蛋白质组学技术的发展及其对癌症领域的贡献

文摘

系统的癌症基因组的研究近年来产生丰富的知识。这些研究已经发现了一些新的癌症基因不是之前所知因果目标癌症。遗传标记可用于确定肿瘤发展倾向,但分子靶向治疗策略对于大多数癌症并不普及。精密护理方案还必须开发通过理解和实施基础科学研究临床治疗。蛋白质组学发现继续取得重大进步的基本生物过程以及最近的过渡到一个试验平台能够测量数以百计的蛋白质在任何生物系统。因此,蛋白质组学可以将基础科学发现转化为精密医学的临床实践。蛋白质组学领域的进展速度快过去五年在技术、应用的广度和深度在生物科学的所有领域。之前的一些实验技术方法被认为是黄金标准的今天,和社区正试图与体积和生成的数据的复杂性。这里描述的贡献一般蛋白质组学和生物质谱仪特别是癌症研究,以及相关专业技术和概念的发展领域。

1。介绍

虽然癌症研究的进步显著延长我们了解癌症的发展,发展,和通过,预计近600000美国人将死于2013年超过200类型的癌症之一。此外,由于过度的75%的癌症诊断发生在55岁以上,这部分人群规模增加,癌症相关的死亡人数在未来将大幅增加。因此,癌症预计将很快成为美国的第一大疾病杀手。这一趋势也观察到在全球范围内,据估计,2030年,全世界超过1300万人将死于癌症1]。而大量的资源用于癌症研究,癌症的复杂性和多方面的性质反映了障碍解开癌症的病因和控制并最终治愈这种衰弱疾病。癌症的异质性和复杂性发展源自基因畸变和免疫学的复杂的相互作用,激素、环境、和其他因素,不论是单独或共同行动构成癌症的标志。

蛋白质组是几乎所有的生物功能的操作机器;正是其丰度和交互控制和基因与表型之间的关系。蛋白质可以出席截然不同的丰度,表示在不同的大小,形状,和费用,更复杂的20个氨基酸形式与四个核苷酸的基因组本身。它经历了动态变化在不同的细胞,组织和器官在开发期间,以响应环境刺激和疾病过程。理解蛋白质的动态交互与其他蛋白质,核酸,代谢物是描述生物机制的关键和理解疾病包括癌症。基因组测序近几十年来一直是关注的焦点,产生了大量的信息。然而,蛋白质功能的组件控制细胞的过程。此外,DNA或转录水平的变化与蛋白质丰度并不相关2]。因此,蛋白质组学的桥梁之间的差距和功能蛋白质和基因组信息转换这些信息。可能系统地量化蛋白质丰度位置异构改变蛋白质组学监测多个途径和机制,推动恶性表型的转换。蛋白质组学可以被认为是癌症研究的一个组成部分来确定生物标志物检测患者在早期阶段,监测肿瘤的药物反应,理解机制,导致癌症发病机理,设计新的疗法。因此科学家和肿瘤学家使用各种蛋白质组学工具,设计实验,并解释蛋白质组学的结果来确定致病机制,指导预测,甚至为癌症治疗开发精密医学。

2。基因组学

蛋白质的一个关键的角色在实现全部潜能的人类基因组计划(HGP)是连接基因组正常和疾病表型。计画改变了人类生物学和医学研究的许多方面,包括癌症。尽管有很多怀疑论者,大胆的计画变成了现实的目标和新的技术平台3]。先进的测序技术平台大大改变了所有生物的基因和基因调控的研究(4]。计使得所有基因的生物学家通过提供一个列表部分基因和假定的蛋白质产品和刺激的新视角通过系统生物学研究生物进化过程。此外,计画已经帮助创造全新的商业部门和高吞吐量的仪器、试剂、和服务和大型数据集打开门,开源数据以及生物信息学的大规模应用。场已经改变了我们思考癌症诊断和靶向治疗。尽管这些成就的怀疑论者仍担心改变公共卫生的进展缓慢。

内源性和外源性刺激可能导致逃避细胞的正常调节机制与最终异常表型使癌细胞增殖、侵袭和转移。肿瘤含有内源性畸变,在很大程度上是由体细胞基因组的改变导致致癌基因的突变和/或肿瘤抑制(5]。例如,删除,插入拷贝数变化,突变可以推动癌症的发生和发展6]。基因组学、基因表达的全面的大规模分析生物标本来确定他们对疾病或治疗,尤其自2005年以来增长。新类型的测序仪器允许惊人的加速度数据收集率DNA测序等商业制造商包括平台介绍了大规模并行测序(MPS)。例如,单一的工具可以生成数据解读整个人类基因组中只有2周。预计工具,将进一步加快整个基因组测序数据生产时间表天或小时将在不久的将来成为现实(7]。

今天在基因组学的主要挑战是理解分子畸变的作用在癌症等各种疾病(8]。癌症基因组图谱(TCGA)项目(http://cancergenome.nih.gov/),国际癌症基因组协会(http://www.icgc.org/)旨在确定人类癌症的基因畸变类型和他们的角色在癌症的病理生理学。TCGA作为一项为期三年的飞行员在2006年由美国国家癌症研究所(NCI)和国家人类基因组研究所(NHGRI)在美国。TCGA计划项目证实,一个图谱的变化可以被创建。它也证明了网络的研究和技术团队可以池他们的努力的结果和发展基础设施进行公开的数据。此外,它证明了公共数据的可用性将使研究人员能够验证重要的发现。试点的成功领导了美国国立卫生研究院(NIH)提交TCGA主要资源收集和描述超过20个额外的肿瘤类型(http://cancergenome.nih.gov/)。最终目标是将基因组学数据转化为临床应用,如常规临床医学筛查和精度。

癌症和诊断分类是基于细胞形态学和组织学结构。然而,患者类似的组织病理学,癌症分期和治疗临床结果显示变量。这样的方法是主观的和容易解释的变化,和病理学家并不总是同意诊断。因此,为癌症诊断工具已经从组织学和鱼方法如基因测试,微阵列,染色体核型分析。例如,基因表达谱可以作为独特的分子签名来帮助诊断和组织病理学分类相似的肿瘤为生物不同的亚型(9]。分子特征可以用来识别高危患者发生和穷人生存和接收靶向治疗。Mammaprint是食品和药物管理局(FDA)批准了乳腺癌复发芯片测试(10]。Oncotype DX分析用于预测遥远的复发的风险在浸润性乳腺癌(11]。最近的一个例子预后预测的基因签名阶段II和III大肠癌ColoPrint [12]。除了生物标志物,基因组学已经导致新发现的基因不是之前所知因果作用导致癌症和癌症治疗(3]。第一批测序的努力都集中在受体酪氨酸激酶(rtk)在2000年代早期。研究表明BRAF变异在50%的黑色素瘤(13),PIK3CA在乳腺癌和结肠直肠癌的25% - -30%14),EFGR 10% - -15%的非小细胞肺癌(15- - - - - -17]。有趣的发现导致了对药物开发和临床治疗产生重大影响,包括选择性皇家空军和MEK抑制剂的发展产生了显著缓解黑色素瘤和目标的能力使用表皮生长因子受体抑制剂的子集肺癌病人那里获得益处。

3所示。蛋白质组学的挑战

以此类推,民主化的蛋白质的研究产生了更深更广的零件清单,使系统生物学以及破译蛋白质相互作用和生物信号调解生理和病理条件下可以产生重大影响医学平行于基因组计划(4]。这可以采取的形式分类的所有组件,单个蛋白质功能化,将零件放入相关的网络和电路和学习这些网络集体过程和实施恐怖活动。基因组计划确定所有推理的基因和蛋白质。现在的挑战是如何将这些实体是集成到分子机制导致表型。不可或缺的组成部分,该系统的方法是要求技术可以系统地识别和量化所有蛋白质,蛋白质亚型和蛋白质相互作用。蛋白质可以采取许多不同的形式,例如,转译后的修改(天车)单核苷酸多态性(snp),和可变剪接的蛋白质,导致众多个人初级产品的不同结构,使蛋白质组的尺寸远远大于人类基因组。基因组学无法通知和描绘这种蛋白质多样性及其功能的后果。

质谱平台实验的主力是蛋白质蛋白质组学分析和在过去的五年中已经有重大进展在灵敏度,吞吐量,蛋白质组分析的类型和深度。创新的目标都集中在提高信号/噪声识别和测序肽,检测和量化与天车特定的肽,单核苷酸多态性,或拼接,提高吞吐量分析有用的临床和人口研究。另一个领域是能够研究蛋白质组变化的动力学(浓度和结构)来响应外源信号和疾病。有两种主要蛋白质组学平台:基于探索与目标蛋白质组学工作流。基于探索蛋白质组学,检测到成千上万的蛋白质的混合物,一直在研究的标准方法分析生物样品中蛋白质含量可能会导致蛋白质的发现候选人与诊断、预后和治疗价值。在实践中,这种方法需要大量的资源和时间,并不一定代表研究员宁愿研究的目标的一个子集,这些蛋白质在不同生理条件下发现的。在这种背景下,针对蛋白质组学中发挥着越来越重要的作用在生物样品中的蛋白质的精确测量目标的期望阐明细胞功能的分子机制的理解复杂的蛋白质网络和通路(图1)。

