠炎、腹泻、败血症、全身感染、全身炎症和神经系统疾病(如阿尔茨海默病)相关[38］.后一项审查还强调了其中一个机制脆弱拟杆菌可以与全身炎症有关，神经变性可能与能力有关脆弱拟杆菌分泌神经毒素，如促炎脂多糖BF-LPS。相反，一些菌株Faecalibacterium(在疲劳的参与者中也明显丰富)例如f . prausnitzii［39和一些示波螺旋藻［40都与抗炎特性有关。

我们还证明，在治疗过程中，非疲劳参与者肠道中的大多数细菌是由两个不同的门代表的疣微菌门门(Akkermansia属，一种有益的微生物)和厚壁菌门门(瘤胃球菌属属和示波螺旋藻属)。这是很重要的Akkermansia已被报道在肠道中具有抗炎作用和增强肠道屏障功能[41］.更具体地说，有人建议答:muciniphila粘附于肠上皮细胞，增强上皮细胞层的完整性，从而产生良好的肠免疫[42］.此外，产生丁酸盐的属，如示波螺旋藻在治疗期间未疲劳的参与者和治疗结束时疲劳的参与者中均检测到[40］.一个有趣的事实是，动物研究表明，丁酸补充剂通过减轻炎症和降低内毒素水平，改善肠道屏障功能[43］.值得注意的是，我们的研究还确定了治疗结束时的非申请参与者显示了一个乳酸杆菌粪便标本占优势，可能代表一段时间的临床稳定。订单Lactobacillales包括物种(例如,乳酸杆菌，Lactococcus,肠球菌（物种）与酸性环境的产生有关，酸性环境抑制有害细菌对几种物种的生长[44].此外，该属的一些菌株乳酸杆菌（例如：。，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌)已被发现具有益生菌特性[44，以改善肠道炎症[45，并改善肠道屏障功能[46在动物模型中。相反，丰富的示波螺旋藻和瘤胃球菌属与衰老有关[47］.值得注意的是，需要进行全面的分子分析研究，以确认和确定某一组细菌在crt相关性疲劳和其他共存症状(如睡眠障碍、抑郁、焦虑、疼痛和认知障碍)以及crt诱发的胃肠道症状(如粘膜炎、恶心及呕吐)[13，33］.

与我们的预期相反，我们的初步研究发现，CRT之前的肠道微生物变量在预测治疗急性期疲劳方面的准确性较低。这种较低的准确性部分是因为我们的样本量适中。也可能是其他变量可能与疲劳有更强的关联(如抑郁、白蛋白水平、炎症标志物(如触珠蛋白、白细胞介素-1受体拮抗剂、可溶性肿瘤坏死因子受体2水平)，和失控腹泻，[14，22，27，48)均未纳入分析。尽管如此，我们的研究为将来在更大的样本中验证和优化分类器/模型奠定了基础，可能包括一组健康参与者和一项精心设计的纵向研究中的临床数据。区分有或没有疲劳症状的患者，或有可能出现症状的特定微生物组的能力，对个性化药物/干预的发展具有临床相关性。

4.1.限制

该探索性研究的局限包括使用粪便样品而不是肠内容物。但是，粪便样品通常用于研究微生物社区[49，这可能是因为与肠道组织样本相比，这些样本更容易从个体身上获得。本研究的另一个局限性是样本量相对适中;更大的样本量将允许检查其他感兴趣的变量。例如，CRT的细胞毒性效应可能会引起其他副作用/变量(例如贫血、营养状况[50]、胃肠紊乱(粘膜炎、腹泻、便秘;［39)，或外部因素(如:饮食;［51)，解释了胃肠道细菌种群组成和多样性的差异，这些差异可能会影响分析中未包括的疲劳体验;但是，目前正在收集有关这些变量的数据。需要对持续疲劳和生态失调进行更长时间的纵向研究，以验证先前的研究，这些研究表明化疗结束后;细菌数量在几天内就恢复了，有时甚至超过了最初的水平[39］.这些发现可以提供关于在治疗急性期改善疲劳和肠道菌群紊乱的治疗努力的信息。在RC的背景下，本研究的另一个局限性是没有相关因素的数据，如肿瘤特征(如位置和大小)[49)或手术恢复(例如，缺血/再灌注[52)，除了其他伴随治疗(如CRT)外，还可影响肠道微生物群和肿瘤微环境。

5.结论

在我们的初步研究中，我们扩展了CRT过程中肠道菌群扰动及其与疲劳关系的知识，为未来的机制研究提供了基础。我们的初步结果表明变形菌门，厚壁菌门,拟杆菌疲劳参与者的优势门是什么埃希氏杆菌属，拟杆菌，Faecalibacterium,示波螺旋藻是疲劳参与者中最多的属。纠正生态失调的一个可能途径是使用益生菌[44，这可能是我们未来研究的一部分。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

信息披露

内容完全是作者的责任，并不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)的国家护理研究所(NINR)的支持，奖励号为F32NR016618。特别感谢坦帕总医院癌症中心的所有工作人员，降临健康癌症中心，坦帕湾;圣约瑟夫医院癌症研究所;Tome和Ubiñas放射治疗中心;还有肿瘤医院的艾萨克·冈萨雷斯·马丁内斯医生让我接触他们的病人如果没有“参与者”，我们就不可能完成这项研究，我们最衷心地感谢那些毫不犹豫地参与这项研究的志愿者。此外，特别感谢波多黎各大学综合癌症中心波多黎各组学中心的工作人员，感谢他们在生物信息学方面的支持。

补充材料

S1表:不同化疗方案参与者CRT中后期alpha多样性指标比较;治疗结束(5-Fu n=13;口服卡培他滨n = 9)。表:各疲劳组(非疲劳组和疲劳组N=7，疲劳组N=15) CRT结束时α多样性指标的比较。（补充材料）

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