4所示。基于探索蛋白质组学的发展在癌症

蛋白质组学技术包括一系列的方法如电喷射ionization-liquid色谱串联质谱法(ESI-LC-MS),基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF),表面增强激光解吸电离飞行时间(SELDI-TOF), MALDI女士成像(MALDI-MSI)、二维凝胶电泳(2 de)、激光捕获microdissection-MS (LCM-MS)和蛋白质微阵列,可用于获得重要的生物信息来帮助科学家和临床医生在理解他们的系统的动态生物感兴趣的癌症(如18- - - - - -20.]。

4.1。ESI-LC-MS

ESI-LC-MS技术产生的气态离子携带分析物byapplication电势的流动液体的热量。这导致喷在高电压的形成,导致水滴成为带电。水滴最终成为不稳定andexplode为更精细的水滴,随后导致分析物离子的解吸,然后传递给相仿的光谱仪(21]。大多数类型的质量检测系统可以用于应急服务国际公司包括TOFs、离子陷阱(它的),和四极。这种技术可以采取多种形式如label-free或同位素标记(代谢标记,¹⁸O标记),和化学标签(同位素亲和标签编码(ICAT),等压标签(iTRAQ),串联质量标签(TMT)和二甲基标记)。

以下4.4.1。Label-Free

定量方法是相对便宜和更容易执行。这种方法使用光谱测量的频率计数的肽测序了感兴趣的女士,也就是说,光谱的数量为每个肽或蛋白质与蛋白质样品的数量成正比。这种方法可以用于生物标志物的发现通常需要从多个质高样品处理量比较峰值强度数据22,23]。许多研究已经使用label-free等癌症的蛋白质组学比较蛋白质组学分析非小细胞肺癌的24),与转移相关的蛋白质在档案黑色素瘤石蜡包埋25]。应用该方法分析复杂生物样品中蛋白质的丰度的变化有一定的局限性。例如测量小数量的变化low-abundance蛋白质,这通常是戴面具的抽样误差,是很困难的。然而,该方法具有良好的线性动态范围约为三个数量级。此外,运行运行分析的样品可以表现出峰值强度的差异多肽由于样本处理需要规范化。额外的问题可能包括实验在保留时间漂移和米/z(质荷比)复杂精确的比较多个质数据集,色谱变化由于多个样品注射到相同的反相高效液相色谱柱,和不结盟的峰值比较导致大变化,定量不准确。同时,大量的数据采集在质/女士需要这些光谱数据分析的自动化。开发了计算机算法来解决这些问题,并自动比较峰值强度之间数据质综合规模的样本(26,27]。

4.1.2。同位素标记

同位素标记可以是在活的有机体内或在体外通过将稳定同位素成蛋白质或肽进行比较分析。标签技术允许复用多个样品进行分析和减轻实验固有的可变性样品处理。(我)代谢标记。在这个在活的有机体内细胞培养方法与媒体包含isotopically标记氨基酸(13 c和15 n)合并到蛋白质组在细胞生长。在这个方法中需要新陈代谢活跃细胞,种植不同的标签样品氨基酸可以集中进行分析28]。最近在细胞培养中稳定同位素标记的氨基酸(SILAC)老鼠的饮食包含自然或13 c6-substituted介绍了赖氨酸的版本(29日]。女士没有影响增长或行为,分析整合水平允许的决心将利率从血液细胞和器官的蛋白质。曼氏集团也推出super-SILAC方法相结合的混合五SILAC-labeled细胞系与人类癌组织。这个生成的成千上万的isotopically标记肽在适量作为内部质量标准spectrometry-based分析(30.]。Super-SILAC可以扮演一个角色在扩大相对蛋白质定量方法的使用,进一步提高我们理解癌症生物学和生物标志物发现的工具31日]。的一些缺点代谢标记在细胞培养基包含不完整的标签,会影响相对定量准确,标签的蛋白质需要净化,蛋白质氨基酸前体代谢不稳定性,营业额(32]。(2)蛋白水解¹⁸O标记。在这个技术¹⁸O是注册在蛋白酶解(33]。微分¹⁶O /¹⁸O编码依赖于¹⁸O交换两个¹⁶O原子通常被两所取代¹⁸O原子通过酶催化oxygen-exchange的H₂ 。结果2 - 4 Da质量不同标记肽离子之间的转移允许识别、描述和定量的蛋白质肽proteolytically生成(34]。¹⁸O标签熊至少有两个潜在的缺陷:不均匀¹⁸O合并和无法比较多个样品在一个实验。与化学标签ICAT等方法,¹⁸O标记样本有限的简单操作。便宜得多比ICAT SILAC,比较蛋白质所需的试剂价格标签。SILAC可能培养细胞的标记的首选方法,¹⁸O标记可用于样本有限的可用性等人体组织标本(34]。ICAT相比,¹⁸O标记不赞成肽包含特定氨基酸(如半胱氨酸)也不需要额外的亲和力一步丰富这些缩氨酸。与iTRAQ不同,¹⁸O标签不需要特定的平台也不取决于碎片光谱女士(MS²定量肽)测量。它是适合人类标本的标签(如血浆、血清和组织),代表一个限制的代谢标记方法(例如,SILAC)。综上所述,最近的进步的同质性¹⁸O合并,改进了算法用于计算¹⁶O /¹⁸O比率,这种技术固有的简单性使这种方法的合理选择蛋白质组学分析人类的标本(如血浆、血清和组织)领域的生物标志物的发现。(3)化学标记。至少三种方法的化学标签在使用:ICAT, TMT, iTRAQ。ICAT试剂包含三个元素:一个亲和标签(生物素),用于隔离ICAT-labeled肽;链接器,可以将稳定同位素;和活性基团与特异性对硫醇团体(半胱氨酸)。试剂以两种形式存在,重(包含八个氘),光(不含氘),导致之间的8大分子量的差异两种不同形式的标记。量化蛋白质差异表达的蛋白质混合物结合和proteolyzed肽和ICAT-labeled肽分离利用生物素标记。这些多肽是由液相色谱分离。轻型和重型ICAT-labeled肽co-elute的一对,和8 Da质量差是测量扫描质谱计。原数量的蛋白质的比例严格维护两个细胞状态的肽片段。相对量化是由肽对的比率。 The protein is identified by computer-searching the recorded sequence information against large protein databases [35- - - - - -37]。ICAT标签技术的主要缺点是,它只与半胱氨酸残基结合,构成大约1%的蛋白质成分。类似于¹⁸O标记,ICAT有一定的限制,即只有两个标签,导致频繁的实验和高成本如果多个样本需要比较。多路复用的试剂对蛋白质定量分析已经发展,使更多的比较治疗包括开发4 -或8-plex等压标签(iTRAQ) [38)和2 -或6-plex TMT (39)标记技术。前者可以比较八,后者6个样品在一个分析。在这些方法中,N-termini和赖氨酸肽都贴上不同等压质量的试剂等,所有衍生肽等压,无法区分。不同的质量标签只能区分在肽的碎片。每个标记添加一个相同质量给定的肽,每个肽只产生一个峰值在液相色谱,因此只有一个m / z将孤立的碎片。不同的质量标签只单独的碎片,当记者离子生成典型的为每个不同的标签。离子强度的比例不同的记者被用作定量读出。这些方法的一个缺点是只有一个碎片光谱/肽可能是可用的,而在quantitation-based MS1扫描,多个数据点采样导致整体灵敏度较低。这些技术的一些额外的缺点是标记效率和高成本的不一致的试剂。使用标准操作协议(安抚)建议与iTRAQ实现可再生的和可靠的结果,因此减轻潜在的变化由于多步样品准备工作(40]。iTRAQ也可能在动态范围的局限性;通常实验报告褶皱的变化小于2数量级。从纯技术的观点来看,这可能被视为一个限制的iTRAQ定量蛋白质组学(41- - - - - -43]。

很明显,标记和未标记分析女士将继续使用。稳定同位素标记提供更高质量的数据分析。和标记方法,如iTRAQ,介绍了标签这么晚在实验的过程中可以执行比早些时候标签方法快得多。即便如此,这是一个更具有挑战性的技术比label-free技术也容易产生系统误差。选择同位素标记技术是高度依赖于实验设计,一个特定范围的分析,和被分析的样品或系统。

在技术层面,仍有进步的空间。在蛋白质组学可以表现为三个因素:离子注入效率,循环速度和探测器灵敏度。而敏感的探测器已经在检测单个离子的水平,汇集的过程的离子检测器可以改善。尽管改善喷雾离子注入,大部分离子仍在他们的探测器。此外,不能过滤掉无关的分子导致产生很大的噪音。改进在这些领域可以增强信号/噪声比。此外,加快循环率(每秒光谱)的数量可以增加测量深度。鉴于宽动态范围,这可以导致量化最大蛋白质样品中(44]。

4.2。MALDI-TOF

MALDI-TOF女士是一个平台,飞行时间质量分析仪通常加上谱。离子被电场加速离子分离根据他们紧随其后米/z比率通过测量时间离子穿过飞行管。具体来说,米/z离子的比率成正比的平方与重离子漂移时间长时间旅行。谱的样品是均匀混合在一个大数量的矩阵。矩阵吸收紫外线并将其转换成热能。一小部分矩阵的快速加热,蒸发,连同样品(45]。MALDI-TOF-MS已经成为一种普遍和通用的方法来分析大分子的范围广泛的样本。使解除吸附能力高分子量分子及其精度高和敏感性,结合其质量范围宽(1 - 300 kDa),使MALDI-TOF-MS方法选择临床化学实验室的生物分子的识别在复杂样品,包括多肽、蛋白质、低聚糖、寡核苷酸(46,47]。第一个MALDI-TOF-MS生化分析的报告发表在1980年代末从卡拉斯和Hillenkamp实验室45]。虽然是相对年轻的与其他使用质谱分析技术相比,有一个巨大的增长的出版MALDI-TOF-MS文献中方法和应用。应急服务国际公司可以有效地与分离技术提高其界面的角色在生活和健康科学,MALDI,然而,有生产单电荷离子的优势肽和蛋白质,减少光谱的复杂性。

4.3。SELDI-TOF-MS

SELDI-TOF-MS技术介绍了1993年由Hutchens和叫喊声481997年),后来Ciphergen商业化的生物系统。SELDI-TOF-MS是谱技术的一种变体,它使用一个目标修改达到生化亲和力与样品的蛋白质。有两种技术之间的差异。谱技术,样品与基质混合溶液中的分子,和少量的混合沉积在表面干燥。这使得样本矩阵溶剂蒸发后共晶。另一方面,在SELDI,混合物是发现与化学表面改性亲和力等功能。有不同类型的数组绑定到蛋白质化学成分和物质,包括抗体、受体、配体、核酸、碳水化合物,或色谱表面(即。、阳离子、阴离子、疏水或亲水)。还是湿的,一些样品的蛋白质会绑定到修改后的表面,而其他人则会冲洗掉,然后矩阵应用于样品表面的结晶的肽。在绑定和清洗步骤的表面束缚蛋白质分析。样品上发现一个SELDI TOF表面进行对比分析,质谱(TOF-MS) [49,50]。这项技术的力量的集成芯片上的选择性捕获,相对定量,部分表征蛋白质和多肽。微分表达式数据获得这项技术已被用于识别的生物标志物候选人各种癌症类型,如前列腺癌(51,52),胰腺(53- - - - - -55)、肺(56- - - - - -58],乳腺癌[59- - - - - -61年],黑色素瘤[62年),结肠(63年,64年),卵巢65年- - - - - -67年),和肝癌68年,69年]。

4.4。MALDI-MSI

MALDI-MSI调查的分布是一个功能强大的技术,允许直接从组织切片(蛋白质和生物分子70年,71年]。这种方法还允许调查等生物分子的空间和时间分布的磷脂不需要提取、净化和分离过程的组织部分(72年]。MALDI-MSI有助于在分子诊断肿瘤的组织环境中直接,可以检测肿瘤边界或邻近的正常组织的渗透。还有助于发现早期病理显示没有组织学现场修改,防止肿瘤复发的手术切除。的进步之一MSI的相关谱与组织学图像信息。MALDI-MSI软件(73年这套装置)谱图像在宏观或微观光学图像谱测量之前的样品。MALDI-MSI已用于临床蛋白质组学的生物标志物的发现各种疾病包括癌症(74年- - - - - -78年]。发展安抚和标准化的协议样本采集、存储、数据采集,提高成像分辨率和3 d肿瘤映射仍需要进一步提高其效用(79年,80年]。也是目前水平的敏感性允许一小群细胞的检测,但不足以检测离散修改在单个细胞水平。MALDI-MSI将其耦合的一大进步,正电子发射断层扫描、x射线、计算机断层扫描仪器,和MRI的临床前和临床研究。非侵入性技术和分子数据之间的互补性获得MALDI成像女士将导致一个更精确的诊断81年]。最终比较肿瘤的MRI图像,生成的图像MALDI-MSI在分子水平上提供一个全面的诊断和治疗选择的数据集。

4.5。2 de

二维或二维凝胶电泳技术是一个关键转折点领域的分离和已被证明是可靠和有效的方法基于质量和电荷分离的蛋白质(82年]。高分辨率二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2 d-page)可以解决10000个蛋白质斑点凝胶。这种技术已经被用于人体组织、血浆和血清蛋白质组分析之前分馏(有或没有83年- - - - - -86年]。可视化的解决蛋白质凝胶染色方法可以执行诸如Coomassie蓝色和银色染色(87年,88年]。最近的一些进展银染色产品使其兼容MS分析。使直接比较不同的蛋白质混合物,微分为胶液电泳(消化)开发许可证同时比较标记蛋白质在不同的混合物。在一个典型的实验中,两个样品用不同的荧光染料标记(Cy3和Cy5)和混合之前电泳和并行运行一个内部标准标记与第三染料(Cy2)定量分析(89年,90年]。

用于识别目的,gel-separated蛋白质可以被消化成肽。多肽的分析可以提供一个肽质量指纹(及),可对理论指纹序列在蛋白质数据库中搜索。另外,肽可以喷成串联质谱(ESI)为他们洗提了液相色谱(LC)列。可以寻找蛋白质序列数据,分析了算法的应用和比较蛋白质数据库的理论生产光谱(91年,92年]。

2 d-page吞吐量较低技术、劳动密集型的低动态范围,和容易gel-to-gel可变性。虽然消化显示出更高的精度,但它仍然是一个相对较低的吞吐量的方法。它可以用于生物标记等领域发现,样品的高通量处理不是必需的(93年]。

4.6。LCM-MS

LCM-MS已经证明有效的技术收获纯细胞的数量由组织部分。因为蛋白质组变化在不同的细胞,激光捕获显微解剖的出现扩大了microproteomics的分析功能,使蛋白质从非常小的样本分析。典型的协议使用纳米液相色谱/串联质谱(nano-LC-MS / MS)同时识别和量化数以百计的蛋白质从LCMs组织部分小型组织样本包含只有1000个细胞。LCM-dissected组织受到蛋白质提取,减少,烷基化,和消化,然后注入nano-LC-MS / MS系统色谱分离和蛋白质鉴定。二次筛选的方法可以验证使用免疫技术如免疫组织化学和免疫印迹(94年]。

LCM大大提高了分析功能比较蛋白质组学技术在某种程度上,2 d-dige和定量gel-free质谱方法已经与中国大陆不同的蛋白质组分析,纯细胞群(95年- - - - - -101年]。小型化的LCM技术允许数以百计的蛋白质的提取和分离和检测蛋白质(100 - 300)从不同的细胞群包含只有1000个细胞。此外,它可以检测和验证健壮的蛋白表达差异不同的细胞群。与传统蛋白质组学技术、LCM过程需要1 - 2μ克蛋白质。然而,每一步的过程需要更大样本量减少护理。在提取分离蛋白质损失成为更重要的蛋白质检测极限(< 0.75μ(g)是接近94年]。打孔切片等方法可用于microdissect组织蛋白质组学分析(102年),但因为边界的三维视角的组织结构是有限的,打孔切片样本可以相邻地区不感兴趣的。在最近的一篇论文发表的穆勒et al。103年],作者声称,数据来源于nonmicrodissected多形性胶质母细胞瘤(GBM)可能会导致不准确的基因组和蛋白质组数据之间的相关性和随后的错误分类。这是因为分子信号可以掩盖,肿瘤样本内容较低或基质细胞中的信号强的地方。米勒等人研究了39胶质母细胞瘤样本组织TCGA之前分析的项目。使用反向阶段蛋白质阵列(RPPA)他们测量了133个蛋白质和磷蛋白质的水平,比较中国大陆和non-LCM样本,发现不同的两种类型之间的分析物的44%。他们专门深入研究基因组和蛋白质组数据对表皮生长因子受体(EGFR)和磷酸酶和tensin同族体(PTEN),两个临床重要的蛋白质在胶质母细胞瘤。尽管研究人员观察到在两个样本类型增加了表皮生长因子受体蛋白质和磷蛋白质含量增加患者表皮生长因子受体基因拷贝数,他们观察表皮生长因子受体磷酸化的增长预期EGFR突变携带者只在中国大陆样本。在PTEN的案例中,研究人员观察到预期的减少PTEN水平深PTEN的损失或PTEN突变的肿瘤仅在中国大陆样本。另外,他们发现预期的相关性EGRF磷酸化,PTEN的水平,一种蛋白激酶的磷酸化只在中国大陆受到前两种蛋白质样品。米勒等人还研究了蛋白质组学数据之前生成的胶质母细胞瘤,TCGA使用non-LCM样本,又未能观察到预期的相关性PTEN拷贝数或突变状态和PTEN蛋白的水平。作者建议谨慎前期细胞浓缩biospecimens靶向治疗的基础形式选择(103年]。LCM技术应该进一步发展促进特定的细胞亚型的有效采样在高吞吐量的方式组织。

4.7。蛋白质微阵列

蛋白质微阵列是一种高通量的工具为研究蛋白质的生化活动,跟踪他们的相互作用,确定其功能大规模[104年]。它的主要优势在于可以并行追踪大量的蛋白质。芯片通常由一个支持表面如玻璃幻灯片,硝化纤维膜,珠,或微量滴定板,捕获蛋白质绑定的数组。最常见类型的蛋白质微阵列可能包含大量的斑点的蛋白质或配体排列在一个预定义的模式中,由机器人排列到镀膜玻璃幻灯片,微型板块或膜。抗体绑定的数组可能由感兴趣的蛋白质(105年),酶与底物相互作用,或基板或配体相互作用应用蛋白质。因此,蛋白质微阵列格式可以分为两个主要的类取决于固定化支持表面。forward-phase蛋白质阵列(FPPA)捕获抗体首先是固定在固体表面捕获一个测试样品中相应的抗原。捕获的然后直接与荧光检测分析物dye-conjugated检测抗体或检测间接检测抗体,后跟一个荧光dye-conjugated第二抗体(106年]。在这种方法中,识别捕获和亲和试剂可以检测耗时。绕过两个亲和试剂,要求反相蛋白数组(RPPA)可能提供一个可选择的解决方案。RPPA,测试样品可能达到数千直接印在幻灯片和发现dye-conjugated抗体(107年]。RPPA化验中常用的组织微阵列和细胞溶解产物和组织微阵列。RPPA提供了一个高吞吐量的平台时,特异性可能妥协在某种程度上由于使用单一检测抗体。

一个技术生产一系列可靠的缺点是保质期。大部分的蛋白质阵列使用存款和固定在支持表面抗体可以变性抗体和影响其识别属性。芯片制造商面临的另一个瓶颈是获得高质量和特定的人类蛋白质组的每一个蛋白抗体是一个巨大的任务。除了有限的库存特定抗体的铝(如磷酸化和糖基化),代高通量蛋白质表达系统和净化包括那些与天车定位所需完整的蛋白质组研究是另一个挑战或可能遭受缺乏再现性。建立标准的标准阵列生产使用噪声模型和数据标准化,方差估计和微分表达式分析技术将改善芯片结果的解释(108年]。

生产蛋白质的数组的挑战了一种新颖的方式蛋白质微阵列技术的发展被称为核酸蛋白质可编程阵列(光面)使用提取游离转录和翻译目标蛋白质的互补编码直接到玻片上。这种方法消除了纯化蛋白质的需要,避免在存储蛋白质稳定性问题,并捕获足够的蛋白质功能研究(109年,110年]。在最近的研究软羊革加上女士和用于多个应用程序,包括潜在的磷酸化肽序列的识别以及高通量方法检测蛋白质相互作用[111年]。此外,固体表面构建数组的挑战着成千上万的蛋白质具有不同的属性提高兴趣protein-interaction化验的解决方案。Suspension-bead化验特别灵活,因此悬浮平台开发等Bio-Plex系统从Bio-Rad实验室使用Luminex bead-based xMAP技术(112年从试剂盒工具]LiquiChip系统一样。Suspension-bead数组是足够灵活,可以处理任何类型的protein-ligand交互通过耦合所需的蛋白质或配体不同的珠子数量。Luminex珠子,例如,使同时定量的100种不同的生物分子在一个微型板块。而不是一个平面,Bio-Plex化验使用不同探测珠集作为底物在溶液中捕获分析物和采用荧光方法检测113年]。

5。针对不同蛋白质组学的发展在癌症

领域的生物标志物,尤其是已经大大受益于蛋白质组学平台的应用在过去的十年或更长时间,目标识别简单的非侵入性的测试,可以表明癌症风险,允许早期癌症检测,分类肿瘤病人可以得到最合适的治疗,监测疾病进展,回归和复发。各种biospecimens等组织,近端体液和血液审问了蛋白质或肽标记识别。成千上万的出版物探索个人的潜在使用蛋白质或蛋白质癌症生物标记物的集合,产生了有前景的结果(114年,115年]。一项研究由波兰斯基和安德森(116年)已经确定> 1261蛋白生物标志物癌症候选人。然而,只有23个蛋白质等离子体生物标记已经扫清了美国食品和药物管理局(FDA)自2003年以来平均临床生物标志物< 2蛋白质在过去的12年里,每年在化验至少96分析物被开发并用于检验科已经得到了(LDTs) [115年]。尽管最近的技术进步,仍有巨大的临床相关的生物标记物的识别分析的挑战在血清或血浆。雪上加霜的缺乏分析验证平台(s)的精确和准确的测量确定前一组较小的临床样品中分析物进行昂贵和耗时的大规模临床试验(图2)。临床蛋白质组学技术评估的NCI癌症(CPTAC 1)开发出创新的生物标志物的概念“验证”桥梁发现和验证。这管道有可能使交付高度受到信任的蛋白质生物标志物临床验证候选人(图3)。有针对性的多路复用女士等蛋白质组学技术,蛋白质阵列和酶联免疫吸附测定(elisa)可以填补这一过渡性空间。验证候选人依赖特定的、多路复用定量分析优化选择性检测生物标志物候选人和日益被视为一个关键的步骤,蛋白质生物标记发展管道,桥梁无偏生物标志物发现临床资格(117年,118年]。

5.1。选择反应Monitoring-MS (SRM-MS)和多个反应Monitoring-MS (MRM-MS)

SRM-MS是有针对性的技术,是完全不同的质谱分析方法广泛应用于蛋白质组学发现。SRM是进行专业仪器,使针对感兴趣的特定分析物的肽和提供精致的特异性和敏感性119年- - - - - -121年]。SRM-MS是一个固定的质谱分析技术,进行三重quadrupole-like仪器(QQQ-MS)和collision-induced离解(CID)是用来作为一种手段,提高选择性。在SRM实验两个质量分析仪作为静态质量过滤器,监视一个碎片离子的选择前体离子。与常见的MS-based蛋白质组学,不记录在SRM分析质谱。相反,探测器作为计数装置相匹配的离子选择转型从而返回一个强度值随着时间的推移。在MRM,多个SRM转换可以测量在同一实验色谱时间尺度的不同前体/片段对之间的交替。通常,三重四极仪器周期通过一系列的转换和记录每个转换的信号作为洗脱时间的函数。额外的选择性的方法允许通过监测多个转换的色谱coelution对于一个给定的分析物(122年,123年]。MRM-MS-based化验的示意图表示工作流(±immunoaffinity浓缩的蛋白质或肽)在图中进行了描述4以下各部分将描述。

图4

MRM-MS-based分析工作流(±immunoaffinity浓缩的蛋白质或肽)。SISCAPA工作流使用蛋白水解多肽的代理人各自的蛋白质,如顶部面板示意图,是一个敏感的方法来测量蛋白质浓度使用immunoaffinity浓缩MRM-MS之前代理的肽。实现定量的目标蛋白(s),它们消化组件使用,如胰蛋白酶酶肽。稳定同位素标准(姐姐,蓝色星号)添加到样品在一个已知的浓度进行定量分析。选中的肽然后使用anti-peptide浓缩抗体固定在一个坚实的支持。洗涤和anti-peptide抗体洗脱后,代理肽的量测量相对于稳定同位素标准使用有针对性的质谱。或者,一个完整的目标蛋白质的分析可以从immunoaffinity浓缩使用一个内部稳定从biospecimens isotope-labeled蛋白质标准(红色星号,比如PSAQ方法)和抗体,如面板底部,其次是蛋白质水解和最终目标的定量。

5.2。MRM-MS-Based试验开发蛋白质验证

MRM-MS的量化方法,生物分子一直在使用(例如,药物代谢物(124年,125年),激素(126年)、蛋白质降解产物(127年),和农药(128年])的精度(CV < 5%),但直到最近一直采用蛋白质和肽测量。稳定同位素稀释(SID)女士多反应监测(SID-MRM-MS)已成为一个强大的目标蛋白质组学工具在过去的几年里。MRM质谱被迅速接受的生物医学研究社区所示增加在该地区的出版物的数量在过去的十年里(图5)。它的优点是准确计算蛋白质浓度在一个多路复用和高吞吐量的方式,同时避免与基于抗体的蛋白质相关的许多问题量化(117年]。SID-MRM-MS蛋白质分析基于签名的定量胰蛋白酶的肽作为代理人,唯一代表感兴趣的蛋白质候选人(129年,130年]。提高特异性定量测定的目标分析物在MRM-based化验,选择选择三到五肽/蛋白(131年]。此外,已知的大量合成稳定isotope-labeled肽(重肽),对应于每个内源性肽,作为内部标准肽(即。、稳定isotope-labeled内部标准或SIS)。这些西丝与内生分析物肽同行除了它们的质量(通常6 - 10 Da更多)。为定量,特定的碎片离子信号来源于内源性标记肽相比激增的西丝比率和用于计算蛋白质的浓度(130年,131年]。在SID-MRM-MS SIS的存在可以计算更精确的比例与灵敏度高和宽动态范围。缺乏一个内源性肽信号通常意味着样本中肽的浓度低于仪器的检出限。另外SIS添加的数量应该是优化的经验在一个初步研究,因为这取决于蛋白质的一个示例中的各个元素丰度。高灵敏度和精度,结合具体的定量多路复用的方式,使MRM化验对平移的吸引力和临床研究132年,133年]。针对蛋白质组学也被《华尔街日报》自然方法的方法在2012年(134年]。

有很多优势MRM-based化验,克服传统的主要限制蛋白质免疫印迹等分析技术,包含IHC和ELISA。这些优势包括moderate-to-high吞吐能力,容易多路检测,标准容易合成,干扰是可以避免的,多个实验室的再现性高,使用内部标准和定量。此外,MRM化验分子特异性高,不需要immunoassay-grade抗体(这些蛋白质亲和试剂的开发可为常规量化包括亚型和天车分析物),还有一个大型部署工具的基础。然而,MRM化验不容易生成新创并要求专业知识除了缺乏验证试剂对大多数蛋白质(135年,136年]。在过去的几年中,用于量化蛋白质的方法由MRM稳步发展和广泛部署。最近也有人建议,考虑到绝大多数来自生物样本的蛋白质识别声称仍然来源于西方墨点法,它可能是时间杂志审稿人要求免疫印迹结果,或至少支持这些结果的分析,验证的女士(136年]。

最近在一项具有里程碑意义的论文自然方法,研究人员展示了MRM的发展和应用的可行性可重复测量人类蛋白在乳腺癌细胞溶解产物在三个实验室在两国在两大洲。国际科研合作,调查人员从弗雷德哈钦森癌症研究中心(美国华盛顿州西雅图),Broad研究所(剑桥,麻萨诸塞州,美国),和组成的一个研究小组从韩国科学技术研究所和首尔国立大学医学院(首尔,韩国),报道了645年的发展和应用分析代表319个蛋白质。化验部署在多路复用的方式在至少150肽定量蛋白质组乳腺癌相关细胞株。人员能够显示目标质量spectrometry-based蛋白质组分析可以很容易地实现,以最小的调整,同时保持高水平的性能(精度、精度和重现性),所有临床实施的必要条件。分析的结果能够概括已知的乳腺癌分子亚型归因于和显示的附加价值综合分析确定假定的致病基因。这项研究展示了巨大的承诺目标蛋白质组学以满足生物学家和医学研究人员的兴趣和地址复制从实验室结果的能力137年]。

而女士采用有针对性的方法,如MRM学好生物和生物医学问题进行蛋白质组学的社区,没有共识的标准是可以接受和理解的影响变量产生结果的质量标准。有一个广泛的标准被应用到说一个分析已成功发展。出版物描述目标肽的分析经常女士为读者不包含足够的信息来建立信心,测试工作计划或能应用测试中描述自己的实验室。为了解决这些问题,在美国国立卫生研究院最近举行了研讨会的代表多个社区发展和采用有针对性的女士化验。参与者讨论分析目标的实验和实验证据需要建立他们开发的化验工作的目的和实现所需的性能水平。使用这个定制的方法,定义的组三层化验杰出的性能和分析特征的程度。参与者还详细信息,作者需要提供在他们的手稿让评论家和读者能清楚地理解程序执行和评估的可靠性肽或蛋白质定量测量报告(138年]。

5.3。分析物浓缩MRM-MS化验的敏感性增加

许多分析物需要浓缩等MRM-based量化内生水平的大多数蛋白质在等离子体,监管和信号蛋白在细胞和组织,和铝。许多临床相关的生物标记物,如前列腺特异性抗原(PSA)和肌钙蛋白(Tns)表达在低ng / mL水平等离子QQQ-MS低于检测下限。有报道称改善敏感性的丰富蛋白质消耗策略结合最小分离或仪器修改这可能会进一步提高MRM LOD /定量限的测量。例如,基于抗体耗竭列结合最小分离胰蛋白酶的肽已被证明提高蛋白质在等离子体的敏感度131年,139年,140年]。此外,增强灵敏度为SRM-MS目标蛋白质组学通过增强的离子传输效率使用电动双阶段离子漏斗接口报道(141年]。另一方面,福丁等人使用MRM立方(MRM)³),使目标蛋白质生物标记物在低毫微克/毫升范围nondepleted人类血清使用一个简单的两步工作流程。这种策略利用的能力混合QQQ-MS /线性(点燃)质谱产品进一步碎片离子监测在第三季度142年]。

5.4。棱镜

棱镜,最近报道了史等。143年),是一个antibody-free策略,包括高压、高分辨率分色加上聪明的选择和多路复用(棱镜)敏感的选择反应监测- (SRM)建立量化目标蛋白质。策略使用高分辨率的反相液相色谱测定分析物富集分离、智能的目标分数选择通过网上SRM监控的内部标准,和分数多路复用nanoliquid chromatography-SRM量化(143年]。这种方法显示的主要推进目标蛋白质的敏感性量化不需要specific-affinity试剂。将这种方法应用于人血浆/血清证明准确和可再生的量化的蛋白质在50 - 100 pg / mL的浓度范围。优秀PRISM-SRM之间的相关性分析与临床免疫测定前列腺特异性抗原水平还指出[143年]。相对的缺点PRISM-SRM SISCAPA(见部分5。7)降低分析吞吐量的分馏。然而,即使有限的部分连接,温和的吞吐量(~ 50个样本分析每周根据实验细节)。例如,当量化(即相对大量的蛋白质。,100),96分数可能包含目标肽;然而,这些分数仍然可以仔细结合到12多路复用分数基于肽洗脱时间实现温和的吞吐量(143年]。

5.5。平行反应监控(人口、难民和移民事务局)

人口、难民和移民事务局是一个新的目标集中在蛋白质组学范式的使用下一代,quadrupole-equipped高分辨率和准确的质量工具(144年]。人口、难民和移民事务局、由问Exactive SRM化验的艰苦的发展可能是可以避免的。此工具类似于回调,除了第三四极被替换为一个高分辨率,高质量准确性Orbitrap质量分析器。而在SRM所有转换都是监测一次,问Exactive允许并行检测过渡的一个分析。因为所有转换可以与人口、难民和移民事务局监控,一个不需要进行艰苦的优化为选定的转换生成理想化的化验(145年]。这将带来额外的特异性,因为所有的潜在产品离子肽,而不是3 - 5转换,可以确认的身份肽(146年,因为人口、难民和移民事务局监控所有转换,一个不需要先验知识,或预选,目标转换之前的分析。还因为许多离子将是可用的,在一个完整的质谱干扰离子的存在有问题的整体光谱质量会低于干涉一个狭窄的质量范围(144年]。此外,问Exactive仪器非常灵活。自一个仪器可以做两个发现和有针对性的分析,这将允许研究人员使用一个基于探索方法确定有趣的蛋白质的名单,然后使用有针对性的方法遵循这些目标与高灵敏度在各种条件下,所有在一个实验中(145年]。

5.6。片收购

片(顺序窗口收购所有理论质谱)收购是一种新型的技术,是基于data-independent收购(DIA)旨在补充传统的发现MS-based蛋白质组学技术和SRM方法(147年]。在这一战略系统的查询示例集是为感兴趣的任何蛋白质的存在和数量。它包括使用碎片离子谱库中的信息我完整的碎片离子生成地图使用data-independent采集方法。片收购,第一个四极顺序循环25 Da前体隔离windows(大片)感兴趣的质量范围和time-resolves碎片离子谱的分析物检测(147年,148年),因此可能并发执行SRM-like实验的一个重要更多。在SWATH-MS方法中,仪器扫描的速度必须足够快允许获得足够数量的数据点在典型的色谱峰,离子色谱可以重建可接受的信噪比。片收购,然而,有一个很大的缺点,不兼容的数据与传统数据库搜索,它似乎是一个反褶积算法来处理SWATH-MS数据库搜索的数据没有被实现。有很多的挑战在设计反褶积算法来处理这些复杂的数据(148年]。

5.7。捕获蛋白质浓缩

另一种方法immunoaffinity损耗(负浓缩)和分离策略是积极的浓缩策略也进行了广泛的探讨在蛋白质组学更好的检测low-abundance肽或蛋白质。这些策略包括亲和多肽或蛋白质的浓缩和化学浓缩等不同的蛋白质组的子集包括多功能天车N-linked糖肤,此处则。许多的浓缩策略报告一般蛋白质组学也适用于SRM的应用程序。

Immunoaffinity捕获目标蛋白质可能是最有效的方法为敏感检测low-abundance蛋白质在复杂样品(149年,150年]。immunoaffinity浓缩方法加上女士提供了量化的蛋白质低ng / mL范围(151年- - - - - -153年]。考et al。151年)展示了immunoaffinity-SRM蛋白质生物标记物的量化方法,ELISA检测不可以从肺癌患者通过使用抗体丰富蛋白质,其次是消化的蛋白质和随后的SRM分析捕获。这种方法使多个蛋白质生物标记物的量化在肺癌和正常人血清低ng / mL的范围。在不同的研究中,Kulasingam等人报道内生PSA的浓缩蛋白质从5μL单克隆抗体的血清(mAb)其次是产品使用一个线性离子阱质谱仪离子监测(152年展示量化的PSA下降到小于1 ng / mL与CVs可以接受的水平。最近,Niederkofler et al。154年)开发了一个分析,包含了一种新颖的样品制备方法分离IGF1结合蛋白。使用工作流还包括一个immunoaffinity一步antibody-derivatized吸管技巧,其次是洗脱,胰蛋白酶消化和质/女士签名肽的分离和检测SRM模式。免疫测定结果定量质谱(MSIA)表现出良好的线性范围1到1500 ng / mL IGF1,内部和CVs interassay精度小于10%,和最低的极限检测1 ng / mL (154年]。此外,完整的蛋白质目标样本,连同他们的重型isotope-labeled内部重组蛋白质的标准,如蛋白质标准绝对量化(PSAQ)方法(155年- - - - - -157年)可以与抗体蛋白水解作用之前和SID-MRM-MS免疫沉淀反应。2004年,尼尔森等人描述了immunoaffinity-based MALDI-TOF女士的量化方法IGF1从人血浆样品158年]。igf - 1的检测极限MSIA被评估,建立了大约15点。

蛋白质浓缩方法的一个重要的应用可能是突变蛋白的检测和测量。全基因组分析表明,实体肿瘤通常包含20 - 100蛋白质编码基因突变(159年]。这些变化的一小部分是“司机”致癌事件;其余的是“乘客”,但不提供选择性生长优势(160年]。这些蛋白质可能是独特的生物标志物的候选人的来源。与野生型蛋白生物标记只有肿瘤细胞产生的突变蛋白。此外,他们不仅仅是与肿瘤有关,但是司机的基因突变是肿瘤直接负责代(161年]。大量致病突变的错义突变,改变编码蛋白质只有巧妙,可以非常复杂的检测主要是因为很少有抗体,可以准确区分突变与正常版本的蛋白质。因为许多不同的突变可以发生在一个癌症相关的基因,有必要开发一个特定的抗体为每个可能的突变体抗原决定基可以是昂贵和费时的。另一种方法措施突变蛋白的活动但不是普遍适用的,因为没有作业分析可用于大多数蛋白质。女士一直以前用来检测和量化体细胞突变的DNA水平而不是在蛋白质水平(162年]。为了解决这个需要,Vogelstein实验室(161年女士)开发了一个方法,可以识别和量化不良突变蛋白在一个普遍适用的时尚。使用Ras基因及其突变体(大多数突变聚集在残留12或13的蛋白质),他们从人类免疫沉淀反应Ras蛋白结直肠癌细胞系SW480,然后筛选了集中。超过90%的k - ras基因细胞总蛋白被成功地从溶解产物和筛选了珠子。在消化和包容大isotope-labeled合成肽作为内部控制,SRM。父母的列表和产品离子被用于SRM包括那些代表使胰蛋白酶化正常(WT) Ras蛋白以及两个最常见的Ras突变体在胰腺癌,k - G12V G12D。总结峰值强度相对应的离子重型和轻型版本的代表WT和突变蛋白肽表明他们相关的线性丰富在超过两个数量级(10 - 2000 fmol;> 0.99 WT和突变的蛋白质)161年]。同样,他们发现突变Ras蛋白可以检测和量化等临床标本的结肠直肠癌和胰腺癌肿瘤组织以及胰腺囊肿癌变前的液体。除了回答基本问题的相对水平异常蛋白质在肿瘤的基因,这种方法可能是有用的诊断应用程序。该方法的一个潜在的局限性是它的灵敏度。Vogelstein结果报告估计,SRM能够可靠地用来检测突变蛋白质时存在水平低至25 fmol /毫克的总蛋白(~ 6000细胞)。然而,这种敏感性可能不足以检测突变蛋白在某些临床样本,如痰液、血清或尿液(161年]。如上所示,亲和力女士方法可以提高量化的敏感性low-abundance蛋白质或突变体,抗体的蛋白质捕获方法的主要缺点是通常不用于新发现的生物标志物的候选人。需要不同的抗体对个别蛋白质固有限制了多路复用能力和吞吐量的量化目标蛋白质的大量使用亲和力女士的方法。

5.8。肽捕获富集

另一种蛋白质浓缩是为使用anti-peptide目标多肽抗体亲和捕获,在目标肽作为蛋白量化的代理人。安德森et al。163年]介绍了这种方法在2004年使用固定化anti-peptide兔多克隆抗体捕获和,随后,洗提的目标肽四血浆蛋白随着isotope-labeled肽女士量化标准。这个策略,称为稳定同位素标准和捕获anti-peptide抗体(SISCAPA),和最近的研究表明,超过1000倍浓缩可以实现plasma-digested肽(164年低ng / mL)定量限在等离子体与CVs < 20%141年]。如果稳定isotope-labeled重组蛋白标准可用,它可以被添加到biofluid一开始分析工作流控制的蛋白水解效率。经biospecimens消化和添加已知数量的姐姐,激增和内源性肽都是特别丰富和它们的相对数量由MRM-MS量化。女士探测器提供了有针对性的通过峰面积定量m / z值。使用magnetic-bead-based SISCAPA策略进一步优化平台,可以执行的自动化使用96孔板(164年,165年]。这一战略实施的nine-target肽多路复用SISCAPA试验更敏感的检测在50 - 100 pg / mL的蛋白质浓度范围被报道在等离子体体积增加到10μL为SISCAPA浓缩(1毫升166年]。

马伯的一个优点在SISCAPA化验是他们更高的特异性多克隆抗体,因此Schoenherr等人表明,mab可以配置在SISCAPA化验和报告平台自动筛选马伯[167年]。在另一个最近的报告,MALDI immunoscreening (MiSCREEN)开发,使快速筛选高亲和力和选择anti-peptide马伯[168年]。在其他的研究中immuno-MALDI (iMALDI)使用affinity-bound肽谱上利用MALDI基质溶剂洗提绑定肽从珠子和合成肽的峰高或峰面积的MS谱用于定量(169年,170年]。虽然iMALDI可以执行只有MALDI-MS工具,它也可以用于MRM MALDI-MS / MS仪器(iMALDI模式⁺)[171年]。

尽管灵敏度、多路复用和吞吐量,一些限制的SISCAPA包括成本相对较高的Ab一代;很长的时间(试验一代~ 24周)SRM试验开发(172年];成功率生产的抗体以及潜在低肽捕获率(166年];和背景的非特异性结合珠。

SISCAPA策略也已经部署在临床SISCAPA-SRM化验的潜力在哪里说明了Hoofnagle et al .,谁实现SISCAPA化验low-abundance血清甲状腺球蛋白的量化,同时测量载脂蛋白-ⅰ和载脂蛋白B [133年,173年]。

弗雷德哈钦森癌症研究中心的合作,Bio-Rad实验室开发了一种SISCAPA培训/ QC工具目前在测试。这个工具包允许研究人员新SISCAPA技术实现一个试验在实验室和积累经验的过程。基于试验小鼠骨桥蛋白(OPN)肽在人血浆矩阵,工具为研究者提供了所需的试剂和信息进行分析,包括详细的标准操作程序,抗体,重型和轻型肽,磁珠,和其他必要的缓冲和试剂。结果将与预期值,使装备一种宝贵的资源SISCAPA过程的质量控制。

5.9。MRM引用库

参考光谱分裂proteotypic肽库和色谱保留时间将是非常有用的一代最大的产品离子信号和MRM-MS测定的蛋白质组学社区发展。天际线(174年]和mrm [175年)是两个开源软件开发MRM-MS-based蛋白质组学分析的社区。天际线(可下载https://brendanx-uw1.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view)可以与所有主要仪器集成平台和被用来设计MRM-MS化验和支持数据分析包括SIS。天际线支持所有主要的公开可用的光谱库流量等,国家标准和技术研究院(NIST)和系统生物学研究所。从这些来源库文件可以下载和搜索天空光谱库浏览器,帮助肽前体和产品选择离子监测特定感兴趣的蛋白质(174年]。mrm开发组织高度复杂MRM-MS实验,包括使用重/轻同位素肽对定量分析,并以独立于平台的mzXML格式导入数据的能力。mrm提取并推断precursor-product离子过渡配对,计算综合离子强度,并允许快速视觉管理分析超过1000 precursor-product双(175年]。

自动化和有针对性的分析与定量SRM (ATAQS) [176年)是另一个开放源码软件支持MRM试验开发(http://tools.proteomecenter.org/ATAQS/ATAQS.html)。ATAQS是一个集成的软件平台,它支持的所有阶段目标,SRM-based蛋白质组学实验包括目标选择、过渡优化和postacquisition数据分析。这个软件有可能显著促进有针对性的蛋白质组学技术的使用,为高度敏感的一代,可再生的,和完整的数据集,尤其关键的发现和验证假说驱动的系统生物学研究的目标。ATAQS还提供软件API(应用程序接口)文档,允许添加新的算法每个工作流步骤(176年]。mProphet是另一个完全自动化的系统,计算准确的识别错误率靶向肽在SRM数据集和相关特性相结合的特异性和灵敏度最大化数据到一个统计模型(177年]。

目标蛋白质组分析的另一个重要来源是SRMAtlas,使蛋白质的检测和量化复杂蛋白质组(http://www.mrmatlas.org/)[178年]。这个数据库中的信息结果MRM-MS测量天然和合成肽QQQ-MS执行。目前,这个数据库允许用户查询转换从肽酵母,人类,和鼠标物种从QQQ-MS仪器,补充了离子阱(IT)观察和预测调谱在哪里不可用。算法称为自动检测的不准确和不精确的转换(审计)已经被开发出来,它可以协助MRM通过自动识别不准确的转换数据基于观察干扰信号或不一致的复苏复制(179年]。该算法评估MRM-MS数据进行比较的相对产品离子强度分析物肽的SIS肽,其次是一个t以及确定任何显著差异。算法已经证明了识别问题转换的能力,达到94 - 100%的精度正确识别错误的转换(179年]。

5.10。分析门户社区资源

虽然许多MRM-based化验已经出版,信息是分散在整个文学,和协议特性的试验性能尚未标准化。此外使用MRM及其潜在效用没有意识到生物和临床研究社区。为了解决这些问题,临床肿瘤蛋白质组学分析财团(NCI CPTAC 2)推出了一个试验门户作为一种公共资源特征量化质量spectrometry-based蛋白质组学分析与相关的标准作业程式,试剂,试验验证数据(http://assays.cancer.gov/)。门户数据库与全景,一个开源的平台允许有效的收集和共享的数据在一个与供应商无关的格式。安抚描述样本准备为每个试验也可以下载。数据质量是一个门户的主要重点。MRM化验“击中”验证指南中也建立了NCI-funded CPTAC 2,与从外部输入社会通过车间(征求138年]。以确保统一的表示和足够的数据建立的接受性能分析,指导文档描述所需的最小特征数据分析纳入CPTAC分析门户已经可供下载的门户。5试验的试验验证。实验1和2包含信息分析灵敏度和线性范围(通过响应曲线)和可重复性(由分析验证样本在多个天)和最小验证要求要符合纳入CPTAC分析门户。更高层次的验证包含额外的实验测量选择性、稳定性和内源性分析物的检测。发射时,门户包含~ 462与表征数据化验和安抚。CPTAC程序将加多几百化验未来2 - 3年,而且,在不久的将来,门户将是开放为社区的贡献。门户可以接受任何目标的数据质量spectrometry-based量化方法。

6。蛋白质组学再现性和标准化

电阻对蛋白质组学分析的有效性持续几年在90年代末和2000年代初。这部分源于一些可疑的开创性工作多年的大规模蛋白质鉴定。许多早期的里程碑式的论文在过去的10 - 15年获得在低分辨率的仪器和没有适当的统计分析44]。后来发现,大部分的识别获得这样的研究是假阳性180年]。许多早期的问题归因于使用SELDI贫困与重要的再现性分析技术所产生的问题。一些高调的论文后来被证明是无效的,这污染的整个领域。例如早期卵巢癌诊断的方法是由一批优秀的调查人员,用质谱检测蛋白质组学模式从2002年的血清样本。大约100%报告的敏感性和特异性,即使对于从早期卵巢癌患者血清181年]。本文得到了几千以来引用出版物(182年]。质量调查人员的组合,高调日报发表的数据,和一个强大的编辑生成的广泛的媒体报道和兴奋,在癌症诊断新时代已经开始。然而,该方法的方法论的缺陷报告和问题对其有效性发表(出版后不久183年- - - - - -185年]。随后,其他已经确定了生物信息学的工件和变化在样本收集和存储方面的问题损害了论文的结论(184年]。尽管积极的出版物,类似的方法用于其他癌症类型(186年,187年),一个独立的验证研究,这对前列腺癌的诊断方法,由早期检测的研究网络,已经表明,方法不可靠地检测前列腺癌(188年]。

再现性的问题进一步加剧了当Bergeron莫和他的同事在2009年发表的一项研究(189年]。研究人员把标准化样本包含20已知蛋白质27实验室进行蛋白质组学分析。每个蛋白质包含一个或多个独特的胰蛋白酶的肽,它应该出现在MS分析。只有7的27实验室最初报道所有20蛋白质正确,且只有一个看到proteotypic肽。然而原始数据的集中分析显示,所有20个蛋白质和肽的大多数被发现在所有27个实验室。本研究的消息是,无论仪器方法,女士技术提供高质量的数据。相比之下,集中分析确定错过了标识(假阴性),环境污染,数据库匹配和内容管理的蛋白质识别来源的问题。一个建议是提高搜索引擎和数据库所需质量spectrometry-based蛋白质组学(189年]。

在另一项研究中,蛋白质组学研究小组协会的生物分子资源设施(ABRF)赞助的研究旨在使参与者尝试新技术和评估他们的能力相对于其他实验室样品分析相同。本研究旨在探讨使用不同的方法来确定几个目标蛋白质的定量差异集中在人血浆准备。这些结果提供一个剖视图的当前方法以及共享信息的工具对蛋白质组学实验协议和教育社区,强调建立良好实验室规范(很重要190年]。ABRF努力评估个人实验室的平台,方法和结果是第一个试图解决可变性在样品制备和处理不同的蛋白质组学平台。

应对许多关键的挑战在蛋白质组学包括缺乏能够准确和可重复的测量有意义的蛋白质数量biospecimens在实验室、美国国家癌症研究所(NCI)推出了临床蛋白质组学技术对癌症(CPTC) 2006年(http://proteomics.cancer.gov/)。CPTC的总体目标是专注于消除的几个主要障碍在蛋白质组学研究,以便准确、高效和可再生的有意义的数字的识别和量化的蛋白质,高价值的蛋白质定量和资格的研究。实现这一目标将提供一个坚实的基础为蛋白质组学领域的发现,使临床生物标志物来满足各种需求的合理开发在抗癌药物开发中,诊断和临床管理。CPTC花了一个多学科、多方法通过其CPTAC 1网络在解决长期存在的问题,在蛋白质组学变化问题导致大型测量噪音分析平台而不是评估真正的生理差异。CPTAC 1进行的第一个定量评估发现的蛋白质组学技术平台在实验室定义一组性能标准确定的可变性来源(191年- - - - - -193年),开发了一个标准酵母蛋白质组参考资料提供给调查人员的社区通过NIST基准的性能(191年,194年质量控制,开发了一个工具来监测和诊断仪器性能(http://peptide.nist.gov/software/nist_msqc_pipeline/NIST_MSQC_Pipeline.html)。酵母蛋白提取物(RM8323)主持下由NIST NCI的CPTC计划目前正在向公众开放(https://www-s.nist.gov/srmors/view_detail.cfm?srm=8323),为研究人员提供了一个独特的生物参考材料。RM8323是最广泛的特点与几个相关的复杂生物蛋白质组和唯一一个大规模研究蛋白质丰度估计在一个宽的浓度范围。酵母蛋白的提取及其相关参考数据集(191年,194年)可以使用基准测试仪器探测效率的研究社区复杂生物蛋白质组的分析,改进现有方法和评估新平台的开发。

再现性的解决问题有针对性的蛋白质组学,CPTAC 1还牵头组成的多机构研究三个substudies旨在提高水平的复杂性在样品制备八个人网站(135年]。在所有三个substudies Intralaboratory可变性和再现性进行评估通过比较测量浓度的七个目标蛋白质(人类c反应蛋白、PSA、抑肽酶,瘦素,肌红蛋白,髓磷脂碱性蛋白,和过氧化物酶)的实际浓度范围的剧增的分析物(共9个浓度点和定量限2.92 nM,也就是说,c反应蛋白73.3 ng / mL),通过确定的CVs定量测量。结果表明,这些定量测量的重复性和精度九十肽在8个实验室测试范围从4到14%,4 - 13%,和10多个实验室的CVs达到或接近23%的估计定量限为2.92纳米的研究我,II, III,分别。Intralaboratory CVs通常是< 15%,< 25%相同浓度的研究I, II, III。CVs增量的增加表明,样品处理对测定可变性比工具性的变化。机器人的自动化样品处理可以进一步提高分析差异性。最近,CPTAC 1团队开发了一个系统适用性协议(SSP),采用简化的六个蛋白质的混合物,以促进绩效评估LC-SID-MRM-MS仪器平台,配置了nanoflow-LC系统界面上的三重四极质谱仪(195年]。SSP是设计用于低多路分析以及高多路复用的方法当其中调度数据采集是必需的。性能评估监测指标包括一系列色谱和质谱峰宽度、色谱分辨率、峰容量和峰面积的变化,分析物保留时间(RT)的稳定性。SSP,评估在11个实验室共有15种不同的乐器,使早期诊断的LC和异常女士表示LC-MRM-MS性能不佳。健壮的LC-SID-MRM-MS-based化验,可以被复制在实验室和最终在临床实验室设置需要标准化的协议证明分析平台充分表现,因此使用SSP有助于确保分析物量化测量可以被复制和良好的精度内和跨多个实验室和应该促进更广泛使用MRM-MS技术的基础生物医学和临床实验室研究社区。

7所示。间隙MS-Based平台供临床使用

正如前面显示一个典型的蛋白生物标志物发现管道有三个阶段:发现、验证、和临床验证。发现工作中经常使用research-grade动力不足的人群样本有限的样本数量。有前途的候选人从发现阶段验证通过分析他们的表现在中型临床组()使用标准化的分析平台。化验然后开发验证表现最佳候选人在较大的临床组()。最终,该实用程序的验证候选常规临床使用证明在临床设置(改善金标准诊断、成本、临床结果,等等)(196年]。生物标志物的临床实践的路径发展可以采取许多可能的步骤。然而,它是明确的,临床使用之前,任何生物标记必须证明其安全性和有效性在独立的临床试验使用一个适当的研究人群明确的用途。三个问题中的关键环节路径发现候选人实际临床诊断包括代足够的和便携式的证据初步验证研究;定义临床效用得到监管部门的批准;并选择/发展中化验分析性能适用于临床部署197年]。

虽然蛋白质组学方法可能尚未准备好实现在常规临床化学实验室,目标是实现在不久的将来(20.]。目前,但是有的仪器广泛应用于临床实验室诊断先天性代谢缺陷或治疗药物监测和毒理学。MALDI-TOF-MS分析方法最近成功地实现在临床微生物实验室等简单的样品微生物群落微生物的识别,从而证明方法的有效性(20.]。BioMerieux最近宣布美国FDA批准VITEK女士,一个进化技术,减少微生物识别从天分钟(http://www.biomerieux-usa.com)。VITEK女士是第一个临床质谱MALDI-TOF-based系统可用在美国致病细菌和酵母的快速识别。VITEK女士准确性与16 s rrna基因测序,金本位,微生物种类的数量。的整体精度VITEK女士相比,这些生物的核酸测序为93.6%。

此外,力量公司最近宣布,它已获得美国FDA间隙下部分510 (k)在美国市场MALDI生物型CA系统识别的革兰氏阴性细菌菌落培养从人类标本(http://www.bruker.com/)。的谱生物型使分子识别和分类学分类或dereplication微生物如细菌,酵母,真菌。这是通过使用蛋白质组学高通量MALDI-TOF质谱指纹。的谱生物型使用特定蛋白质指纹细菌菌株。然而,代表了人类蛋白质分析的复杂程度在药物或细菌蛋白质,从而实施特定的约束。

另一个蛋白质组学测试,最近通过FDA OVA1。OVA1测试是一种在体外诊断多元指数测定(IVDMIA)评估卵巢癌风险的女性被诊断为卵巢肿瘤手术前计划。OVA1分析5蛋白质组生物标志物血清,结果通过一个算法相结合来产生一个单值指数清廉的范围内。OVA1提供额外的信息,以帮助确认病人转诊妇科肿瘤学家。multiple-center她们在一次前瞻性临床研究,添加OVA1术前临床评估发现改善敏感性预测卵巢肿瘤的恶性肿瘤。OVA1旨在评估术前卵巢癌的风险由于疑似卵巢癌女性安排手术。决策参考的测试结果艾滋病病人妇科肿瘤手术更好的长期的结果(197年]。

让科学界有了正确的工具和作为一个预览的监管思维和方向多元蛋白质化验,NCI的CPTAC 1提交2蛋白质多元分析描述的办公室在体外诊断设备评估和FDA的安全。目的是评价分析的测量标准和研究需要验证蛋白质多元分析。每个提交描述不同的蛋白质平台:一个多路复用immunoaffinity蛋白质质谱平台量化和免疫数组平台量化糖蛋白亚型。提交提供了一种互利为蛋白质组学和管理社区的成员识别领域的分析问题应该解决在开发蛋白质多元临床化验。这些提交的目的是演示过程和赞助商之间的相互作用和FDA时尚通常类似于他们将如何进行。此外,美国食品和药物管理局提供的反馈产生一些洞察审查问题相关的这些类型的测试。因为2模拟的赞助商提交没有提交完整的反应和适当的数据,因为他们提交的假设的数据在很大程度上,许多问题和问题没有提到和讨论。由于这些原因,本文并不是要包容任何未来的所有要求提交,将美国食品和药物管理局(198年]。

推动适应临床化学蛋白质组学的重要工作流程和仪器的发展是必要的在各种蛋白质组学方法可以与蛋白质分析进行高通量immunoanalyzers。最好的机会短期应用蛋白质组学方法在临床化学实验室很可能利用蛋白质组学分析的特定方面,如针对新型生物标记物(199年,200年和孤儿提供新的诊断解决方案的临床问题(201年]。在这种背景下,SRM似乎作为潜在的替代经典分析相结合分析特异性和可靠的量化描述。SRM在古典分析方法的优点之一是应用多个蛋白质测试的可能性在一个仪器不依赖商业试剂。SRM因此可以提供机会测量生物标记物在特定临床领域,并不代表对诊断行业的大市场。它也可能是一种减少试剂成本如抗体由临床实验室承担。因此,开发可靠的SRM化验的项目大量的人类蛋白质显然是极大的兴趣(202年]。它可以促进更广泛的参与这项技术,反过来,大大促进应用临床研究和增加使用在临床化学实验室。

8。Proteogenomics

Proteogenomics,蛋白质组学和基因组数据的集成,最近已成为一个重要的蛋白质组学作为一个有前途的潜在的组学研究方法。这个概念是基于这样一个前提:蛋白质数据可以阐明各种基因特性的结果,允许研究人员确定,例如,是否一个特定的基因变异可能会成为一个功能的蛋白质。独立或作为大规模行动的一部分,许多研究人员正在寻求这样的研究包括CPTAC 2, TCGA,国家人类基因组研究所的百科全书的DNA元素财团(编码)。在很大程度上,这种激增活动proteogenomics研究源于蛋白质组学中进步使其可行的获得覆盖与通过基因组学和转录组。要求良好的系统生物学的研究是蛋白质组学的需要有足够好的报道。在过去的几年里,获得10000年的范围覆盖12000蛋白已成为一些常规实验室(203年,204年]。在他们最近的工作,例如,Lehtio和他的同事发现了13078人和10637小鼠蛋白质包括39941肽不是以前在肽图谱的人体数据集。他们还发现了224年的小说《人类和122年的小说《老鼠肽,分别映射到164和101个基因位点(205年]。使用高分辨率的等电点聚焦(HiRIEF)肽水平的pH值在3.7 - -5.0范围和准确肽等电点(pI)预测,Lehtio six-reading-frame翻译的探索人类和小鼠基因组,发现98和52先前未被发现的蛋白质编码基因座,分别是(205年]。

在另一项研究中,到底和他的同事们已经完成了proteogenomics研究大鼠肝组织,整合全基因组测序,RNA-seq,质量spec-based蛋白质组学(206年]。在这项研究中研究人员发现13088个蛋白质,使其成为迄今为止最全面的蛋白质组分析的执行。整合他们的基因组数据,他们也能够验证1195个基因预测,83剪接事件,120蛋白质产生的变异,和20蛋白亚型与产生RNA编辑。努力也提供了一些生物的见解如RNA编辑过程的问题,修改后是由RNA分子的序列生成。同时表明,RNA编辑可能发生,他们可能不会经常导致一个稳定的蛋白质(206年]。加强质量规范序列覆盖率以及强大的数据分析管道可能会进一步改善我们的检测蛋白变体。

利用大规模癌症基因组数据集,NCI是利用其投资在基因组学通过CPTAC 2,应用蛋白质组学技术系统地识别蛋白质的基因特征的肿瘤,如TCGA的计划。CPTAC 2项目的目标是阐明复杂proteogenomic基因组DNA, RNA和蛋白质组之间的关系(蛋白质)异常,从而产生癌症生物学的深入了解。CPTAC 2程序分析超过300样本直肠癌,乳腺癌和卵巢癌。该财团的一个关键组件是开发新颖的方法来整合和可视化蛋白质组和基因组数据更好地理解细胞的生物学过程。tb的基因组和蛋白质组数据的集成是催化新计算工具的开发和利用研究结果从机器学习和计算机科学等其他领域,以更好地了解生物过程。这种分析后,选择感兴趣的蛋白质作为高度可再生的和便携式检测的目标。所有的数据和化验结果公开帮助推动癌症生物学研究和改善病人护理。第一组proteogenomic数据2013年9月被释放(http://proteomics.cancer.gov/)。

现在科技进步在蛋白质组学和基因组学提供的能力区分基因和转录后的多态性在蛋白质组水平。协同使用基因组、转录组和蛋白质组学技术显著提高了数据,可以从蛋白质组学和基因组学得到的努力。通过匹配深MS-based蛋白质组学从sample-specific个性化数据库建立基因组和转录组,成千上万的肽,否则逃避识别可以被识别。这样强大的工具和数据展示的力量,需要综合proteogenomic分析对于理解基因控制的分子动力学和表型多样性以系统的方式,似乎是未来发展方向(206年]。

9。结束语

生物知识的加速度计的映射导致开发新的高通量下一代测序(上天)技术。门店分析等全基因组测序(WGS)和总RNA序列(RNA-seq)不能然而预测高信心对蛋白质的影响及其变化包括组成、功能和表达水平。因此,完成计画也提出新的挑战的人类蛋白质组使用MS-based蛋白质组学特征。这些技术能够全面的测量基因产物在系统级别(207年,208年]。尽管女士和门店互补性强,他们还没有有效地集成在大规模研究[209年和稀疏在生物体基因组较小的执行210年]。正确描述基因组和转录组变化的分子过程的影响和细胞功能,综合分析不同的数据类型,理想情况下来自相同的样品,需要(211年]。蛋白质组学和基因组数据的集成和审讯将提供潜在生物标志物的候选人将被优先考虑对下游目标蛋白质组学分析。这些生物标记目标将用于创建多路复用,定量分析验证和预先筛分测试目标的相关性临床相关的和公正的样本。这种方法的结果将为社区提供验证生物标志物可用于临床资格研究;高质量和公共可访问数据集的;和分析验证、多路复用、定量蛋白质/肽及其相关高质量分析试剂的研究和临床社区。

女士最先进的方法通常能识别超过10000蛋白质在一个实验中(203年,204年)这意味着完整的蛋白质组的分析是触手可及212年]。然而仍然面临的挑战包括全面的人类蛋白质组计划非常大量的蛋白质与天车,突变,拼接变异,各种各样的技术平台,在探测灵敏度的限制在低丰度蛋白质和畸变。蛋白质组学事业未来应继续支持技术开发、优化和标准化。将最新的和有效的技术是至关重要的成功推进翻译蛋白质组研究结果为临床相关的生物标志物。biospecimen的同时,严格评估和通过质量评估数据质量标准在每一步的生物标记发展管道应该继续支持。这些努力,加上持续的合作与监管机构和临床化学家,将加快个性化的病人护理通过临床蛋白质组学的发展。

缩写

SRM-MS:	选择反应monitoring-MS
MRM-MS:	多个反应monitoring-MS
TCGA:	癌症基因组图谱
CPTC:	临床蛋白质组学技术对癌症
CPTAC 1:	临床蛋白质组学技术评估癌症
CPTAC 2:	临床肿瘤蛋白质组学分析的财团
铝:	转译后的修改
ESI-LC-MS:	电喷射ionization-liquid色谱串联质谱法
MALDI-TOF:	基质辅助激光解吸电离飞行时间
SELDI-TOF:	表面增强激光解吸电离飞行时间
MALDI-MSI:	谱技术成像女士
二:	二维凝胶电泳
LCM-MS:	激光捕获microdissection-MS
SILAC:	在细胞培养中稳定同位素标记的氨基酸
SISCAPA:	稳定同位素标准和捕获anti-peptide抗体
PSAQ:	蛋白质标准绝对量化
席德:	稳定同位素稀释
姐姐:	稳定isotope-labelled内部标准
QQQ-MS:	三重四极质谱仪
计画:	人类基因组计划
食品药品监督管理局:	食品和药物管理局
人口、难民和移民事务局:	平行反应监测。

免责声明

本文的观点是员工的,并不代表美国国立卫生研究院。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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